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13.6G : Agents antisens - Biologie

13.6G : Agents antisens - Biologie


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Objectifs d'apprentissage

  • Discuter du mécanisme des agents antisens et des avantages et inconvénients de la thérapie antisens.

Les agents antisens sont de courtes séquences synthétiques monocaténaires de bases d'ADN conçues pour s'hybrider à des séquences spécifiques d'ARN messager (ARNm) formant un duplex. Ce couplage ADN-ARN attire une nucléase endogène, la RNase H, qui détruit l'ARN lié et libère l'ADN antisens pour qu'il se réhybride avec une autre copie de l'ARNm. De cette manière, l'effet est non seulement hautement spécifique mais prolongé en raison du recyclage de la séquence d'ADN antisens. Lorsque cet agent se lie à l'ADN pathogène ou à l'ARN messager, la biosynthèse des protéines cibles est perturbée. Par conséquent, il existe au moins deux façons dont les agents antisens agissent pour réduire efficacement la quantité de protéine pathogène synthétisée - la dégradation de l'ARN basée sur la RNase H et la prévention de l'assemblage et de la traduction ribosomiques. Cette approche a un grand avantage. Il empêche la production d'une protéine pathogène, plutôt que d'essayer de la neutraliser sélectivement une fois qu'elle est fabriquée.

Les agents antisens peuvent être spécifiquement ciblés sur les gènes qui contrôlent l'expression des mécanismes de résistance aux antibiotiques, restaurant ainsi potentiellement un phénotype sensible aux antibiotiques dans la cellule. Un facteur limitant dans leur application potentielle en tant qu'agents thérapeutiques pour les infections bactériennes est leur faible absorption par les cellules bactériennes. Ces agents ont été développés avec succès pour le traitement d'infections virales telles que le cytomégalovirus, l'hépatite C et les infections à VIH. L'avantage de la thérapie antisens est qu'ils peuvent être fabriqués assez rapidement, qu'ils produisent un effet clinique durable et qu'ils sont très spécifiques à la cible. Les agents antisens présentent également une efficacité dans des applications cliniques plus larges telles que le traitement du cancer.

Points clés

  • Les agents antisens ont de larges applications dans plusieurs maladies. Leur utilisation pour le traitement des infections microbiennes est prometteuse.
  • Ce sont des oligonucléotides synthétiques qui peuvent être fabriqués rapidement et leur effet biologique est durable.
  • Leur utilisation pour le traitement des infections bactériennes résistantes aux antibiotiques est possible mais limitée par leur faible captation par la cellule bactérienne. Des études sont en cours pour améliorer leur pénétration dans la cellule.

Mots clés

  • ARN messager: ARN qui code et transporte les informations de l'ADN pendant la transcription vers les sites de synthèse des protéines pour subir une traduction afin de produire une protéine
  • nucléase: N'importe laquelle de plusieurs enzymes capables de cliver les liaisons phosphodiester entre les sous-unités nucléotidiques des acides nucléiques.
  • hybrider: Combiner des sous-unités complémentaires de plusieurs macromolécules biologiques.

Les ARN antisens naturels en tant qu'éléments régulateurs de l'ARNm chez les bactéries : une revue sur la fonction et les applications

Les ARN antisens naturels sont de petits transcrits diffusibles et non traduits qui s'apparient à des ARN cibles dans des régions spécifiques de complémentarité pour contrôler leur fonction biologique en régulant l'expression des gènes au niveau post-transcriptionnel. Cette revue se concentre sur les cas connus de contrôle de l'ARN antisens chez les procaryotes et donne un aperçu de certains mécanismes naturels basés sur l'ARN que les bactéries utilisent pour moduler l'expression des gènes, tels que les capteurs d'ARNm, les riboswitches et les ARN antisens. Nous soulignons également les progrès récents de la technologie basée sur l'ARN. La revue montre que les études sur les systèmes naturels et synthétiques sont réciproquement bénéfiques.


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Étiquetage d'ADN à amorçage aléatoire DIG

La méthode de marquage d'ADN "à amorçage aléatoire" est basée sur l'hybridation d'un mélange de tous les hexanucléotides possibles à la matrice d'ADN. Toutes les combinaisons de séquences sont représentées dans le mélange d'amorces hexanucléotidiques, ce qui conduit à la liaison de l'amorce à l'ADN matrice de manière statistique. Ainsi, un degré égal de marquage sur toute la longueur de l'ADN matrice est garanti. Le brin complémentaire est synthétisé à partir des terminaisons 3' OH de l'amorce hexanucléotidique aléatoire en utilisant l'enzyme de Klenow, de qualité de marquage. Les désoxyribonucléoside triphosphates modifiés ([32P]-, [35S]-, [3H]-, [125I]-, digoxigénine ou biotine marqués) présents dans la réaction sont incorporés dans le brin d'ADN complémentaire nouvellement synthétisé.

Ces sondes marquées sont particulièrement adaptées à la détection de gènes à copie unique sur les Southern blots génomiques, le criblage de bibliothèques recombinantes, les dot/slot blots et les Northern blots. Puisque chaque amorce a une séquence de six bases différente, le produit de sonde marqué sera une collection de fragments de longueur variable. Ainsi, la sonde marquée apparaîtra comme un frottis, plutôt que comme une bande unique sur un gel. La distribution de taille de la sonde marquée dépend de la longueur de la matrice d'origine.

Principe de réaction

Dans le marquage aléatoire amorcé, l'enzyme de Klenow copie la matrice d'ADN en présence d'amorces hexamères et de DIG-11-dUTP alcalilabile. En moyenne, l'enzyme insère un fragment DIG dans chaque tronçon de 20 à 25 nucléotides. Le produit marqué résultant est une sonde d'hybridation sensible, marquée de manière homogène, capable de détecter aussi peu que 0,10 à 0,03 pg d'ADN cible.


Les médicaments antisens ont un sens pour les maladies neurologiques

La base génétique de la plupart des maladies neurodégénératives héréditaires a été identifiée, mais il existe peu de thérapies modificatrices de la maladie pour ces patients. Une nouvelle classe de médicaments, les oligonucléotides antisens (ASO), s'avère prometteuse en tant que plate-forme thérapeutique pour le traitement des maladies neurologiques. Les ASO sont conçus pour se lier aux ARN soit en favorisant la dégradation de l'ARN ciblé, soit en augmentant l'expression par épissage d'ARN. L'injection intrathécale dans le liquide céphalo-rachidien entraîne une large distribution de médicaments antisens et des effets à long terme. L'approbation de nusinersen en 2016 a démontré que des traitements efficaces pour les maladies neurodégénératives peuvent être identifiés et que les traitements non seulement ralentissent la progression de la maladie, mais améliorent également certains symptômes. Des médicaments antisens sont actuellement en cours de développement pour la sclérose latérale amyotrophique, la maladie de Huntington, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson et le syndrome d'Angelman, et plusieurs médicaments sont à un stade avancé de recherche pour d'autres maladies neurologiques. Cette revue met en évidence les progrès de la technologie antisens en tant que traitements potentiels des maladies neurologiques.


Informations sur l'article

Nucléases artificielles à base de PNA en tant qu'agents oligonucléotidiques antisens et anti-miARN

M. Gaglione, G. Milano, A. Chambéry, L. Moggio, A. Romanelli et A. Messere, Mol. BioSyst., 2011, 7, 2490 EST CE QUE JE: 10.1039/C1MB05131H

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Organismes Génétiquement Modifiés (OGM)

La modification transgénique, l'ajout d'ADN recombinant à une espèce, a conduit à l'expression de gènes souhaitables chez les plantes et les animaux.

Objectifs d'apprentissage

Décrire comment la recherche sur les plantes et les animaux transgéniques aide les humains.

Points clés à retenir

Points clés

  • Les animaux transgéniques sont ceux qui ont été modifiés pour exprimer l'ADN recombinant d'une autre espèce.
  • La manipulation de plantes transgéniques, celles qui ont reçu de l'ADN recombinant d'autres espèces, a conduit à la création d'espèces qui présentent une résistance aux maladies, une résistance aux herbicides et aux pesticides, une meilleure valeur nutritionnelle et une meilleure durée de conservation.
  • L'épaisseur de la paroi cellulaire d'une plante rend l'introduction artificielle d'ADN dans les cellules végétales beaucoup plus difficile que dans les cellules animales.

Mots clés

  • transgénique: de ou se rapportant à un organisme dont le génome a été modifié par l'ajout d'un gène d'une autre espèce génétiquement modifiée
  • organisme génétiquement modifié: organisme dont le matériel génétique a été altéré à l'aide de techniques de génie génétique

Animaux transgéniques

Bien que plusieurs protéines recombinantes utilisées en médecine soient produites avec succès dans des bactéries, certaines protéines nécessitent un hôte animal eucaryote pour un traitement approprié. Pour cette raison, les gènes souhaités sont clonés et exprimés chez les animaux, tels que les moutons, les chèvres, les poulets et les souris. Les animaux qui ont été modifiés pour exprimer l'ADN recombinant sont appelés animaux transgéniques. Plusieurs protéines humaines sont exprimées dans le lait de brebis et de chèvre transgéniques, tandis que d'autres sont exprimées dans les œufs de poules. Les souris ont été largement utilisées pour exprimer et étudier les effets des gènes recombinants et des mutations.

Plantes transgéniques

La manipulation de l'ADN des plantes (ou la création d'organismes génétiquement modifiés appelés OGM) a contribué à créer des traits souhaitables, tels que la résistance aux maladies, la résistance aux herbicides et aux pesticides, une meilleure valeur nutritionnelle et une meilleure durée de conservation. Les plantes sont la principale source de nourriture pour la population humaine. Les agriculteurs ont développé des moyens de sélectionner des variétés végétales présentant des caractéristiques souhaitables bien avant que les pratiques biotechnologiques modernes ne soient établies. Les plantes qui ont reçu de l'ADN recombinant d'autres espèces sont appelées plantes transgéniques. Étant donné que les gènes étrangers peuvent se propager à d'autres espèces dans l'environnement, des tests approfondis sont nécessaires pour assurer la stabilité écologique. Les aliments de base comme le maïs, les pommes de terre et les tomates ont été les premières plantes cultivées à être génétiquement modifiées.

Plantes transgéniques: Le maïs, une culture agricole importante utilisée pour créer des produits pour une variété d'industries, est souvent modifié par la biotechnologie végétale.

Transformation des plantes à l'aide Agrobacterium tumefaciens

Le transfert de gènes se produit naturellement entre les espèces dans les populations microbiennes. De nombreux virus qui causent des maladies humaines, telles que le cancer, agissent en incorporant leur ADN dans le génome humain. Chez les plantes, les tumeurs causées par la bactérie Agrobacterium tumefaciens se produisent par transfert d'ADN de la bactérie à la plante. Bien que les tumeurs ne tuent pas les plantes, elles rabougrissent les plantes, qui deviennent plus sensibles aux conditions environnementales difficiles. De nombreuses plantes, telles que les noix, les raisins, les noyers et les betteraves, sont affectées par A. tumefaciens. L'introduction artificielle d'ADN dans les cellules végétales est plus difficile que dans les cellules animales en raison de l'épaisseur de la paroi cellulaire végétale.

Les chercheurs ont utilisé le transfert naturel d'ADN de Agrobactérie à une plante hôte pour introduire des fragments d'ADN de leur choix dans des plantes hôtes. Dans la nature, les maladies A. tumefaciens possèdent un ensemble de plasmides, appelés plasmides Ti (plasmides inducteurs de tumeurs), qui contiennent des gènes pour la production de tumeurs chez les plantes. L'ADN du plasmide Ti s'intègre dans le génome de la cellule végétale infectée. Les chercheurs manipulent les plasmides Ti pour éliminer les gènes responsables des tumeurs et insérer le fragment d'ADN souhaité pour le transfert dans le génome de la plante. Les plasmides Ti portent des gènes de résistance aux antibiotiques pour faciliter la sélection et peuvent être propagés dans E. coli cellules aussi.

L'insecticide biologique Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis (Bt) est une bactérie qui produit des cristaux de protéines lors de la sporulation qui sont toxiques pour de nombreuses espèces d'insectes qui affectent les plantes. La toxine Bt doit être ingérée par les insectes pour que la toxine soit activée. Les insectes qui ont mangé la toxine Bt cessent de se nourrir des plantes en quelques heures. Une fois que la toxine est activée dans les intestins des insectes, la mort survient en quelques jours. La biotechnologie moderne a permis aux plantes de coder leur propre toxine cristalline Bt qui agit contre les insectes. Les gènes de la toxine cristalline ont été clonés à partir de Bt et introduits dans des plantes. La toxine Bt s'est avérée sans danger pour l'environnement, non toxique pour les humains et les autres mammifères, et son utilisation est approuvée par les agriculteurs biologiques en tant qu'insecticide naturel.

Tomate Flavr Savr

La première culture GM introduite sur le marché a été la tomate Flavr Savr, produite en 1994. La technologie d'ARN antisens a été utilisée pour ralentir le processus de ramollissement et de pourriture causés par les infections fongiques, ce qui a entraîné une augmentation de la durée de conservation des tomates GM. Une modification génétique supplémentaire a amélioré la saveur de cette tomate. La tomate Flavr Savr n'a pas réussi à rester sur le marché en raison de problèmes d'entretien et d'expédition de la récolte.

La Tomate Flavr Savr: Le physiologiste des plantes Athanasios Theologis avec des tomates qui contiennent le gène ACC synthase issu de la bio-ingénierie (la tomate Flavr Savr).


Applications antisens pour la lutte biologique

Bien que les approches antisens de Nature soient clairement impressionnantes, cet article de Perspectives se concentre sur les utilisations expérimentales des réactifs antisens (ASR) pour le contrôle des processus biologiques. Les ASR comprennent des oligonucléotides antisens (ASO) et leurs homologues catalytiquement actifs, des ribozymes et des DNAzymes, ainsi que de petits ARN interférents (siARN). Les ASO et les ribozymes/ADNzymes ciblent les molécules d'ARN sur la base de l'appariement de bases Watson-Crick d'une manière spécifique à la séquence. Les ASO entraînent généralement la destruction de l'ARN cible par des mécanismes médiés par la RNase-H, bien qu'ils puissent également bloquer stériquement la traduction, entraînant également une perte de production de protéines. Les ribozymes et les DNAzymes clivent les ARN cibles après appariement de bases via leurs bras flanquants antisens. Les siARN, qui contiennent à la fois des régions sens et antisens d'un ARN cible, peuvent médier la destruction de l'ARN cible via l'ARNi et le RISC, bien qu'ils puissent également fonctionner au niveau transcriptionnel. Un nombre considérable d'ASR (principalement des ASO) ont fait l'objet d'essais cliniques, bien que la plupart aient des antécédents relativement longs en phase I/II. Les résultats des essais cliniques sont étonnamment difficiles à trouver, bien que peu d'ASR semblent avoir encore établi une efficacité aux niveaux de phase III. L'évolution des ASR a inclus : (a) des modifications aux ASO pour les rendre résistants aux nucléases, avec des modifications analogues aux siRNA en cours de développement et (b) le développement de stratégies pour sélectionner des sites optimaux pour le ciblage. Peut-être que le plus grand obstacle aux thérapies efficaces avec les RSA est le « problème de livraison ». Divers véhicules liposomaux ont été utilisés pour l'administration systémique avec un certain succès, et des modifications récentes semblent améliorer l'administration systémique, au moins au foie. Diverses formulations de nanoparticules sont actuellement en cours de développement, ce qui pourrait également améliorer l'administration. À l'avenir, les applications topiques des ASR semblent avoir les meilleures chances de succès. En résumé, les modifications apportées aux ASR pour améliorer la stabilité, améliorer le ciblage et les améliorations incrémentielles des véhicules d'administration continuent de rendre les ASR attrayants en tant que thérapie moléculaire, mais leur progression vers le chevet du patient a été extrêmement lente. J. Cell. Biochimie. 98 : 14-35, 2006. © 2006 Wiley-Liss, Inc.


À médiation oligonucléotidique antisens MDM4 Le saut de l'exon 6 altère la croissance tumorale

1 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, VIB Centre de biologie des maladies, KU Leuven, Louvain, Belgique.

2 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Département de génétique humaine, KU Leuven, Louvain, Belgique.

3 Division de la génétique et de la thérapeutique du cancer, Laboratoire des méthyltransférases dans le développement et les maladies, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IMCB), A*STAR (Agence pour la science, la technologie et la recherche), Singapour.

4 Département de biochimie, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, Singapour.

5 Mouse Histopathology Core Facility, VIB Center for the Biology of Disease, KU Leuven, Louvain, Belgique.

6 Laboratoire de pathologie moléculaire avancée, IMCB, Singapour.

7 Département de pathologie, Hôpital général de Singapour, Singapour.

8 Gynaecologische Oncologie, UZ Leuven, Louvain, Belgique.

9 Centre d'oncologie gynécologique d'Amsterdam (CGOA), Antoni Van Leeuwenhoek – Institut néerlandais du cancer, Amsterdam, Pays-Bas.

10 Institut de technologie de Karlsruhe, Institut de toxicologie et de génétique, Karlsruhe, Allemagne.

11 Modèles murins du cancer humain, IMCB, Proteos, Singapour.

12 Département d'oncologie médicale, Centre national du cancer de Singapour, Singapour.

13 Laboratoires de recherche Lilly, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, États-Unis.

14 Laboratoire de recherche sur le mélanome, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Australie.

Adressez la correspondance à : Jean-Christophe Marine, Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Centre de biologie des maladies, VIB, Herestraat 49, bâtiment O&N4, box 602, 3000 Louvain, Belgique. Téléphone : 3216330368 E-mail : [email protected] Ou à : Ernesto Guccione, Division of Cancer Genetics and Therapeutics, Laboratory of Methyltransferases in Development and Disease, Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), 61 Biopolis Drive, Proteos, Singapour 138673. Téléphone : 6565869844 E-mail : [email protected]

Note d'auteur : Michael Dewaele, Tommaso Tabaglio, Karen Willekens et Marco Bezzi sont co-premiers auteurs et ont contribué à parts égales à ce travail. Jean-Christophe Marine et Ernesto Guccione sont co-auteurs principaux et ont contribué à parts égales à ce travail.

Trouvez des articles de Dewaele, M. dans : JCI | PubMed | Google Scholar

1 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, VIB Centre de biologie des maladies, KU Leuven, Louvain, Belgique.

2 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Département de génétique humaine, KU Leuven, Louvain, Belgique.

3 Division de la génétique et de la thérapeutique du cancer, Laboratoire des méthyltransférases dans le développement et les maladies, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IMCB), A*STAR (Agence pour la science, la technologie et la recherche), Singapour.

4 Département de biochimie, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, Singapour.

5 Mouse Histopathology Core Facility, VIB Center for the Biology of Disease, KU Leuven, Louvain, Belgique.

6 Laboratoire de pathologie moléculaire avancée, IMCB, Singapour.

7 Département de pathologie, Hôpital général de Singapour, Singapour.

8 Gynaecologische Oncologie, UZ Leuven, Louvain, Belgique.

9 Centre d'oncologie gynécologique d'Amsterdam (CGOA), Antoni Van Leeuwenhoek – Institut néerlandais du cancer, Amsterdam, Pays-Bas.

10 Institut de technologie de Karlsruhe, Institut de toxicologie et de génétique, Karlsruhe, Allemagne.

11 Modèles murins du cancer humain, IMCB, Proteos, Singapour.

12 Département d'oncologie médicale, Centre national du cancer de Singapour, Singapour.

13 Laboratoires de recherche Lilly, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, États-Unis.

14 Laboratoire de recherche sur le mélanome, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Australie.

Adressez la correspondance à : Jean-Christophe Marine, Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Centre de biologie des maladies, VIB, Herestraat 49, bâtiment O&N4, box 602, 3000 Louvain, Belgique. Téléphone : 3216330368 E-mail : [email protected] Ou à : Ernesto Guccione, Division of Cancer Genetics and Therapeutics, Laboratory of Methyltransferases in Development and Disease, Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), 61 Biopolis Drive, Proteos, Singapour 138673. Téléphone : 6565869844 E-mail : [email protected]

Note d'auteur : Michael Dewaele, Tommaso Tabaglio, Karen Willekens et Marco Bezzi sont co-premiers auteurs et ont contribué à parts égales à ce travail. Jean-Christophe Marine et Ernesto Guccione sont co-auteurs principaux et ont contribué à parts égales à ce travail.

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1 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, VIB Centre de biologie des maladies, KU Leuven, Louvain, Belgique.

2 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Département de génétique humaine, KU Leuven, Louvain, Belgique.

3 Division de la génétique et de la thérapeutique du cancer, Laboratoire des méthyltransférases dans le développement et les maladies, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IMCB), A*STAR (Agence pour la science, la technologie et la recherche), Singapour.

4 Département de biochimie, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, Singapour.

5 Mouse Histopathology Core Facility, VIB Center for the Biology of Disease, KU Leuven, Louvain, Belgique.

6 Laboratoire de pathologie moléculaire avancée, IMCB, Singapour.

7 Département de pathologie, Hôpital général de Singapour, Singapour.

8 Gynaecologische Oncologie, UZ Leuven, Louvain, Belgique.

9 Centre d'oncologie gynécologique d'Amsterdam (CGOA), Antoni Van Leeuwenhoek – Institut néerlandais du cancer, Amsterdam, Pays-Bas.

10 Institut de technologie de Karlsruhe, Institut de toxicologie et de génétique, Karlsruhe, Allemagne.

11 Modèles murins du cancer humain, IMCB, Proteos, Singapour.

12 Département d'oncologie médicale, Centre national du cancer de Singapour, Singapour.

13 Laboratoires de recherche Lilly, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, États-Unis.

14 Laboratoire de recherche sur le mélanome, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Australie.

Adressez la correspondance à : Jean-Christophe Marine, Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Centre de biologie des maladies, VIB, Herestraat 49, bâtiment O&N4, box 602, 3000 Louvain, Belgique. Téléphone : 3216330368 E-mail : [email protected] Ou à : Ernesto Guccione, Division of Cancer Genetics and Therapeutics, Laboratory of Methyltransferases in Development and Disease, Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), 61 Biopolis Drive, Proteos, Singapour 138673. Téléphone : 6565869844 E-mail : [email protected]

Note d'auteur : Michael Dewaele, Tommaso Tabaglio, Karen Willekens et Marco Bezzi sont co-premiers auteurs et ont contribué à parts égales à ce travail. Jean-Christophe Marine et Ernesto Guccione sont co-auteurs principaux et ont contribué à parts égales à ce travail.

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1 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, VIB Centre de biologie des maladies, KU Leuven, Louvain, Belgique.

2 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Département de génétique humaine, KU Leuven, Louvain, Belgique.

3 Division de la génétique et de la thérapeutique du cancer, Laboratoire des méthyltransférases dans le développement et les maladies, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IMCB), A*STAR (Agence pour la science, la technologie et la recherche), Singapour.

4 Département de biochimie, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, Singapour.

5 Mouse Histopathology Core Facility, VIB Center for the Biology of Disease, KU Leuven, Louvain, Belgique.

6 Laboratoire de pathologie moléculaire avancée, IMCB, Singapour.

7 Département de pathologie, Hôpital général de Singapour, Singapour.

8 Gynaecologische Oncologie, UZ Leuven, Louvain, Belgique.

9 Centre d'oncologie gynécologique d'Amsterdam (CGOA), Antoni Van Leeuwenhoek – Institut néerlandais du cancer, Amsterdam, Pays-Bas.

10 Institut de technologie de Karlsruhe, Institut de toxicologie et de génétique, Karlsruhe, Allemagne.

11 Modèles murins du cancer humain, IMCB, Proteos, Singapour.

12 Département d'oncologie médicale, Centre national du cancer de Singapour, Singapour.

13 Laboratoires de recherche Lilly, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, États-Unis.

14 Laboratoire de recherche sur le mélanome, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Australie.

Adressez la correspondance à : Jean-Christophe Marine, Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Centre de biologie des maladies, VIB, Herestraat 49, bâtiment O&N4, box 602, 3000 Louvain, Belgique. Téléphone : 3216330368 E-mail : [email protected] Ou à : Ernesto Guccione, Division of Cancer Genetics and Therapeutics, Laboratory of Methyltransferases in Development and Disease, Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), 61 Biopolis Drive, Proteos, Singapour 138673. Téléphone : 6565869844 E-mail : [email protected]

Note d'auteur : Michael Dewaele, Tommaso Tabaglio, Karen Willekens et Marco Bezzi sont co-premiers auteurs et ont contribué à parts égales à ce travail. Jean-Christophe Marine et Ernesto Guccione sont co-auteurs principaux et ont contribué à parts égales à ce travail.

1 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, VIB Centre de biologie des maladies, KU Leuven, Louvain, Belgique.

2 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Département de génétique humaine, KU Leuven, Louvain, Belgique.

3 Division de la génétique et de la thérapeutique du cancer, Laboratoire des méthyltransférases dans le développement et les maladies, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IMCB), A*STAR (Agence pour la science, la technologie et la recherche), Singapour.

4 Département de biochimie, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, Singapour.

5 Mouse Histopathology Core Facility, VIB Center for the Biology of Disease, KU Leuven, Louvain, Belgique.

6 Laboratoire de pathologie moléculaire avancée, IMCB, Singapour.

7 Département de pathologie, Hôpital général de Singapour, Singapour.

8 Gynaecologische Oncologie, UZ Leuven, Louvain, Belgique.

9 Centre d'oncologie gynécologique d'Amsterdam (CGOA), Antoni Van Leeuwenhoek – Institut néerlandais du cancer, Amsterdam, Pays-Bas.

10 Institut de technologie de Karlsruhe, Institut de toxicologie et de génétique, Karlsruhe, Allemagne.

11 Modèles murins du cancer humain, IMCB, Proteos, Singapour.

12 Département d'oncologie médicale, Centre national du cancer de Singapour, Singapour.

13 Laboratoires de recherche Lilly, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, États-Unis.

14 Laboratoire de recherche sur le mélanome, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Australie.

Adressez la correspondance à : Jean-Christophe Marine, Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Centre de biologie des maladies, VIB, Herestraat 49, bâtiment O&N4, box 602, 3000 Louvain, Belgique. Téléphone : 3216330368 E-mail : [email protected] Ou à : Ernesto Guccione, Division of Cancer Genetics and Therapeutics, Laboratory of Methyltransferases in Development and Disease, Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), 61 Biopolis Drive, Proteos, Singapour 138673. Téléphone : 6565869844 E-mail : [email protected]

Note d'auteur : Michael Dewaele, Tommaso Tabaglio, Karen Willekens et Marco Bezzi sont co-premiers auteurs et ont contribué à parts égales à ce travail. Jean-Christophe Marine et Ernesto Guccione sont co-auteurs principaux et ont contribué à parts égales à ce travail.

1 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, VIB Centre de biologie des maladies, KU Leuven, Louvain, Belgique.

2 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Département de génétique humaine, KU Leuven, Louvain, Belgique.

3 Division de la génétique et de la thérapeutique du cancer, Laboratoire des méthyltransférases dans le développement et les maladies, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IMCB), A*STAR (Agence pour la science, la technologie et la recherche), Singapour.

4 Département de biochimie, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, Singapour.

5 Mouse Histopathology Core Facility, VIB Center for the Biology of Disease, KU Leuven, Louvain, Belgique.

6 Laboratoire de pathologie moléculaire avancée, IMCB, Singapour.

7 Département de pathologie, Hôpital général de Singapour, Singapour.

8 Gynaecologische Oncologie, UZ Leuven, Louvain, Belgique.

9 Centre d'oncologie gynécologique d'Amsterdam (CGOA), Antoni Van Leeuwenhoek – Institut néerlandais du cancer, Amsterdam, Pays-Bas.

10 Institut de technologie de Karlsruhe, Institut de toxicologie et de génétique, Karlsruhe, Allemagne.

11 Modèles murins du cancer humain, IMCB, Proteos, Singapour.

12 Département d'oncologie médicale, Centre national du cancer de Singapour, Singapour.

13 Laboratoires de recherche Lilly, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, États-Unis.

14 Laboratoire de recherche sur le mélanome, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Australie.

Adressez la correspondance à : Jean-Christophe Marine, Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Centre de biologie des maladies, VIB, Herestraat 49, bâtiment O&N4, box 602, 3000 Louvain, Belgique. Téléphone : 3216330368 E-mail : [email protected] Ou à : Ernesto Guccione, Division of Cancer Genetics and Therapeutics, Laboratory of Methyltransferases in Development and Disease, Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), 61 Biopolis Drive, Proteos, Singapour 138673. Téléphone : 6565869844 E-mail : [email protected]

Note d'auteur : Michael Dewaele, Tommaso Tabaglio, Karen Willekens et Marco Bezzi sont co-premiers auteurs et ont contribué à parts égales à ce travail. Jean-Christophe Marine et Ernesto Guccione sont co-auteurs principaux et ont contribué à parts égales à ce travail.

1 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, VIB Centre de biologie des maladies, KU Leuven, Louvain, Belgique.

2 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Département de génétique humaine, KU Leuven, Louvain, Belgique.

3 Division de la génétique et de la thérapeutique du cancer, Laboratoire des méthyltransférases dans le développement et les maladies, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IMCB), A*STAR (Agence pour la science, la technologie et la recherche), Singapour.

4 Département de biochimie, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, Singapour.

5 Mouse Histopathology Core Facility, VIB Center for the Biology of Disease, KU Leuven, Louvain, Belgique.

6 Laboratoire de pathologie moléculaire avancée, IMCB, Singapour.

7 Département de pathologie, Hôpital général de Singapour, Singapour.

8 Gynaecologische Oncologie, UZ Leuven, Louvain, Belgique.

9 Centre d'oncologie gynécologique d'Amsterdam (CGOA), Antoni Van Leeuwenhoek – Institut néerlandais du cancer, Amsterdam, Pays-Bas.

10 Institut de technologie de Karlsruhe, Institut de toxicologie et de génétique, Karlsruhe, Allemagne.

11 Modèles murins du cancer humain, IMCB, Proteos, Singapour.

12 Département d'oncologie médicale, Centre national du cancer de Singapour, Singapour.

13 Laboratoires de recherche Lilly, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, États-Unis.

14 Laboratoire de recherche sur le mélanome, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Australie.

Adressez la correspondance à : Jean-Christophe Marine, Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Centre de biologie des maladies, VIB, Herestraat 49, bâtiment O&N4, box 602, 3000 Louvain, Belgique. Téléphone : 3216330368 E-mail : [email protected] Ou à : Ernesto Guccione, Division of Cancer Genetics and Therapeutics, Laboratory of Methyltransferases in Development and Disease, Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), 61 Biopolis Drive, Proteos, Singapour 138673. Téléphone : 6565869844 E-mail : [email protected]

Note d'auteur : Michael Dewaele, Tommaso Tabaglio, Karen Willekens et Marco Bezzi sont co-premiers auteurs et ont contribué à parts égales à ce travail. Jean-Christophe Marine et Ernesto Guccione sont co-auteurs principaux et ont contribué à parts égales à ce travail.

1 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, VIB Centre de biologie des maladies, KU Leuven, Louvain, Belgique.

2 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Département de génétique humaine, KU Leuven, Louvain, Belgique.

3 Division de la génétique et de la thérapeutique du cancer, Laboratoire des méthyltransférases dans le développement et les maladies, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IMCB), A*STAR (Agence pour la science, la technologie et la recherche), Singapour.

4 Département de biochimie, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, Singapour.

5 Mouse Histopathology Core Facility, VIB Center for the Biology of Disease, KU Leuven, Louvain, Belgique.

6 Laboratoire de pathologie moléculaire avancée, IMCB, Singapour.

7 Département de pathologie, Hôpital général de Singapour, Singapour.

8 Gynaecologische Oncologie, UZ Leuven, Louvain, Belgique.

9 Centre d'oncologie gynécologique d'Amsterdam (CGOA), Antoni Van Leeuwenhoek – Institut néerlandais du cancer, Amsterdam, Pays-Bas.

10 Institut de technologie de Karlsruhe, Institut de toxicologie et de génétique, Karlsruhe, Allemagne.

11 Modèles murins du cancer humain, IMCB, Proteos, Singapour.

12 Département d'oncologie médicale, Centre national du cancer de Singapour, Singapour.

13 Laboratoires de recherche Lilly, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, États-Unis.

14 Laboratoire de recherche sur le mélanome, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Australie.

Adressez la correspondance à : Jean-Christophe Marine, Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Centre de biologie des maladies, VIB, Herestraat 49, bâtiment O&N4, box 602, 3000 Louvain, Belgique. Téléphone : 3216330368 E-mail : [email protected] Ou à : Ernesto Guccione, Division of Cancer Genetics and Therapeutics, Laboratory of Methyltransferases in Development and Disease, Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), 61 Biopolis Drive, Proteos, Singapour 138673. Téléphone : 6565869844 E-mail : [email protected]

Note d'auteur : Michael Dewaele, Tommaso Tabaglio, Karen Willekens et Marco Bezzi sont co-premiers auteurs et ont contribué à parts égales à ce travail. Jean-Christophe Marine et Ernesto Guccione sont co-auteurs principaux et ont contribué à parts égales à ce travail.

1 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, VIB Centre de biologie des maladies, KU Leuven, Louvain, Belgique.

2 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Département de génétique humaine, KU Leuven, Louvain, Belgique.

3 Division de la génétique et de la thérapeutique du cancer, Laboratoire des méthyltransférases dans le développement et les maladies, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IMCB), A*STAR (Agence pour la science, la technologie et la recherche), Singapour.

4 Département de biochimie, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, Singapour.

5 Mouse Histopathology Core Facility, VIB Center for the Biology of Disease, KU Leuven, Louvain, Belgique.

6 Laboratoire de pathologie moléculaire avancée, IMCB, Singapour.

7 Département de pathologie, Hôpital général de Singapour, Singapour.

8 Gynaecologische Oncologie, UZ Leuven, Louvain, Belgique.

9 Centre d'oncologie gynécologique d'Amsterdam (CGOA), Antoni Van Leeuwenhoek – Institut néerlandais du cancer, Amsterdam, Pays-Bas.

10 Institut de technologie de Karlsruhe, Institut de toxicologie et de génétique, Karlsruhe, Allemagne.

11 Modèles murins du cancer humain, IMCB, Proteos, Singapour.

12 Département d'oncologie médicale, Centre national du cancer de Singapour, Singapour.

13 Laboratoires de recherche Lilly, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, États-Unis.

14 Laboratoire de recherche sur le mélanome, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Australie.

Adressez la correspondance à : Jean-Christophe Marine, Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Centre de biologie des maladies, VIB, Herestraat 49, bâtiment O&N4, box 602, 3000 Louvain, Belgique. Téléphone : 3216330368 E-mail : [email protected] Ou à : Ernesto Guccione, Division of Cancer Genetics and Therapeutics, Laboratory of Methyltransferases in Development and Disease, Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), 61 Biopolis Drive, Proteos, Singapour 138673. Téléphone : 6565869844 E-mail : [email protected]

Note d'auteur : Michael Dewaele, Tommaso Tabaglio, Karen Willekens et Marco Bezzi sont co-premiers auteurs et ont contribué à parts égales à ce travail. Jean-Christophe Marine et Ernesto Guccione sont co-auteurs principaux et ont contribué à parts égales à ce travail.

1 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, VIB Centre de biologie des maladies, KU Leuven, Louvain, Belgique.

2 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Département de génétique humaine, KU Leuven, Louvain, Belgique.

3 Division de la génétique et de la thérapeutique du cancer, Laboratoire des méthyltransférases dans le développement et les maladies, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IMCB), A*STAR (Agence pour la science, la technologie et la recherche), Singapour.

4 Département de biochimie, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, Singapour.

5 Mouse Histopathology Core Facility, VIB Center for the Biology of Disease, KU Leuven, Louvain, Belgique.

6 Laboratoire de pathologie moléculaire avancée, IMCB, Singapour.

7 Département de pathologie, Hôpital général de Singapour, Singapour.

8 Gynaecologische Oncologie, UZ Leuven, Louvain, Belgique.

9 Centre d'oncologie gynécologique d'Amsterdam (CGOA), Antoni Van Leeuwenhoek – Institut néerlandais du cancer, Amsterdam, Pays-Bas.

10 Institut de technologie de Karlsruhe, Institut de toxicologie et de génétique, Karlsruhe, Allemagne.

11 Modèles murins du cancer humain, IMCB, Proteos, Singapour.

12 Département d'oncologie médicale, Centre national du cancer de Singapour, Singapour.

13 Laboratoires de recherche Lilly, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, États-Unis.

14 Laboratoire de recherche sur le mélanome, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Australie.

Adressez la correspondance à : Jean-Christophe Marine, Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Centre de biologie des maladies, VIB, Herestraat 49, bâtiment O&N4, box 602, 3000 Louvain, Belgique. Téléphone : 3216330368 E-mail : [email protected] Ou à : Ernesto Guccione, Division of Cancer Genetics and Therapeutics, Laboratory of Methyltransferases in Development and Disease, Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), 61 Biopolis Drive, Proteos, Singapour 138673. Téléphone : 6565869844 E-mail : egu[email protected]

Note d'auteur : Michael Dewaele, Tommaso Tabaglio, Karen Willekens et Marco Bezzi sont co-premiers auteurs et ont contribué à parts égales à ce travail. Jean-Christophe Marine et Ernesto Guccione sont co-auteurs principaux et ont contribué à parts égales à ce travail.

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1 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, VIB Centre de biologie des maladies, KU Leuven, Louvain, Belgique.

2 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Département de génétique humaine, KU Leuven, Louvain, Belgique.

3 Division de la génétique et de la thérapeutique du cancer, Laboratoire des méthyltransférases dans le développement et les maladies, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IMCB), A*STAR (Agence pour la science, la technologie et la recherche), Singapour.

4 Département de biochimie, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, Singapour.

5 Mouse Histopathology Core Facility, VIB Center for the Biology of Disease, KU Leuven, Louvain, Belgique.

6 Laboratoire de pathologie moléculaire avancée, IMCB, Singapour.

7 Département de pathologie, Hôpital général de Singapour, Singapour.

8 Gynaecologische Oncologie, UZ Leuven, Louvain, Belgique.

9 Centre d'oncologie gynécologique d'Amsterdam (CGOA), Antoni Van Leeuwenhoek – Institut néerlandais du cancer, Amsterdam, Pays-Bas.

10 Institut de technologie de Karlsruhe, Institut de toxicologie et de génétique, Karlsruhe, Allemagne.

11 Modèles murins du cancer humain, IMCB, Proteos, Singapour.

12 Département d'oncologie médicale, Centre national du cancer de Singapour, Singapour.

13 Laboratoires de recherche Lilly, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, États-Unis.

14 Laboratoire de recherche sur le mélanome, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Australie.

Adressez la correspondance à : Jean-Christophe Marine, Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Centre de biologie des maladies, VIB, Herestraat 49, bâtiment O&N4, box 602, 3000 Louvain, Belgique. Téléphone : 3216330368 E-mail : [email protected] Ou à : Ernesto Guccione, Division of Cancer Genetics and Therapeutics, Laboratory of Methyltransferases in Development and Disease, Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), 61 Biopolis Drive, Proteos, Singapour 138673. Téléphone : 6565869844 E-mail : [email protected]

Note d'auteur : Michael Dewaele, Tommaso Tabaglio, Karen Willekens et Marco Bezzi sont co-premiers auteurs et ont contribué à parts égales à ce travail. Jean-Christophe Marine et Ernesto Guccione sont co-auteurs principaux et ont contribué à parts égales à ce travail.

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1 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, VIB Centre de biologie des maladies, KU Leuven, Louvain, Belgique.

2 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Département de génétique humaine, KU Leuven, Louvain, Belgique.

3 Division de la génétique et de la thérapeutique du cancer, Laboratoire des méthyltransférases dans le développement et les maladies, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IMCB), A*STAR (Agence pour la science, la technologie et la recherche), Singapour.

4 Département de biochimie, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, Singapour.

5 Mouse Histopathology Core Facility, VIB Center for the Biology of Disease, KU Leuven, Louvain, Belgique.

6 Laboratoire de pathologie moléculaire avancée, IMCB, Singapour.

7 Département de pathologie, Hôpital général de Singapour, Singapour.

8 Gynaecologische Oncologie, UZ Leuven, Louvain, Belgique.

9 Centre d'oncologie gynécologique d'Amsterdam (CGOA), Antoni Van Leeuwenhoek – Institut néerlandais du cancer, Amsterdam, Pays-Bas.

10 Institut de technologie de Karlsruhe, Institut de toxicologie et de génétique, Karlsruhe, Allemagne.

11 Modèles murins du cancer humain, IMCB, Proteos, Singapour.

12 Département d'oncologie médicale, Centre national du cancer de Singapour, Singapour.

13 Laboratoires de recherche Lilly, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, États-Unis.

14 Laboratoire de recherche sur le mélanome, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Australie.

Adressez la correspondance à : Jean-Christophe Marine, Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Centre de biologie des maladies, VIB, Herestraat 49, bâtiment O&N4, box 602, 3000 Louvain, Belgique. Téléphone : 3216330368 E-mail : [email protected] Ou à : Ernesto Guccione, Division of Cancer Genetics and Therapeutics, Laboratory of Methyltransferases in Development and Disease, Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), 61 Biopolis Drive, Proteos, Singapour 138673. Téléphone : 6565869844 E-mail : [email protected]

Note d'auteur : Michael Dewaele, Tommaso Tabaglio, Karen Willekens et Marco Bezzi sont co-premiers auteurs et ont contribué à parts égales à ce travail. Jean-Christophe Marine et Ernesto Guccione sont co-auteurs principaux et ont contribué à parts égales à ce travail.

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1 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, VIB Centre de biologie des maladies, KU Leuven, Louvain, Belgique.

2 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Département de génétique humaine, KU Leuven, Louvain, Belgique.

3 Division de la génétique et de la thérapeutique du cancer, Laboratoire des méthyltransférases dans le développement et les maladies, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IMCB), A*STAR (Agence pour la science, la technologie et la recherche), Singapour.

4 Département de biochimie, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, Singapour.

5 Mouse Histopathology Core Facility, VIB Center for the Biology of Disease, KU Leuven, Louvain, Belgique.

6 Laboratoire de pathologie moléculaire avancée, IMCB, Singapour.

7 Département de pathologie, Hôpital général de Singapour, Singapour.

8 Gynaecologische Oncologie, UZ Leuven, Louvain, Belgique.

9 Centre d'oncologie gynécologique d'Amsterdam (CGOA), Antoni Van Leeuwenhoek – Institut néerlandais du cancer, Amsterdam, Pays-Bas.

10 Institut de technologie de Karlsruhe, Institut de toxicologie et de génétique, Karlsruhe, Allemagne.

11 Modèles murins du cancer humain, IMCB, Proteos, Singapour.

12 Département d'oncologie médicale, Centre national du cancer de Singapour, Singapour.

13 Laboratoires de recherche Lilly, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, États-Unis.

14 Laboratoire de recherche sur le mélanome, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Australie.

Adressez la correspondance à : Jean-Christophe Marine, Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Centre de biologie des maladies, VIB, Herestraat 49, bâtiment O&N4, box 602, 3000 Louvain, Belgique. Téléphone : 3216330368 E-mail : [email protected] Ou à : Ernesto Guccione, Division of Cancer Genetics and Therapeutics, Laboratory of Methyltransferases in Development and Disease, Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), 61 Biopolis Drive, Proteos, Singapour 138673. Téléphone : 6565869844 E-mail : [email protected]

Note d'auteur : Michael Dewaele, Tommaso Tabaglio, Karen Willekens et Marco Bezzi sont co-premiers auteurs et ont contribué à parts égales à ce travail. Jean-Christophe Marine et Ernesto Guccione sont co-auteurs principaux et ont contribué à parts égales à ce travail.

1 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, VIB Centre de biologie des maladies, KU Leuven, Louvain, Belgique.

2 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Département de génétique humaine, KU Leuven, Louvain, Belgique.

3 Division de la génétique et de la thérapeutique du cancer, Laboratoire des méthyltransférases dans le développement et les maladies, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IMCB), A*STAR (Agence pour la science, la technologie et la recherche), Singapour.

4 Département de biochimie, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, Singapour.

5 Mouse Histopathology Core Facility, VIB Center for the Biology of Disease, KU Leuven, Louvain, Belgique.

6 Laboratoire de pathologie moléculaire avancée, IMCB, Singapour.

7 Département de pathologie, Hôpital général de Singapour, Singapour.

8 Gynaecologische Oncologie, UZ Leuven, Louvain, Belgique.

9 Centre d'oncologie gynécologique d'Amsterdam (CGOA), Antoni Van Leeuwenhoek – Institut néerlandais du cancer, Amsterdam, Pays-Bas.

10 Institut de technologie de Karlsruhe, Institut de toxicologie et de génétique, Karlsruhe, Allemagne.

11 Modèles murins du cancer humain, IMCB, Proteos, Singapour.

12 Département d'oncologie médicale, Centre national du cancer de Singapour, Singapour.

13 Laboratoires de recherche Lilly, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, États-Unis.

14 Laboratoire de recherche sur le mélanome, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Australie.

Adressez la correspondance à : Jean-Christophe Marine, Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Centre de biologie des maladies, VIB, Herestraat 49, bâtiment O&N4, box 602, 3000 Louvain, Belgique. Téléphone : 3216330368 E-mail : [email protected] Ou à : Ernesto Guccione, Division of Cancer Genetics and Therapeutics, Laboratory of Methyltransferases in Development and Disease, Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), 61 Biopolis Drive, Proteos, Singapour 138673. Téléphone : 6565869844 E-mail : [email protected]

Note d'auteur : Michael Dewaele, Tommaso Tabaglio, Karen Willekens et Marco Bezzi sont co-premiers auteurs et ont contribué à parts égales à ce travail. Jean-Christophe Marine et Ernesto Guccione sont co-auteurs principaux et ont contribué à parts égales à ce travail.

Trouvez des articles de Hermans, E. dans : JCI | PubMed | Google Scholar

1 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, VIB Centre de biologie des maladies, KU Leuven, Louvain, Belgique.

2 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Département de génétique humaine, KU Leuven, Louvain, Belgique.

3 Division de la génétique et de la thérapeutique du cancer, Laboratoire des méthyltransférases dans le développement et les maladies, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IMCB), A*STAR (Agence pour la science, la technologie et la recherche), Singapour.

4 Département de biochimie, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, Singapour.

5 Mouse Histopathology Core Facility, VIB Center for the Biology of Disease, KU Leuven, Louvain, Belgique.

6 Laboratoire de pathologie moléculaire avancée, IMCB, Singapour.

7 Département de pathologie, Hôpital général de Singapour, Singapour.

8 Gynaecologische Oncologie, UZ Leuven, Louvain, Belgique.

9 Centre d'oncologie gynécologique d'Amsterdam (CGOA), Antoni Van Leeuwenhoek – Institut néerlandais du cancer, Amsterdam, Pays-Bas.

10 Institut de technologie de Karlsruhe, Institut de toxicologie et de génétique, Karlsruhe, Allemagne.

11 Modèles murins du cancer humain, IMCB, Proteos, Singapour.

12 Département d'oncologie médicale, Centre national du cancer de Singapour, Singapour.

13 Laboratoires de recherche Lilly, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, États-Unis.

14 Laboratoire de recherche sur le mélanome, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Australie.

Adressez la correspondance à : Jean-Christophe Marine, Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Centre de biologie des maladies, VIB, Herestraat 49, bâtiment O&N4, box 602, 3000 Louvain, Belgique. Téléphone : 3216330368 E-mail : [email protected] Ou à : Ernesto Guccione, Division of Cancer Genetics and Therapeutics, Laboratory of Methyltransferases in Development and Disease, Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), 61 Biopolis Drive, Proteos, Singapour 138673. Téléphone : 6565869844 E-mail : [email protected]

Note d'auteur : Michael Dewaele, Tommaso Tabaglio, Karen Willekens et Marco Bezzi sont co-premiers auteurs et ont contribué à parts égales à ce travail. Jean-Christophe Marine et Ernesto Guccione sont co-auteurs principaux et ont contribué à parts égales à ce travail.

1 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, VIB Centre de biologie des maladies, KU Leuven, Louvain, Belgique.

2 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Département de génétique humaine, KU Leuven, Louvain, Belgique.

3 Division de la génétique et de la thérapeutique du cancer, Laboratoire des méthyltransférases dans le développement et les maladies, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IMCB), A*STAR (Agence pour la science, la technologie et la recherche), Singapour.

4 Département de biochimie, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, Singapour.

5 Mouse Histopathology Core Facility, VIB Center for the Biology of Disease, KU Leuven, Louvain, Belgique.

6 Laboratoire de pathologie moléculaire avancée, IMCB, Singapour.

7 Département de pathologie, Hôpital général de Singapour, Singapour.

8 Gynaecologische Oncologie, UZ Leuven, Louvain, Belgique.

9 Centre d'oncologie gynécologique d'Amsterdam (CGOA), Antoni Van Leeuwenhoek – Institut néerlandais du cancer, Amsterdam, Pays-Bas.

10 Institut de technologie de Karlsruhe, Institut de toxicologie et de génétique, Karlsruhe, Allemagne.

11 Modèles murins du cancer humain, IMCB, Proteos, Singapour.

12 Département d'oncologie médicale, Centre national du cancer de Singapour, Singapour.

13 Laboratoires de recherche Lilly, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, États-Unis.

14 Laboratoire de recherche sur le mélanome, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Australie.

Adressez la correspondance à : Jean-Christophe Marine, Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Centre de biologie des maladies, VIB, Herestraat 49, bâtiment O&N4, box 602, 3000 Louvain, Belgique. Téléphone : 3216330368 E-mail : [email protected] Ou à : Ernesto Guccione, Division of Cancer Genetics and Therapeutics, Laboratory of Methyltransferases in Development and Disease, Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), 61 Biopolis Drive, Proteos, Singapour 138673. Téléphone : 6565869844 E-mail : [email protected]

Note d'auteur : Michael Dewaele, Tommaso Tabaglio, Karen Willekens et Marco Bezzi sont co-premiers auteurs et ont contribué à parts égales à ce travail. Jean-Christophe Marine et Ernesto Guccione sont co-auteurs principaux et ont contribué à parts égales à ce travail.

1 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, VIB Centre de biologie des maladies, KU Leuven, Louvain, Belgique.

2 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Département de génétique humaine, KU Leuven, Louvain, Belgique.

3 Division de la génétique et de la thérapeutique du cancer, Laboratoire des méthyltransférases dans le développement et les maladies, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IMCB), A*STAR (Agence pour la science, la technologie et la recherche), Singapour.

4 Département de biochimie, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, Singapour.

5 Mouse Histopathology Core Facility, VIB Center for the Biology of Disease, KU Leuven, Louvain, Belgique.

6 Laboratoire de pathologie moléculaire avancée, IMCB, Singapour.

7 Département de pathologie, Hôpital général de Singapour, Singapour.

8 Gynaecologische Oncologie, UZ Leuven, Louvain, Belgique.

9 Centre d'oncologie gynécologique d'Amsterdam (CGOA), Antoni Van Leeuwenhoek – Institut néerlandais du cancer, Amsterdam, Pays-Bas.

10 Institut de technologie de Karlsruhe, Institut de toxicologie et de génétique, Karlsruhe, Allemagne.

11 Modèles murins du cancer humain, IMCB, Proteos, Singapour.

12 Département d'oncologie médicale, Centre national du cancer de Singapour, Singapour.

13 Laboratoires de recherche Lilly, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, États-Unis.

14 Laboratoire de recherche sur le mélanome, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Australie.

Adressez la correspondance à : Jean-Christophe Marine, Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Centre de biologie des maladies, VIB, Herestraat 49, bâtiment O&N4, box 602, 3000 Louvain, Belgique. Téléphone : 3216330368 E-mail : [email protected] Ou à : Ernesto Guccione, Division of Cancer Genetics and Therapeutics, Laboratory of Methyltransferases in Development and Disease, Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), 61 Biopolis Drive, Proteos, Singapour 138673. Téléphone : 6565869844 E-mail : [email protected]

Note d'auteur : Michael Dewaele, Tommaso Tabaglio, Karen Willekens et Marco Bezzi sont co-premiers auteurs et ont contribué à parts égales à ce travail. Jean-Christophe Marine et Ernesto Guccione sont co-auteurs principaux et ont contribué à parts égales à ce travail.

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1 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, VIB Centre de biologie des maladies, KU Leuven, Louvain, Belgique.

2 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Département de génétique humaine, KU Leuven, Louvain, Belgique.

3 Division de la génétique et de la thérapeutique du cancer, Laboratoire des méthyltransférases dans le développement et les maladies, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IMCB), A*STAR (Agence pour la science, la technologie et la recherche), Singapour.

4 Département de biochimie, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, Singapour.

5 Mouse Histopathology Core Facility, VIB Center for the Biology of Disease, KU Leuven, Louvain, Belgique.

6 Laboratoire de pathologie moléculaire avancée, IMCB, Singapour.

7 Département de pathologie, Hôpital général de Singapour, Singapour.

8 Gynaecologische Oncologie, UZ Leuven, Louvain, Belgique.

9 Centre d'oncologie gynécologique d'Amsterdam (CGOA), Antoni Van Leeuwenhoek – Institut néerlandais du cancer, Amsterdam, Pays-Bas.

10 Institut de technologie de Karlsruhe, Institut de toxicologie et de génétique, Karlsruhe, Allemagne.

11 Modèles murins du cancer humain, IMCB, Proteos, Singapour.

12 Département d'oncologie médicale, Centre national du cancer de Singapour, Singapour.

13 Laboratoires de recherche Lilly, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, États-Unis.

14 Laboratoire de recherche sur le mélanome, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Australie.

Adressez la correspondance à : Jean-Christophe Marine, Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Centre de biologie des maladies, VIB, Herestraat 49, bâtiment O&N4, box 602, 3000 Louvain, Belgique. Téléphone : 3216330368 E-mail : [email protected] Ou à : Ernesto Guccione, Division of Cancer Genetics and Therapeutics, Laboratory of Methyltransferases in Development and Disease, Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), 61 Biopolis Drive, Proteos, Singapour 138673. Téléphone : 6565869844 E-mail : [email protected]

Note d'auteur : Michael Dewaele, Tommaso Tabaglio, Karen Willekens et Marco Bezzi sont co-premiers auteurs et ont contribué à parts égales à ce travail. Jean-Christophe Marine et Ernesto Guccione sont co-auteurs principaux et ont contribué à parts égales à ce travail.

1 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, VIB Centre de biologie des maladies, KU Leuven, Louvain, Belgique.

2 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Département de génétique humaine, KU Leuven, Louvain, Belgique.

3 Division de la génétique et de la thérapeutique du cancer, Laboratoire des méthyltransférases dans le développement et les maladies, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IMCB), A*STAR (Agence pour la science, la technologie et la recherche), Singapour.

4 Département de biochimie, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, Singapour.

5 Mouse Histopathology Core Facility, VIB Center for the Biology of Disease, KU Leuven, Louvain, Belgique.

6 Laboratoire de pathologie moléculaire avancée, IMCB, Singapour.

7 Département de pathologie, Hôpital général de Singapour, Singapour.

8 Gynaecologische Oncologie, UZ Leuven, Louvain, Belgique.

9 Centre d'oncologie gynécologique d'Amsterdam (CGOA), Antoni Van Leeuwenhoek – Institut néerlandais du cancer, Amsterdam, Pays-Bas.

10 Institut de technologie de Karlsruhe, Institut de toxicologie et de génétique, Karlsruhe, Allemagne.

11 Modèles murins du cancer humain, IMCB, Proteos, Singapour.

12 Département d'oncologie médicale, Centre national du cancer de Singapour, Singapour.

13 Laboratoires de recherche Lilly, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, États-Unis.

14 Laboratoire de recherche sur le mélanome, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Australie.

Adressez la correspondance à : Jean-Christophe Marine, Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Centre de biologie des maladies, VIB, Herestraat 49, bâtiment O&N4, box 602, 3000 Louvain, Belgique. Téléphone : 3216330368 E-mail : [email protected] Ou à : Ernesto Guccione, Division of Cancer Genetics and Therapeutics, Laboratory of Methyltransferases in Development and Disease, Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), 61 Biopolis Drive, Proteos, Singapour 138673. Téléphone : 6565869844 E-mail : [email protected]

Note d'auteur : Michael Dewaele, Tommaso Tabaglio, Karen Willekens et Marco Bezzi sont co-premiers auteurs et ont contribué à parts égales à ce travail. Jean-Christophe Marine et Ernesto Guccione sont co-auteurs principaux et ont contribué à parts égales à ce travail.

1 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, VIB Centre de biologie des maladies, KU Leuven, Louvain, Belgique.

2 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Département de génétique humaine, KU Leuven, Louvain, Belgique.

3 Division de la génétique et de la thérapeutique du cancer, Laboratoire des méthyltransférases dans le développement et les maladies, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IMCB), A*STAR (Agence pour la science, la technologie et la recherche), Singapour.

4 Département de biochimie, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, Singapour.

5 Mouse Histopathology Core Facility, VIB Center for the Biology of Disease, KU Leuven, Louvain, Belgique.

6 Laboratoire de pathologie moléculaire avancée, IMCB, Singapour.

7 Département de pathologie, Hôpital général de Singapour, Singapour.

8 Gynaecologische Oncologie, UZ Leuven, Louvain, Belgique.

9 Centre d'oncologie gynécologique d'Amsterdam (CGOA), Antoni Van Leeuwenhoek – Institut néerlandais du cancer, Amsterdam, Pays-Bas.

10 Institut de technologie de Karlsruhe, Institut de toxicologie et de génétique, Karlsruhe, Allemagne.

11 Modèles murins du cancer humain, IMCB, Proteos, Singapour.

12 Département d'oncologie médicale, Centre national du cancer de Singapour, Singapour.

13 Laboratoires de recherche Lilly, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, États-Unis.

14 Laboratoire de recherche sur le mélanome, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Australie.

Adressez la correspondance à : Jean-Christophe Marine, Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Centre de biologie des maladies, VIB, Herestraat 49, bâtiment O&N4, box 602, 3000 Louvain, Belgique. Téléphone : 3216330368 E-mail : [email protected] Ou à : Ernesto Guccione, Division of Cancer Genetics and Therapeutics, Laboratory of Methyltransferases in Development and Disease, Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), 61 Biopolis Drive, Proteos, Singapour 138673. Téléphone : 6565869844 E-mail : [email protected]

Note d'auteur : Michael Dewaele, Tommaso Tabaglio, Karen Willekens et Marco Bezzi sont co-premiers auteurs et ont contribué à parts égales à ce travail. Jean-Christophe Marine et Ernesto Guccione sont co-auteurs principaux et ont contribué à parts égales à ce travail.

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1 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, VIB Centre de biologie des maladies, KU Leuven, Louvain, Belgique.

2 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Département de génétique humaine, KU Leuven, Louvain, Belgique.

3 Division de la génétique et de la thérapeutique du cancer, Laboratoire des méthyltransférases dans le développement et les maladies, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IMCB), A*STAR (Agence pour la science, la technologie et la recherche), Singapour.

4 Département de biochimie, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, Singapour.

5 Mouse Histopathology Core Facility, VIB Center for the Biology of Disease, KU Leuven, Louvain, Belgique.

6 Laboratoire de pathologie moléculaire avancée, IMCB, Singapour.

7 Département de pathologie, Hôpital général de Singapour, Singapour.

8 Gynaecologische Oncologie, UZ Leuven, Louvain, Belgique.

9 Centre d'oncologie gynécologique d'Amsterdam (CGOA), Antoni Van Leeuwenhoek – Institut néerlandais du cancer, Amsterdam, Pays-Bas.

10 Institut de technologie de Karlsruhe, Institut de toxicologie et de génétique, Karlsruhe, Allemagne.

11 Modèles murins du cancer humain, IMCB, Proteos, Singapour.

12 Département d'oncologie médicale, Centre national du cancer de Singapour, Singapour.

13 Laboratoires de recherche Lilly, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, États-Unis.

14 Laboratoire de recherche sur le mélanome, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Australie.

Adressez la correspondance à : Jean-Christophe Marine, Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Centre de biologie des maladies, VIB, Herestraat 49, bâtiment O&N4, box 602, 3000 Louvain, Belgique. Téléphone : 3216330368 E-mail : [email protected] Ou à : Ernesto Guccione, Division of Cancer Genetics and Therapeutics, Laboratory of Methyltransferases in Development and Disease, Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), 61 Biopolis Drive, Proteos, Singapour 138673. Téléphone : 6565869844 E-mail : [email protected]

Note d'auteur : Michael Dewaele, Tommaso Tabaglio, Karen Willekens et Marco Bezzi sont co-premiers auteurs et ont contribué à parts égales à ce travail. Jean-Christophe Marine et Ernesto Guccione sont co-auteurs principaux et ont contribué à parts égales à ce travail.

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1 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, VIB Centre de biologie des maladies, KU Leuven, Louvain, Belgique.

2 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Département de génétique humaine, KU Leuven, Louvain, Belgique.

3 Division de la génétique et de la thérapeutique du cancer, Laboratoire des méthyltransférases dans le développement et les maladies, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IMCB), A*STAR (Agence pour la science, la technologie et la recherche), Singapour.

4 Département de biochimie, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, Singapour.

5 Mouse Histopathology Core Facility, VIB Center for the Biology of Disease, KU Leuven, Louvain, Belgique.

6 Laboratoire de pathologie moléculaire avancée, IMCB, Singapour.

7 Département de pathologie, Hôpital général de Singapour, Singapour.

8 Gynaecologische Oncologie, UZ Leuven, Louvain, Belgique.

9 Centre d'oncologie gynécologique d'Amsterdam (CGOA), Antoni Van Leeuwenhoek – Institut néerlandais du cancer, Amsterdam, Pays-Bas.

10 Institut de technologie de Karlsruhe, Institut de toxicologie et de génétique, Karlsruhe, Allemagne.

11 Modèles murins du cancer humain, IMCB, Proteos, Singapour.

12 Département d'oncologie médicale, Centre national du cancer de Singapour, Singapour.

13 Laboratoires de recherche Lilly, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, États-Unis.

14 Laboratoire de recherche sur le mélanome, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Australie.

Adressez la correspondance à : Jean-Christophe Marine, Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Centre de biologie des maladies, VIB, Herestraat 49, bâtiment O&N4, box 602, 3000 Louvain, Belgique. Téléphone : 3216330368 E-mail : [email protected] Ou à : Ernesto Guccione, Division of Cancer Genetics and Therapeutics, Laboratory of Methyltransferases in Development and Disease, Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), 61 Biopolis Drive, Proteos, Singapour 138673. Téléphone : 6565869844 E-mail : [email protected]

Note d'auteur : Michael Dewaele, Tommaso Tabaglio, Karen Willekens et Marco Bezzi sont co-premiers auteurs et ont contribué à parts égales à ce travail. Jean-Christophe Marine et Ernesto Guccione sont co-auteurs principaux et ont contribué à parts égales à ce travail.

1 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, VIB Centre de biologie des maladies, KU Leuven, Louvain, Belgique.

2 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Département de génétique humaine, KU Leuven, Louvain, Belgique.

3 Division de la génétique et de la thérapeutique du cancer, Laboratoire des méthyltransférases dans le développement et les maladies, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IMCB), A*STAR (Agence pour la science, la technologie et la recherche), Singapour.

4 Département de biochimie, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, Singapour.

5 Mouse Histopathology Core Facility, VIB Center for the Biology of Disease, KU Leuven, Louvain, Belgique.

6 Laboratoire de pathologie moléculaire avancée, IMCB, Singapour.

7 Département de pathologie, Hôpital général de Singapour, Singapour.

8 Gynaecologische Oncologie, UZ Leuven, Louvain, Belgique.

9 Centre d'oncologie gynécologique d'Amsterdam (CGOA), Antoni Van Leeuwenhoek – Institut néerlandais du cancer, Amsterdam, Pays-Bas.

10 Institut de technologie de Karlsruhe, Institut de toxicologie et de génétique, Karlsruhe, Allemagne.

11 Modèles murins du cancer humain, IMCB, Proteos, Singapour.

12 Département d'oncologie médicale, Centre national du cancer de Singapour, Singapour.

13 Laboratoires de recherche Lilly, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, États-Unis.

14 Laboratoire de recherche sur le mélanome, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Australie.

Adressez la correspondance à : Jean-Christophe Marine, Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Centre de biologie des maladies, VIB, Herestraat 49, bâtiment O&N4, box 602, 3000 Louvain, Belgique. Téléphone : 3216330368 E-mail : [email protected] Ou à : Ernesto Guccione, Division of Cancer Genetics and Therapeutics, Laboratory of Methyltransferases in Development and Disease, Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), 61 Biopolis Drive, Proteos, Singapour 138673. Téléphone : 6565869844 E-mail : [email protected]

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1 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, VIB Centre de biologie des maladies, KU Leuven, Louvain, Belgique.

2 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Département de génétique humaine, KU Leuven, Louvain, Belgique.

3 Division de la génétique et de la thérapeutique du cancer, Laboratoire des méthyltransférases dans le développement et les maladies, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IMCB), A*STAR (Agence pour la science, la technologie et la recherche), Singapour.

4 Département de biochimie, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, Singapour.

5 Mouse Histopathology Core Facility, VIB Center for the Biology of Disease, KU Leuven, Louvain, Belgique.

6 Laboratoire de pathologie moléculaire avancée, IMCB, Singapour.

7 Département de pathologie, Hôpital général de Singapour, Singapour.

8 Gynaecologische Oncologie, UZ Leuven, Louvain, Belgique.

9 Centre d'oncologie gynécologique d'Amsterdam (CGOA), Antoni Van Leeuwenhoek – Institut néerlandais du cancer, Amsterdam, Pays-Bas.

10 Institut de technologie de Karlsruhe, Institut de toxicologie et de génétique, Karlsruhe, Allemagne.

11 Modèles murins du cancer humain, IMCB, Proteos, Singapour.

12 Département d'oncologie médicale, Centre national du cancer de Singapour, Singapour.

13 Laboratoires de recherche Lilly, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, États-Unis.

14 Laboratoire de recherche sur le mélanome, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Australie.

Adressez la correspondance à : Jean-Christophe Marine, Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Centre de biologie des maladies, VIB, Herestraat 49, bâtiment O&N4, box 602, 3000 Louvain, Belgique. Téléphone : 3216330368 E-mail : [email protected] Ou à : Ernesto Guccione, Division of Cancer Genetics and Therapeutics, Laboratory of Methyltransferases in Development and Disease, Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), 61 Biopolis Drive, Proteos, Singapour 138673. Téléphone : 6565869844 E-mail : [email protected]

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1 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, VIB Centre de biologie des maladies, KU Leuven, Louvain, Belgique.

2 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Département de génétique humaine, KU Leuven, Louvain, Belgique.

3 Division de la génétique et de la thérapeutique du cancer, Laboratoire des méthyltransférases dans le développement et les maladies, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IMCB), A*STAR (Agence pour la science, la technologie et la recherche), Singapour.

4 Département de biochimie, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, Singapour.

5 Mouse Histopathology Core Facility, VIB Center for the Biology of Disease, KU Leuven, Louvain, Belgique.

6 Laboratoire de pathologie moléculaire avancée, IMCB, Singapour.

7 Département de pathologie, Hôpital général de Singapour, Singapour.

8 Gynaecologische Oncologie, UZ Leuven, Louvain, Belgique.

9 Centre d'oncologie gynécologique d'Amsterdam (CGOA), Antoni Van Leeuwenhoek – Institut néerlandais du cancer, Amsterdam, Pays-Bas.

10 Institut de technologie de Karlsruhe, Institut de toxicologie et de génétique, Karlsruhe, Allemagne.

11 Modèles murins du cancer humain, IMCB, Proteos, Singapour.

12 Département d'oncologie médicale, Centre national du cancer de Singapour, Singapour.

13 Laboratoires de recherche Lilly, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, États-Unis.

14 Laboratoire de recherche sur le mélanome, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Australie.

Adressez la correspondance à : Jean-Christophe Marine, Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Centre de biologie des maladies, VIB, Herestraat 49, bâtiment O&N4, box 602, 3000 Louvain, Belgique. Téléphone : 3216330368 E-mail : [email protected] Ou à : Ernesto Guccione, Division of Cancer Genetics and Therapeutics, Laboratory of Methyltransferases in Development and Disease, Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), 61 Biopolis Drive, Proteos, Singapour 138673. Téléphone : 6565869844 E-mail : [email protected]

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1 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, VIB Centre de biologie des maladies, KU Leuven, Louvain, Belgique.

2 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Département de génétique humaine, KU Leuven, Louvain, Belgique.

3 Division de la génétique et de la thérapeutique du cancer, Laboratoire des méthyltransférases dans le développement et les maladies, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IMCB), A*STAR (Agence pour la science, la technologie et la recherche), Singapour.

4 Département de biochimie, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, Singapour.

5 Mouse Histopathology Core Facility, VIB Center for the Biology of Disease, KU Leuven, Louvain, Belgique.

6 Laboratoire de pathologie moléculaire avancée, IMCB, Singapour.

7 Département de pathologie, Hôpital général de Singapour, Singapour.

8 Gynaecologische Oncologie, UZ Leuven, Louvain, Belgique.

9 Centre d'oncologie gynécologique d'Amsterdam (CGOA), Antoni Van Leeuwenhoek – Institut néerlandais du cancer, Amsterdam, Pays-Bas.

10 Institut de technologie de Karlsruhe, Institut de toxicologie et de génétique, Karlsruhe, Allemagne.

11 Modèles murins du cancer humain, IMCB, Proteos, Singapour.

12 Département d'oncologie médicale, Centre national du cancer de Singapour, Singapour.

13 Laboratoires de recherche Lilly, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, États-Unis.

14 Laboratoire de recherche sur le mélanome, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Australie.

Adressez la correspondance à : Jean-Christophe Marine, Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Centre de biologie des maladies, VIB, Herestraat 49, bâtiment O&N4, box 602, 3000 Louvain, Belgique. Téléphone : 3216330368 E-mail : [email protected] à : Ernesto Guccione, Division of Cancer Genetics and Therapeutics, Laboratory of Methyltransferases in Development and Disease, Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), 61 Biopolis Drive, Proteos, Singapour 138673. Téléphone : 6565869844 E-mail : [email protected]

Note d'auteur : Michael Dewaele, Tommaso Tabaglio, Karen Willekens et Marco Bezzi sont co-premiers auteurs et ont contribué à parts égales à ce travail. Jean-Christophe Marine et Ernesto Guccione sont co-auteurs principaux et ont contribué à parts égales à ce travail.

1 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, VIB Centre de biologie des maladies, KU Leuven, Louvain, Belgique.

2 Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Département de génétique humaine, KU Leuven, Louvain, Belgique.

3 Division de la génétique et de la thérapeutique du cancer, Laboratoire des méthyltransférases dans le développement et les maladies, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IMCB), A*STAR (Agence pour la science, la technologie et la recherche), Singapour.

4 Département de biochimie, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, Singapour.

5 Mouse Histopathology Core Facility, VIB Center for the Biology of Disease, KU Leuven, Louvain, Belgique.

6 Laboratoire de pathologie moléculaire avancée, IMCB, Singapour.

7 Département de pathologie, Hôpital général de Singapour, Singapour.

8 Gynaecologische Oncologie, UZ Leuven, Louvain, Belgique.

9 Centre d'oncologie gynécologique d'Amsterdam (CGOA), Antoni Van Leeuwenhoek – Institut néerlandais du cancer, Amsterdam, Pays-Bas.

10 Institut de technologie de Karlsruhe, Institut de toxicologie et de génétique, Karlsruhe, Allemagne.

11 Modèles murins du cancer humain, IMCB, Proteos, Singapour.

12 Département d'oncologie médicale, Centre national du cancer de Singapour, Singapour.

13 Laboratoires de recherche Lilly, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, États-Unis.

14 Laboratoire de recherche sur le mélanome, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Australie.

Adressez la correspondance à : Jean-Christophe Marine, Laboratoire de biologie moléculaire du cancer, Centre de biologie des maladies, VIB, Herestraat 49, bâtiment O&N4, box 602, 3000 Louvain, Belgique. Téléphone : 3216330368 E-mail : [email protected] Ou à : Ernesto Guccione, Division of Cancer Genetics and Therapeutics, Laboratory of Methyltransferases in Development and Disease, Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), 61 Biopolis Drive, Proteos, Singapour 138673. Téléphone : 6565869844 E-mail : [email protected]

Note d'auteur : Michael Dewaele, Tommaso Tabaglio, Karen Willekens et Marco Bezzi sont co-premiers auteurs et ont contribué à parts égales à ce travail. Jean-Christophe Marine et Ernesto Guccione sont co-auteurs principaux et ont contribué à parts égales à ce travail.

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Publié le 23 novembre 2015 - Plus d'infos

Le MDM4 est une cible prometteuse pour le traitement du cancer, car il est indétectable dans la plupart des tissus adultes normaux mais souvent régulé à la hausse dans les cellules cancéreuses pour atténuer la fonction suppresseur de tumeur p53. Les mécanismes qui sous-tendent la régulation positive de MDM4 dans les cellules cancéreuses sont en grande partie inconnus. Ici, nous avons montré que cet événement oncogène clé dépend principalement d'un commutateur d'épissage alternatif spécifique. Nous avons déterminé que bien qu'une isoforme non-sens et ciblée pour la désintégration de MDM4 (MDM4-S) est produit dans les tissus adultes normaux à la suite du saut de l'exon 6, l'inclusion améliorée de l'exon 6 conduit à l'expression de MDM4 pleine longueur dans un grand nombre de cancers humains. Bien que cet événement d'épissage alternatif soit probablement régulé par de multiples facteurs d'épissage, nous avons identifié l'oncoprotéine SRSF3 comme un activateur clé de l'inclusion de l'exon 6. Dans plusieurs lignées cellulaires de mélanome humain et dans des modèles murins de xénogreffe dérivée de patients atteints de mélanome (PDX), le saut de l'exon 6 médié par les oligonucléotides antisens (médiation ASO) a diminué l'abondance de MDM4, inhibé la croissance du mélanome et amélioré la sensibilité aux thérapies ciblant MAPK. De plus, basé sur ASO MDM4 ciblant la réduction de la croissance PDX diffuse du lymphome à grandes cellules B. En pleine longueur MDM4 est renforcée dans plusieurs tumeurs humaines, nos données indiquent que cette stratégie est applicable à un large éventail de types de tumeurs. Nous concluons que l'amélioration MDM4 L'inclusion de l'exon 6 est un événement oncogène courant et a le potentiel en tant que cible thérapeutique cliniquement compatible.

La protéine MDM4 liée à MDM2 contribue à l'inactivation de p53 au cours du développement embryonnaire (1). Contrairement au MDM2, cependant, le MDM4 n'est exprimé qu'à des niveaux faibles ou indétectables dans la plupart des tissus adultes (2) et est largement inutile pour l'homéostasie des tissus adultes (3 - 6). Par conséquent, alors que MDM2 fonctionne à la fois dans les cellules en prolifération et dans les cellules différenciées en phase terminale, MDM4 aide MDM2 à supprimer p53 uniquement dans les cellules à forte prolifération telles que celles trouvées au cours du développement embryonnaire ou dans le compartiment prolifératif de l'épithélium intestinal (7). De manière cohérente, MDM4 est exprimé dans les cellules souches embryonnaires murines (mESC) hautement proliférantes et son expression diminue lors de la différenciation induite par l'acide rétinoïque (induite par l'AR) (8).

L'expression de MDM4 est souvent augmentée dans les cellules cancéreuses en tant que mécanisme pour inhiber la suppression tumorale médiée par p53. MDM4 L'expression de l'ARNm est élevée dans une fraction substantielle des tumeurs humaines telles que les cancers de l'estomac et de l'intestin grêle (43 %), les glioblastomes (8 %), les cancers colorectaux (20 %) et les cancers du sein (20 %) (9 – 12). Le ou les mécanismes qui favorisent l'expression de MDM4 dans les tumeurs humaines ne sont pas entièrement compris mais présentent un grand intérêt en tant que cibles thérapeutiques potentielles. Un de ces mécanismes est l'amplification génique, se produisant, par exemple, dans une petite fraction des cancers du sein (9). Nous avons récemment démontré que les niveaux de protéine MDM4, mais pas d'ARNm, sont élevés dans environ 65% des mélanomes cutanés (13). Cette observation indique que les mécanismes post-transcriptionnels peuvent également contribuer à une expression accrue de MDM4 dans un sous-ensemble de cancers. Il est important de noter que cela soulève également la possibilité que nous ayons jusqu'à présent sous-estimé la fréquence des cancers exprimant MDM4, car la plupart des études se sont concentrées sur le rapport MDM4 les variations du nombre de copies de gènes et les niveaux totaux d'ARNm.

Notre étude récente a établi un lien de causalité entre MDM4 la surexpression et la formation de mélanome in vivo et, surtout, a souligné la dépendance des cellules de mélanome à des niveaux élevés de MDM4. L'extinction de MDM4 a diminué la croissance du mélanome, et cela était au moins en partie une conséquence de l'augmentation de l'apoptose dépendante de p53. De manière cohérente, le ciblage de l'interaction physique entre MDM4 et p53 à l'aide de SAH-p53-8, un petit peptide -hélicoïdal agrafé pénétrant dans les cellules, était suffisant pour induire l'apoptose dépendante de p53 dans les cellules de mélanome (13).

Bien qu'un traitement ciblé avec des inhibiteurs sélectifs de BRAF tels que le vemurafenib ait récemment donné des réponses antitumorales impressionnantes chez les patients atteints de mélanome porteurs de mutations BRAF V600E (14, 15), la résistance aux médicaments est généralement acquise dans les 12 mois (16). Les rechutes peuvent être retardées, mais généralement pas évitées, lorsque le vémurafénib est associé à un inhibiteur sélectif de MEK1/MEK2 tel que le cobimétinib (17). Surmonter la résistance aux thérapies ciblées nécessitera probablement le ciblage de multiples mécanismes oncogènes. Fait important, SAH-p53-8 a sensibilisé les cellules de mélanome à la chimiothérapie conventionnelle et à l'inhibition de BRAFV600E par le vemurafenib et a inhibé la croissance des cellules de mélanome mutantes BRAFV600E qui ont acquis une résistance aux inhibiteurs de BRAFV600E (13). Ces données indiquent que le ciblage de l'interaction MDM4-p53 représente une opportunité thérapeutique unique pour réactiver la fonction de p53 supprimée dans le contexte d'une thérapie combinée antimélanome.

Malheureusement, les petites molécules qui perturbent sélectivement et efficacement les complexes MDM4-p53 n'ont jusqu'à présent pas été identifiées ou introduites en clinique. De plus, un nombre croissant de preuves a montré que MDM4 possède des fonctions oncogènes indépendantes de p53 (2, 18 – 21). De manière cohérente, en plus d'induire l'apoptose dépendante de p53, l'extinction de MDM4 dans les cellules de mélanome a également provoqué un arrêt du cycle cellulaire qui n'a pas pu être sauvé lors de l'inactivation concomitante de p53 (13). L'inhibition de la croissance du mélanome lors du knockdown de MDM4 (KD) était plus importante que celle observée lors de l'inhibition de l'interaction MDM4-p53 et pouvait également être observée dans certaines cellules de mélanome p53 mutantes. Ces données indiquent des mécanismes indépendants de p53 de l'oncogénicité de MDM4 dans le mélanome, en plus de la capacité bien connue de MDM4 à supprimer p53.

L'épissage alternatif (AS) est un mécanisme qui module l'expression des gènes en ajoutant ou en supprimant des domaines protéiques, en affectant l'activité des protéines ou en modifiant la stabilité des transcrits d'ARNm (22, 23). Fait intéressant, l'abondance de la protéine MDM4 dans les CES diminue lors de l'exposition à des agents endommageant l'ADN, et cette régulation négative est au moins en partie due à la SA. Par exemple, une diminution du taux d'épissage de deux introns «détenus» flanquant l'exon 6 et la rétention nucléaire ultérieure du transcrit non épissé régulent négativement MDM4 (24). De plus, nous avons précédemment démontré que les défauts d'efficacité d'épissage constitutif diminuent Mdm4 inclusion de l'exon 6, conduisant à la production d'un transcrit instable appelé Mdm4-S (manquant l'exon 6 chez l'homme ou l'exon 7 chez la souris), qui contient un codon de terminaison prématurée (25) et est ciblé pour la désintégration induite par le non-sens (NMD) (26). Enfin, des embryons de souris homozygotes conçus pour sauter Mdm4 l'exon 7 meurt in utero, tout comme Mdm4-embryons nuls, à la suite de l'activation ectopique de p53 (27). Ces données soulèvent la possibilité que l'homme MDM4 exon 6/exon de souris 7 fonctionne comme un exon « commutateur NMD » (24) et que la régulation de cet événement d'épissage peut avoir un impact direct sur les niveaux d'expression de la protéine MDM4.

En conséquence, nous démontrons ici que l'AS de l'exon 6 est le principal régulateur post-transcriptionnel de l'abondance de la protéine MDM4 dans les conditions physiologiques et le cancer. De plus, nous proposons une approche thérapeutique alternative au ciblage de MDM4 basée sur l'utilisation d'oligonucléotides antisens (ASO) qui réduisent l'abondance de la protéine MDM4 plutôt que sa capacité à interagir avec p53. Nous fournissons des preuves que cette stratégie cliniquement compatible a des effets antitumoraux robustes et est applicable à un large éventail de tumeurs humaines.

Mdm4 est épissé de manière improductive dans la plupart des tissus adultes normaux et dans les CSE différenciées. Pour tester si AS contribue à la régulation de l'abondance de la protéine MDM4 dans des conditions physiologiques, nous avons mesuré l'étendue de l'inclusion de l'exon 7 (correspondant à l'exon 6 chez l'homme) dans des tissus embryonnaires et divers tissus adultes normaux de souris. Afin de le faire avec précision, nous avons développé des méthodes quantitatives basées sur la PCR (basées sur la qPCR), qui sont illustrées dans le matériel supplémentaire de la figure 1, A et B disponible en ligne avec cet article doi:10.1172/JCI82534DS1. Comme prévu, alors que la protéine MDM4 était détectable dans les tissus embryonnaires, elle était indétectable dans la plupart des tissus adultes, à l'exception du cerveau, du thymus et du côlon (2). Remarquablement, cette diminution de l'expression de la protéine MDM4 s'est accompagnée d'un pourcentage réduit d'épissage (PSI), défini comme le pourcentage de pleine longueur Mdm4 ARNm (Mdm4-FL) sur le total de toutes les isoformes [Mdm4-FL/(Mdm4-FL + Mdm4-S)] (Figure 1A et Figure 1C supplémentaire). Ainsi, par rapport aux tissus embryonnaires, il y avait une nette diminution des taux de protéine MDM4 dans la plupart des tissus adultes normaux, et cette diminution était, dans l'ensemble, associée à une augmentation concomitante de Mdm4-S expression. Ces données indiquent que les faibles niveaux d'expression de MDM4 dans la plupart des tissus adultes sont une conséquence de l'inclusion inefficace de l'exon 7. Notez que cette corrélation n'est pas parfaite en effet, bien que l'indice PSI était relativement élevé dans le foie, la protéine MDM4 n'était pas détectable. Cette observation indique que, dans une minorité de cas, d'autres événements post-transcriptionnels (stabilité de l'ARNm, taux d'exportation ou de traduction) ou post-traductionnels peuvent également contribuer à la régulation de l'abondance de la protéine MDM4. De plus, la valeur prédictive de l'indice PSI est particulièrement limitée dans les tissus normaux en raison de la dégradation importante de la Mdm4-S isoforme par les machines NMD ( 26 ).

Épissage improductif de Mdm4 conduit à une réduction de l'abondance des protéines dans la plupart des tissus adultes normaux et des CSE différenciées. (UNE et B) analyses qPCR de Mdm4-FL et Mdm4-S isoformes dans les tissus embryonnaires de souris (E14.5) et adultes (UNE) et dans les CSEM exposés à la PR (B). La quantification de l'indice PSI à l'aide d'une qPCR basée sur le SYBR Green dans les divers échantillons est indiquée dans les panneaux supérieurs. L'analyse par immunotransfert des niveaux d'expression de MDM4 dans les mêmes échantillons est présentée dans les panneaux inférieurs. Un immunoblot anti-GAPDH a été utilisé comme témoin de charge. (C) Graphique de corrélation entre l'indice PSI (défini comme le pourcentage de Mdm4 ARNm (Mdm4-FL), qui comprend l'exon 7, sur le total de toutes les isoformes [Mdm4-FL/(Mdm4-FL + Mdm4-S)] et l'abondance des protéines MDM4, normalisées pour le contrôle de la charge protéique dans les mESCs lors de la différenciation induite par la PR.

La protéine MDM4 est fortement exprimée dans les mESC et son expression diminue considérablement lors de l'exposition à l'agent favorisant la différenciation RA (8). Le mécanisme à l'origine de cette diminution n'a pas été élucidé. Fait intéressant, nous avons constaté que, alors que le total Mdm4 Les niveaux d'ARNm sont restés globalement inchangés, l'indice PSI était parallèle à la diminution des niveaux de protéine MDM4 induite par le traitement RA (Figure 1, B et C, et données non présentées). Ces données indiquent que les niveaux de protéine MDM4 sont également sous le contrôle d'un commutateur dans l'épissage de l'exon 7 dans ces conditions expérimentales.

L'inclusion améliorée de l'exon 6 conduit à l'expression de MDM4 dans le mélanome humain. Nous avons ensuite estimé que des niveaux élevés d'expression de la protéine MDM4 dans les cellules cancéreuses peuvent être dus, au moins en partie, à leur capacité à rétablir l'équilibre entre le saut et l'inclusion de l'exon 6. De manière cohérente, l'analyse in silico du séquençage de l'ARN (RNA-seq ) les données d'échantillons de mélanome cutané cutané (SKCM) (de The Cancer Genome Atlas [TCGA]) fournissent la preuve que le transcrit complet codant pour la protéine est produit dans la majorité de ces échantillons. Deux supplémentaires MDM4 des isoformes ont également été détectées, parmi lesquelles MDM4-S est de loin le plus abondant (Figure 2A). Les données précédentes indiquent qu'environ 65% des mélanomes cutanés expriment des niveaux élevés de protéine MDM4 (13). Étant donné que 65% de la cohorte de mélanomes TCGA (pour laquelle des données ARN-seq sont disponibles) présentent un indice PSI supérieur à 0,4, nous avons défini cette valeur comme point de coupure, divisant les échantillons en exprimeurs MDM4 et non-expresseurs (Figure 2B). Notamment, la fréquence des mutations faux-sens inactivant p53 (28) était plus faible dans les échantillons censés exprimer MDM4 (4,6 %) que dans les échantillons non-expresseurs (9,3 %). Cela est cohérent avec les observations précédentes selon lesquelles un faible indice PSI est associé à l'inactivation des mutations p53 ou à la surexpression de MDM2 (29). Cependant, cela indique également la présence dans certains cancers de mutations inactivant p53 dans des échantillons exprimant MDM4, une observation qui est cohérente avec les fonctions oncogènes indépendantes de p53 de MDM4.

L'inclusion améliorée de l'exon 6 conduit à l'expression de MDM4 dans le mélanome humain. (UNE) Les arches représentent l'utilisation relative de la jonction exon-exon qui a été moyennée parmi les échantillons de mélanome TCGA-SKCM et déduite des données RNA-seq. Parmi tous ceux précédemment identifiés MDM4 isoformes (base de données RefSeq du NCBI), MDM4-FL en bleu et MDM4-S en rouge étaient de loin les plus abondants. MDM4-A (manquant l'exon 9, NM_001204171) en vert a également été détecté, mais en quantités négligeables. Les autres isoformes annotées NCBI n'étaient pas détectables. Chr., chromosome. (B) L'indice PSI pour tous les échantillons de tumeurs TCGA SKCM a été calculé, trié et tracé. Une coupure dans la fraction supérieure de 65 % indique un PSI MDM4 valeur de 0,4. Les triangles rouges indiquent les échantillons avec une mutation confirmée inactivant p53 selon Kato et al. ( 28 ). (C, E, et F) Analyses qPCR semi-quantitatives et basées sur SYBR Green du total MDM4, MDM4-FL, et MDM4-S isoformes dans les cellules de mélanome en culture (C), dans une série de cultures de mélanome à court terme (E), et dans des échantillons cliniques de mélanome (F). GAPDH les niveaux ont été utilisés comme contrôle de charge. La quantification de l'indice PSI est indiquée dans les panneaux supérieurs. L'analyse par immunotransfert des niveaux d'expression de MDM4 est présentée dans les panneaux inférieurs. Des immunoblots anti-tubuline et anti-actine ont été utilisés comme témoins de charge. *, désigne des lésions de mélanome mutantes TP53. () Graphique de corrélation entre l'indice PSI et l'abondance de la protéine MDM4, normalisée par rapport au contrôle de la charge protéique, dans les lignées cellulaires de mélanome.

Nous avons ensuite mesuré l'étendue de l'inclusion de l'exon 6 dans plusieurs lignées cellulaires de mélanome humain (figure 2C). En accord avec notre prédiction, les lignées cellulaires de mélanome (m = 10) avec un indice PSI inférieur à 0,4 exprimé des niveaux très faibles à indétectables de MDM4 (Figure 2C). Comme prévu, aucune corrélation entre le total MDM4 Les niveaux d'ARNm et l'abondance des protéines ont été observés, tandis qu'une corrélation frappante a été observée entre l'indice PSI et l'abondance des protéines MDM4 (Figure 2, C et D). Pour étayer davantage les résultats ci-dessus, nous avons quantifié l'indice PSI et l'abondance des protéines dans des cultures de mélanome à court terme et des échantillons cliniques de mélanome fraîchement isolés (m = 20 Figure 2, E et F). Encore une fois, nous avons observé une corrélation claire entre l'indice PSI et les niveaux de protéines MDM4 (Figure supplémentaire 2, A et B). De plus, en accord avec la prédiction ci-dessus, les échantillons avec un indice PSI inférieur à 0,4 ont exprimé des niveaux très faibles à indétectables de MDM4 (Figure 2, E et F).

Prises ensemble, ces données indiquent que la régulation de l'inclusion de l'exon 6 est un déterminant essentiel de l'abondance de la protéine MDM4 des mammifères dans les tissus normaux et les cellules tumorales. Cela soulève la possibilité intrigante que l'épissage alternatif soit un mécanisme clé par lequel MDM4 est régulé à la hausse pour tamponner p53 dans les tissus embryonnaires hautement prolifératifs et les cellules cancéreuses. Les données indiquent également que l'indice PSI est un bon prédicteur de l'abondance de la protéine MDM4 dans le mélanome.

SRSF3 est nécessaire pour une inclusion efficace de l'exon 6 de MDM4. Afin d'identifier les régulateurs de MDM4 l'épissage de l'exon 6, nous avons extrait les données de séquençage à haut débit d'ARN disponibles isolées par des ensembles de données d'immunoprécipitation croisée (HITS- et PAR-CLIP) (30-35). Quatre membres de la famille SR ont été identifiés comme des régulateurs putatifs de cet événement d'épissage dans les cellules de souris (Figure supplémentaire 3A). Étant donné que la région génomique entourant l'exon 6 humain est hautement conservée chez les vertébrés (voir le graphique de conservation phyloP dans la figure supplémentaire 3A), nous avons tenté de tester si cette famille de facteurs d'épissage module l'inclusion de l'exon 6 dans les cellules humaines. Nous avons épuisé SRSF1-12 individuellement avec des ARNsh dans les cellules de mélanome A375 et quantifié l'indice PSI (figure 3A).Étonnamment, l'épuisement de SRSF3 induit de manière robuste MDM4 l'exon 6 saute. En revanche, KD de SRSF7, SRSF9 et SRSF11 a augmenté de manière inattendue l'inclusion de l'exon 6. Ces données indiquent que l'épissage alternatif de MDM4 est fortement régulé par de multiples facteurs d'épissage, qui, selon nous, permettent l'intégration de plusieurs signaux de régulation en amont.

SRSF3 est nécessaire pour une inclusion efficace de MDM4 exon 6 et croissance du mélanome. (UNE) PSI MDM4 indice relatif au shRNA non ciblé (Scr) calculé sur la protéine SR shRNA KD dans les cellules de mélanome humain A375. Chaque barre représente un seul shRNA ciblant le membre de la famille SRSF indiqué (y compris les détails de 2 contrôles brouillés indépendants sont fournis dans le tableau supplémentaire 4). Les données représentent la moyenne ± SD de 3 répétitions biologiques, et la qPCR a été exécutée en 2 répétitions techniques. Un non apparié t test a été utilisé pour évaluer les différences statistiques dans UNE (La signification statistique unilatérale a été déterminée à l'aide de la méthode Holm-Sidak, avec = 5 000 %). (B) Les sites de liaison des données CLIP-seq de souris SRSF3 ont été alignés avec BLAT sur le génome humain. Les amorces RIP ont été conçues pour s'enrichir pour une région amont témoin négatif (jaune) et pour la région de liaison à SRSF3 (vert). Le RIP a été réalisé sur des cellules A375 (panneau de droite). SRSF3 l'exon 4 a été utilisé comme contrôle positif (bleu). SS, site d'épissure. (C) PSI MDM4 les indices et les niveaux de protéines MDM4 (Western blot, en bas) ont été évalués après SRSF3 KD avec 5 shRNA indépendants. Un shRNA brouillé a été utilisé comme témoin. () qPCR quantification du total MDM4, SRSF3, et les cibles transcriptionnelles p53 (MDM2, p21, et BBC3) suivant SRSF3 KD avec 5 shRNA indépendants. Un shRNA brouillé a été utilisé comme contrôle de référence. Les données représentent la moyenne ± SD. (E) Quantification de la viabilité cellulaire (panneau supérieur) et de l'apoptose (panneau inférieur) sur SRSF3 KD à l'aide de 2 shRNA indépendants (171 et 227) dans des cellules A375 (voir également le tableau supplémentaire 4). Les données représentent la moyenne ± SD de 2 répétitions biologiques.

Conformément à sa capacité putative à promouvoir MDM4 inclusion de l'exon 6, SRSF3 est un oncogène bien établi (36). SRSF3 autorégule également son expression en modulant l'inclusion de son propre exon 4 (30). Comme décrit ci-dessus, une corrélation frappante entre l'indice PSI et l'abondance de la protéine MDM4 a été observée dans une série de cultures de mélanome à court terme (figure 2E). Conformément au fait que SRSF3 est un modulateur de MDM4 AS, une activité élevée de SRSF3, déterminée par l'étendue de l'inclusion autorégulatrice de l'exon 4, est corrélée avec des niveaux élevés d'expression de la protéine MDM4 dans ces échantillons (Figure supplémentaire 3B).

Nous avons en outre validé la liaison directe de SRSF3 humain à MDM4 par immunoprécipitation d'ARN (RIP) (réf. 30 et figure 3B) et a démontré de manière critique que l'extinction de SRSF3, à l'aide de 5 épingles à cheveux shRNA indépendantes, a entraîné une diminution significative de l'inclusion de l'exon 6 et une diminution concomitante des niveaux de protéine MDM4 (figure 3C). La régulation négative de MDM4 que nous avons observée sur SRSF3 KD s'est accompagnée d'une activation robuste de la voie p53, comme en témoigne une augmentation de l'expression de certains de ses gènes cibles bien établis, notamment p21, MDM2 et BBC3 (ou PUMA), au niveau de l'ARNm. et/ou les niveaux de protéines (Figure 3, C et D). Nous avons également observé une forte diminution de la croissance et de l'induction de la mort cellulaire apoptotique dans les cellules SRSF3-KD (figure 3E)

Notamment, la surexpression de SRSF3 seule n'était pas suffisante pour augmenter l'inclusion de l'exon 6 de manière significative (Figure supplémentaire 3C). Des amplificateurs d'épissage supplémentaires peuvent donc également contribuer et/ou aider SRSF3 à promouvoir l'inclusion de cet exon.

Néanmoins, l'observation selon laquelle le silençage de SRSF3 a provoqué une diminution de l'inclusion de l'exon 6 est cohérente avec nos conclusions précédentes selon lesquelles l'inhibition des protéines kinases CLK SR par la petite molécule TG003 (37) a entraîné une diminution similaire de l'abondance de la protéine MDM4 dans les deux tiges neurales de souris. cellules et progéniteurs et dans plusieurs autres lignées cellulaires cancéreuses humaines (26). Conformément à ces résultats, TG003 a conduit à des effets similaires dans les lignées cellulaires de mélanome (figure supplémentaire 3D) et a réduit leurs taux de survie (figure supplémentaire 3E). Fait intéressant, TG003 a sensibilisé les cellules de mélanome mutantes BRAFV600E à l'inhibiteur de BRAFV600E vemurafenib (PLX4032) (Figure supplémentaire 3F). De plus, alors que TG003 réduisait l'indice PSI (figure supplémentaire 3G) et la survie cellulaire (figure supplémentaire 3H), il induisait simultanément une activité transcriptionnelle de p53 (figure supplémentaire 3I) dans les lignées cellulaires sensibles au vemurafenib (M249) et résistantes (M249R) ( 38 ).

Dans l'ensemble, l'inactivation pharmacologique et génétique de SRSF3 est compromise MDM4 inclusion de l'exon 6, conduisant ainsi à l'activation de p53. Cela s'accompagnait systématiquement d'une diminution de la croissance et de la survie du mélanome. Cependant, étant donné que SRSF3 cible plusieurs événements d'épissage pro-oncogènes (36), il est peu probable que cet effet soit causé uniquement par une diminution de MDM4 inclusion de l'exon 6.

Le saut de l'exon 6 médié par l'ASO diminue efficacement l'abondance de MDM4 et la croissance du mélanome. Afin de cibler plus spécifiquement l'inclusion de l'exon 6, nous avons conçu un morpholino ASO à commutation d'épissage flanquant les limites exon-intron de l'exon 6 (ASO MDM4) et chevauchant l'un des sites de liaison de SRSF3 (figure 3B). La transfection d'une série de lignées cellulaires de mélanome exprimant MDM4 et de cultures à court terme avec ASO MDM4, mais pas avec un contrôle ASO non ciblé/brouillé, a conduit à un saut efficace de l'exon 6 et à une diminution subséquente de l'abondance de la protéine MDM4 (Figure 4, A et B). Notamment, l'événement de saut d'exon était stable jusqu'à 8 jours après la transfection (Figure supplémentaire 4A). L'exon 6 induit par l'ASO sautant l'activité de p53 déchaînée, comme en témoigne une augmentation de l'expression de ses gènes cibles bien établis p21 et MDM2 (Figure 4A). En conséquence, ASO MDM4 a diminué la capacité des cultures de mélanome TP53 WT à croître in vitro (figure 4B et figure supplémentaire 4B). Il est intéressant de noter que la lignée de mélanome mutante TP53 L194R MM087 présentait également une formation de colonies réduite lors de l'exposition à l'ASO MDM4. Ce résultat est conforme à la notion récente selon laquelle MDM4 peut posséder, au moins dans certains contextes spécifiques, des activités oncogènes indépendantes de p53.

Le saut de l'exon 6 médié par l'ASO diminue l'abondance de la protéine MDM4 et la croissance du mélanome in vitro. (UNE) Analyse semi-qPCR du total MDM4-FL et MDM4-S isoformes (avec GAPDH comme contrôle) dans les cellules de mélanome A375 transfectées avec MDM4-ciblage (ASO MDM4) et les ASO de contrôle brouillés. Les panneaux inférieurs montrent l'analyse par immunoblot des niveaux d'expression de MDM4, p53 et les 2 cibles p53 bien établies MDM2 et p21. Un immunoblot anti-tubuline a été utilisé pour détecter les différences dans le chargement des échantillons. (B) Les cultures à court terme ont été transfectées avec MDM4-le ciblage et les ASO témoins brouillés, et la formation de colonies a été évaluée à l'aide d'essais de formation de colonies à faible densité 10 jours après l'ensemencement. Pour la quantification des tests de formation de colonies, les données représentent le pourcentage moyen d'occupation de la zone de 2 répétitions biologiques (moyenne ± SD). Le panneau inférieur montre l'analyse par immunoblot des niveaux d'expression de MDM4. Un immunoblot anti-actine a été utilisé pour détecter les différences dans le chargement des échantillons. Le panneau de droite montre l'analyse qPCR basée sur SYBR Green du PSI MDM4 index après transfection avec les ASO. *, Lésions de mélanome mutant TP53.

Bien que nous ayons sélectionné un squelette morpholino pour nos études in vitro et in vivo ultérieures, nous avons également testé une chimie de squelette alternative, compte tenu des récents succès des ASO du squelette phosphorothioate en clinique (39). Comme démontré précédemment pour d'autres cibles (40), l'induction de MDM4 Le saut de l'exon 6 ne dépend pas de la chimie de l'ASO, mais plutôt de la position de sa séquence de ciblage, car les ASO du squelette 2-OMe/phosphorothioate les plus efficaces ciblent le site donneur 5' et se chevauchent avec un site de liaison SRSF3, de manière similaire à ce qui a été observé avec le morpholino ASO MDM4 (Figure supplémentaire 4C).

Un nombre croissant de preuves a montré que MDM4 possède également des fonctions oncogènes indépendantes de p53 (2, 18 – 21). Étant donné que le saut de l'exon 6 médié par ASO affecte directement l'abondance de MDM4, et non sa capacité à interagir avec p53, cette approche devrait également avoir un impact sur la croissance des cellules de mélanome mutantes TP53 exprimant MDM4. En conséquence, la croissance des cultures de mélanome à court terme de l'échantillon de patient MM087 était considérablement réduite lorsqu'elles étaient exposées à l'ASO ciblant l'exon 6 (Figure 4B et Figure 4B supplémentaire).

Le saut de l'exon 6 de MDM4 médié par l'ASO diminue la croissance du mélanome in vivo. Ensemble, les données ci-dessus indiquent que le saut d'exon 6 médié par ASO est une stratégie thérapeutique anti-mélanome prometteuse. Pour tester l'applicabilité in vivo de cette approche, nous avons établi des modèles de xénogreffes dérivées de patients (PDX) de mélanome et sélectionné trois de ces modèles (MEL002, MEL010 et MEL006) pour d'autres expériences sur la base de leurs niveaux détectables d'expression de la protéine MDM4. (données non présentées et figure 5B) des données cliniques supplémentaires concernant ces patients sont fournies dans le tableau supplémentaire 1. Lorsque les tumeurs ont atteint un volume moyen de 150 à 200 mm 3 , les cohortes MEL002 ont été traitées avec le MDM4 ASO (ou contrôle brouillé) qui a été lié de manière covalente à une fraction d'administration composée d'un dendrimère octa-guanidine ("vivo morpholino") par des injections intratumorales (it) tous les 2 jours. Le développement tumoral a été surveillé dans les deux cohortes pendant une période de 16 jours. A la fin des expériences, les tumeurs ont été disséquées et traitées pour des analyses histologiques et biochimiques.

Le saut de l'exon 6 médié par l'ASO diminue l'abondance de la protéine MDM4 et la croissance du mélanome in vivo. (UNEF) Des cohortes de modèles PDX de mélanome (MEL002 et MEL010) ont été établies. Lorsque les tumeurs atteignaient un volume moyen de 100 mm 3 (MEL002) ou 150 mm 2 (MEL010), les cohortes ont été traitées avec le morpholino vivo MDM4 (ou contrôle brouillé) sur i.t. injections tous les 2 jours (MEL002 i.t.) ou i.v. injections dans la veine caudale tous les 2 jours (MEL010 i.v.). Développement tumoral de MEL002 (UNE) et MEL010 (E) a été contrôlée par mesure au pied à coulisse pendant la période indiquée. Les données représentent la moyenne ± SEM des différentes répliques biologiques. Une ANOVA à deux facteurs a été utilisée pour déterminer la signification statistique dans UNE et E. (B) Le saut de l'exon 6 médié par l'ASO a diminué l'abondance de la protéine MDM4 dans les lésions MEL002. Analyse semi-quantitative de MDM4-FL et MDM4-S isoformes dans 12 lésions de mélanome disséquées exposées au MDM4-ASO de ciblage ou de contrôle brouillé. Le panneau supérieur montre la qPCR basée sur le SYBR Green de l'indice PSI dans les différents échantillons. Le panneau inférieur montre l'analyse par immunoblot des niveaux d'expression de MDM4. Un immunoblot anti-actine a été utilisé pour détecter les différences dans le chargement des échantillons. Une réduction des niveaux de protéine MDM4 a été confirmée par coloration IHC sur les lésions exposées à la MDM4-ASO de ciblage et de contrôle brouillé pour MEL002 (C) et MEL010 (F). L'IHC a également été réalisée pour le marqueur apoptotique caspase clivée 3 et le marqueur prolifératif Ki67 dans les lésions de mélanome exposées à la MDM4-ASO de ciblage et de contrôle brouillé pour MEL002 (C) et MEL010 (F). Barres d'échelle : 100 m. () Quantification (moyenne ± SD) de l'IHC pour les images présentées dans C. Trois images de 2 tumeurs différentes ont été analysées pour chaque cohorte.

Nous avons observé une réduction significative de la croissance tumorale dans les échantillons de mélanome exposés à l'ASO ciblant l'exon 6 (Figure 5A). Étonnamment, alors que l'expression de l'isoforme codant pour la protéine était prédominante dans toutes les lésions exposées à l'ASO brouillé, nous avons observé un changement spectaculaire vers l'expression de la MDM4-S isoforme dans tous les échantillons de mélanome exposés à l'ASO ciblant l'exon 6 (Figure 4D). Ce changement a conduit à une forte diminution de l'expression de la protéine MDM4 (Figure 5, A–D). L'examen histologique et les analyses IHC ont attribué cet effet sur la croissance tumorale à une diminution significative de la prolifération cellulaire, comme en témoigne une diminution frappante des cellules Ki67-positives qui s'accompagnait d'une augmentation de la mort cellulaire par apoptose (Figure 5, C et D). Parallèlement, la perte de la protéine MDM4 avec le traitement MDM4 ASO a stimulé la signalisation p53 avec la régulation positive de gènes activés par p53 comme MDM2 et p21 et la régulation à la baisse des gènes réprimés par p53 comme KIF23, CENPF, et MAD2L1 (Figure supplémentaire 4D).

De plus, la livraison du MDM4 ASO par i.v. des injections tous les 2 jours ont également diminué la croissance tumorale dans un autre modèle PDX de mélanome (MEL010 Figure 5E). À proximité des vaisseaux sanguins, cette diminution s'accompagnait également d'une réduction mesurable des niveaux d'expression de la protéine MDM4, d'une prolifération cellulaire réduite et d'une augmentation de la mort cellulaire par apoptose (Figure 5, E et F).

Collectivement, ces données mettent en évidence le potentiel pharmacologique in vivo de cette approche pour le traitement du mélanome.

Le saut de l'exon 6 du MDM4 médié par l'ASO sensibilise le mélanome à l'inhibition de BRAFV600E. La gestion de la résistance intrinsèque aux inhibiteurs de ciblage de MAPK est susceptible d'être réalisée grâce à des modalités thérapeutiques qui ciblent simultanément plusieurs voies. Il est important de noter que le ciblage de l'interaction MDM4-p53 à l'aide d'un peptide agrafé sensibilise les cellules de mélanome à l'inhibition de BRAFV600E (13), le saut de l'exon 6 médié par ASO a augmenté la sensibilité des cellules de mélanome mutantes BRAFV600E cultivées à l'inhibiteur de BRAFV600E vemurafenib (Figure 6A).

Le saut de l'exon 6 médié par l'ASO sensibilise les cellules de mélanome aux inhibiteurs de BRAFV600E in vitro et in vivo. (UNE) Une culture à court terme BRAFV600E-positive (MM034) a été transfectée avec MDM4-le ciblage et les ASO témoins brouillés, et la formation de colonies ont été évaluées à l'aide d'essais de formation de colonies à faible densité 10 jours après l'ensemencement et l'exposition à 25 nM de l'inhibiteur BRAFV600E PLX4032. Le panneau de droite montre la quantification des tests de formation de colonies. Les données sont présentées en pourcentage de la superficie occupée. (B) Des cohortes du modèle PDX de mélanome (MEL006) ont été établies. Lorsque les tumeurs atteignaient un volume moyen de 200 mm 3 , elles étaient subdivisées en cohortes pour divers traitements combinatoires. Les souris ont été gavées avec du dabrafenib ou un véhicule tous les jours et injectées i.t. avec ASO brouillé ou MDM4 ASO tous les deux jours. (B) Le développement tumoral a été surveillé par mesure au pied à coulisse pendant la période indiquée. Les données représentent la moyenne ± SEM des répétitions biologiques indiquées. Une ANOVA à deux facteurs a été utilisée pour déterminer la signification statistique dans B. La ligne pointillée rouge indique le volume de départ moyen des tumeurs dans la cohorte MDM4 ASO plus BRAFi. (C) IHC pour MDM4, le marqueur apoptotique clivé la caspase 3 et le marqueur prolifératif Ki67 dans les lésions de mélanome exposées au traitement combiné de l'exon 6 à base d'ASO sautant avec BRAFi. Barre d'échelle : 100 m. () Quantification (moyenne ± SD) de l'IHC pour laquelle des images représentatives sont présentées dans C. Pour chaque tumeur, 3 lames ont été colorées et comptées. Les deux cohortes contenaient chacune 4 tumeurs différentes (m = 12 lames comptées). (E) Le modèle PDX MEL006 a été traité avec BRAFi seul (m = 1), BRAFi plus ASO brouillé (m = 1), ou BRAFi plus MDM4 ASO (m = 2). Les données représentent la moyenne ± SD.

Nous avons étendu cette analyse en co-traitant des cohortes de MEL006, un modèle PDX de mélanome BRAFV600E-mutant (Tableau supplémentaire 1), avec l'inhibiteur BRAFV600E dabrafenib quotidiennement et un i.t. injection du MDM4 morpholino tous les deux jours pendant 14 jours. Il est important de noter que, alors que la croissance tumorale n'a été inhibée qu'après une exposition à l'inhibiteur BRAFV600E dabrafenib seul, une régression tumorale robuste a été observée dans la cohorte MEL006 PDX traitée avec le dabrafenib et le MDM4 ASO (Figure 6B), et cela était au moins en partie dû à une augmentation mesurable dans la mort cellulaire apoptotique (Figure 6, C et D). Encore plus intéressant, alors que les souris ont acquis une résistance à l'inhibiteur de BRAFV600E dans les 20 jours suivant l'exposition, 2 des 2 souris traitées avec la combinaison de dabrafenib et de MDM4 ASO ne l'ont pas fait (figure 6E). Ces observations soulèvent la possibilité passionnante que le ciblage de MDM4 médié par l'ASO pourrait être une stratégie valable pour retarder de manière significative - et / ou éventuellement supprimer - l'acquisition de la résistance aux traitements avec les inhibiteurs BRAFV600E seuls. Notamment, les souris traitées au dabrafenib-MDM4 ASO n'ont pas souffert de perte de poids au cours de l'expérience, contrairement aux souris traitées avec une combinaison de dabrafénib et de trametinib, un inhibiteur de MEK (données non présentées). De plus, l'examen histopathologique complet des souris exposées à l'association dabrafénib-MDM4 ASO n'a révélé aucun événement indésirable pertinent. En revanche, nous avons observé que les souris traitées avec l'association dabrafénib-tramétinib souffraient des effets indésirables bien documentés associés à ce traitement chez l'homme, notamment des lésions rénales sévères (41).

Le ciblage MDM4 médié par ASO est une stratégie thérapeutique applicable à plusieurs types de tumeurs. Notre estimation de la proportion de tumeurs humaines exprimant la protéine MDM4 est principalement basée sur des mesures effectuées au niveau total d'ARNm (10, 11). Afin de réviser ces chiffres, et puisque nous avons constaté que l'indice PSI est un prédicteur beaucoup plus fiable des niveaux de protéines MDM4 que le total MDM4 ARNm dans le mélanome, nous avons déterminé ce rapport dans des centaines de tumeurs humaines de différents types en utilisant des ensembles de données ARN-seq accessibles au public (figure 7A et figure supplémentaire 5). Étonnamment, nous avons constaté que l'indice PSI était supérieur à 0,4 dans 85 % des échantillons de carcinome du sein (BRCA) (figure 7A). La prédiction de cette analyse est qu'environ 85 % du BRCA humain exprime la protéine MDM4, ce qui contraste fortement avec les 20 % déduits des mesures d'ARNm et en accord avec la large surexpression de la protéine MDM4 observée dans les lignées cellulaires du cancer du sein (42). Une analyse similaire prédit que le MDM4 est exprimé, par exemple, dans 57 %, 62 % et 72 % des cystadénocarcinomes séreux de l'ovaire (OV), des carcinomes épidermoïdes de la tête et du cou (HNSC) et des adénomes du côlon (COAD), respectivement (Figure 7A et Figure supplémentaire 5). Il est important de noter que la croissance des lignées cellulaires cancéreuses TP53 WT n'exprimant pas le mélanome, telles que la lignée cellulaire de cancer du sein MCF7, la lignée cellulaire de neuroblastome SK-N-SH et la lignée cellulaire de cancer de l'ovaire Tov21G, a été fortement inhibée lors de l'exposition à le MDM4 ASO (Figure 7B et Figure supplémentaire 6).

La stratégie thérapeutique MDM4 médiée par ASO est applicable à plusieurs types de tumeurs. (UNE) Le PSI MDM4 l'indice a été calculé, de manière similaire à ce qui est décrit dans la figure 2B, pour BRCA, OV et DLBCL. Pour chaque type de tumeur, toutes les valeurs ont été triées et tracées. La zone rouge indique les spécimens de tumeur avec un PSI MDM4 supérieur à 0,4. Le pourcentage total d'échantillons de tumeurs dans cette zone est indiqué dans le coin supérieur gauche. (B) Le saut de l'exon 6 médié par l'ASO a réduit la formation de colonies in vitro de divers types de cancer. Des lignées cellulaires de cancer du sein MCF7, de neuroblastome SK-N-SH et de cancer de l'ovaire Tov21G ont été transfectées avec MDM4-le ciblage et les ASO témoins brouillés, et la formation de colonies a été évaluée à l'aide d'essais de formation de colonies à faible densité 10 jours après l'ensemencement. Les graphiques montrent la quantification des tests de formation de colonies. Les données sont présentées sous forme de pourcentage moyen de surface occupée pour 2 répétitions biologiques (± SD). L'analyse par immunotransfert des niveaux d'expression de la protéine MDM4 est présentée ci-dessous.

Pour tester si le ciblage de MDM4 médié par ASO est une approche thérapeutique applicable aux tumeurs autres que le mélanome dans un contexte in vivo, nous avons établi un modèle PDX de lymphome diffus à grandes cellules B (DLBCL BCL13). Les données cliniques sur les patients dont le modèle a été dérivé sont fournies dans le tableau supplémentaire 1. Nous avons d'abord cultivé des cellules DLBCL primaires à partir de ce modèle et établi que l'ASO MDM4 réduisait la viabilité des cellules DLBCL in vitro (figure 8A). Lorsque les tumeurs ont atteint un volume moyen de 150 à 200 mm 3 , nous avons injecté de l'ASO MDM4 (ou contrôle brouillé) i.t. tous les 2 jours, et le développement tumoral a été surveillé pendant une période de 20 jours. A la fin des expériences, les tumeurs ont été disséquées et traitées pour des analyses histologiques et biochimiques.

Le saut de l'exon 6 médié par MDM4 ASO réduit la croissance du DLBCL in vivo et in vitro. (UNE) Panneau de gauche : analyse du titre cellulaire d'un échantillon clinique de DLBCL (BCL13) 3 jours après transfection avec MDM4-ASO de ciblage et brouillés. Panneau de droite : analyse semi-qPCR de l'épissage MDM4. Les données représentent la moyenne ± SD de 2 répétitions (B) Des cohortes du modèle PDX de DLBCL (BCL13) ont été établies. Lorsque les tumeurs ont atteint un volume moyen de 150 à 250 mm 3 (BCL13), les cohortes ont été traitées avec le MDM4 ASO vivo (ou contrôle brouillé) lors de l'injection i.t. injections de BCL13 tous les 2 jours. La taille de la tumeur BCL13 a été évaluée à 20 jours. Les données représentent la moyenne ± SEM de 5 répétitions biologiques pour chaque cohorte. Un non apparié à 2 queues t test a été utilisé pour évaluer les différences statistiques dans B. (C) Le saut de l'exon 6 médié par l'ASO a diminué le PSI MDM4 index et abondance de la protéine MDM4 dans les tumeurs BCL13. Analyse semi-quantitative de MDM4-FL et MDM4-S isoformes dans 10 tumeurs DLBCL disséquées exposées au MDM4-ASO de ciblage ou de contrôle brouillé. Le panneau inférieur montre l'analyse par immunoblot des niveaux d'expression de MDM4. Un immunoblot anti-actine a été utilisé pour détecter les différences dans le chargement des échantillons. () IHC pour le marqueur apoptotique clivé caspase 3 et le marqueur prolifératif Ki67 dans les lésions DLBCL exposées au MDM4-ASO de ciblage et de contrôle brouillé. Les panneaux de droite montrent la quantification des images IHC montrées dans . Trois lames différentes provenant de 3 tumeurs différentes (m = 3) ont été analysés pour chaque cohorte, et les résultats sont présentés en moyenne ± SD. Barre d'échelle : 100 m.

Nous avons observé une réduction significative de la croissance tumorale chez les souris porteuses de DLBCL exposées à ASO MDM4 (figure 8B), et nous avons systématiquement observé une réduction des indices PSI et des niveaux de protéines MDM4 dans les lésions exposées à ASO MDM4 (figure 8C). Cela s'accompagnait d'une diminution significative de la prolifération cellulaire (réduction des cellules KI67-positives) et d'une augmentation de la mort cellulaire par apoptose (augmentation de la coloration de la caspase clivée 3) (figure 8D). Ensemble, ces données démontrent que la MDM4La stratégie thérapeutique ciblant, basée sur l'ASO, n'est pas seulement applicable au mélanome, mais peut être une approche clinique valable pour traiter un large éventail de types de tumeurs.

L'identification des mécanismes qui favorisent l'expression de l'oncoprotéine MDM4 accélérera le développement de thérapies ciblées anti-MDM4, qui devraient être actives contre un large éventail de cancers humains. Nous décrivons ici un rôle imprévu et répandu pour un mécanisme basé sur AS dans la conduite de la surexpression de MDM4. Nous montrons que MDM4 L'exon 6 est un exon « commutateur NMD » qui est ignoré dans la plupart des tissus adultes normaux, ce qui entraîne la production d'un transcrit qui est dégradé par NMD. En revanche, l'isoforme d'épissage codante est produite dans les cellules de mélanome (et d'autres cellules cancéreuses) à la suite d'une inclusion accrue de l'exon 6 (figure 9).

Cibler l'épissage MDM4 dans le traitement du cancer. Tandis que MDM4 est épissé de manière improductive dans la plupart des tissus adultes normaux, la protéine MDM4 est fortement exprimée dans les tissus embryonnaires et dans les cancers en raison de l'inclusion accrue de l'exon 6. SRSF3, parmi d'autres membres de la famille SRSF, est le seul qui favorise l'inclusion de l'exon 6. TG003 est un inhibiteur de la CLK qui affecte la phosphorylation de plusieurs protéines SR. Induire MDM4 Le saut de l'exon 6 via ASO est une approche très spécifique, efficace et cliniquement compatible pour inhiber les fonctions oncogènes MDM4 dépendantes de p53.

Dans les cellules non transformées, le MDM4-S l'isoforme est rapidement dégradée (26). Dans les cellules cancéreuses, cependant, l'efficacité de la voie NMD est souvent compromise (43, 44). De manière constante, nous avons constaté que MDM4-S était facilement détectable dans le mélanome, et l'inhibition de la NMD par le cyclohexamide n'a pas conduit à une augmentation constante de MDM4-S niveaux (données non présentées). Il est important de noter que des preuves antérieures indiquent que MDM4-S est traduit de manière inefficace (26) et que le peptide MDM4-S est hautement instable (26, 27, 45). Ensemble, ces observations fournissent une explication rationnelle de notre incapacité à détecter la protéine MDM4-S dans le mélanome ou d'autres cancers (données non présentées et réf. 45).

Mécaniquement, nous montrons que, bien que plusieurs protéines SR (46) puissent participer à la régulation de MDM4 AS, SRSF3 est un activateur clé de l'inclusion de l'exon 6 dans les cellules de mélanome. Conformément à cette idée, SRSF3 est un oncogène bien établi (36, 47). Il est directement régulé au niveau transcriptionnel par la signalisation Wnt (48), une voie souvent régulée à la hausse dans le cancer (49). À son tour, SRSF3 favorise plusieurs événements oncogènes de SA, tels que l'inclusion de l'exon 10 dans le gène de la pyruvate kinase M, générant l'isoforme PKM2, qui favorise la glycolyse aérobie dans les cellules cancéreuses (50). Nos données identifient donc ce que nous pensons être un nouveau mécanisme sous-jacent à la fonction oncogène de SRSF3, à savoir la régulation de MDM4 AS et, à son tour, la suppression de l'activité p53. Fait intéressant, SRSF3 peut également affecter directement p53 AS pour supprimer l'expression de l'isoforme p53β qui favorise la sénescence médiée par p53 (51).

Surtout, nous avons observé une corrélation frappante entre l'indice PSI et l'abondance de la protéine MDM4 dans la majorité des échantillons de mélanome analysés, indiquant que le commutateur d'épissage MDM4 est l'un des mécanismes clés qui explique la surexpression fréquente de MDM4 dans le mélanome. Il est à noter que la corrélation entre l'indice PSI et l'abondance de la protéine MDM4 n'était pas stricte, car nous avons identifié quelques échantillons de tissus normaux (c'est-à-dire le foie) et de mélanome (c'est-à-dire MM099) dans lesquels cette corrélation n'a pas pu être établie. Cela indique que d'autres mécanismes, post-transcriptionnels ou post-traductionnels, peuvent également contribuer à la régulation de l'expression de MDM4 dans une faible proportion de cas.

L'identification de ce mécanisme régulant les niveaux de protéine MDM4 dans le cancer a des implications thérapeutiques importantes. La restauration de la fonction suppresseur de tumeur WT p53 est une stratégie anticancéreuse attrayante et prometteuse, mais extrêmement difficile. Nous et d'autres avions précédemment démontré que le ciblage de l'interaction MDM4-p53 représente une opportunité thérapeutique unique et sûre pour réactiver la fonction supprimée de WT p53. Malheureusement, les petites molécules (ou peptides agrafés) qui perturbent de manière sélective et efficace les complexes MDM4-p53 n'ont jusqu'à présent pas été suffisamment développées pour les tests cliniques. La stratégie à cibler MDM4 L'AS décrit ici permet une manipulation spécifique de l'abondance de MDM4 plutôt que des interactions avec les protéines partenaires de MDM4 (figure 9). Nous montrons que cette approche a réactivé la fonction de p53 dans les cellules de mélanome TP53 WT et a efficacement supprimé leur croissance in vitro et in vivo. Surtout, le MDM4 La stratégie de ciblage AS est, en théorie, non seulement applicable au mélanome mais à tout cancer qui surexprime MDM4. En conséquence, nous montrons que la croissance de lignées cellulaires d'origines diverses (cancer du sein, neuroblastome, ovaire et DLBCL) est fortement inhibée lors de l'exposition à l'ASO MDM4.

De plus, parce que cette approche thérapeutique cible l'abondance de la protéine MDM4 plutôt que son interaction avec p53, cette approche peut, en principe, également être utilisée pour cibler les activités oncogènes indépendantes de p53 récemment décrites de MDM4 (figure 9). En conséquence, nous montrons ici que le ciblage de l'inclusion de l'exon 6 diminue la croissance d'une lignée cellulaire de mélanome mutante TP53 qui exprime des niveaux détectables de protéine MDM4. A noter cependant que les mélanomes cutanés hébergeant le mutant TP53 et exprimant des taux significatifs de la protéine MDM4 sont extrêmement rares (<3% des cas). La pertinence clinique de cette observation pour les patients atteints de mélanome est donc limitée. Cependant, nos résultats fournissent une preuve de concept que, en théorie, la stratégie thérapeutique décrite ici peut être applicable à un large spectre de tumeurs humaines, y compris celles abritant des mutations p53.

Notre compréhension actuelle de la proportion de tumeurs humaines exprimant des niveaux élevés de protéine MDM4 est principalement basée sur la quantification de l'ARNm total (10, 11). Cette approche a conduit, par exemple, à la conclusion que le MDM4 est exprimé dans environ 20 % des BRCA (9). Notre observation précédente selon laquelle les niveaux de protéine MDM4, mais pas d'ARNm, sont élevés dans 65% des échantillons de mélanome humain a soulevé la possibilité que les mesures d'ARNm total aient considérablement sous-estimé la fréquence des cancers exprimant MDM4. Notre analyse des ensembles de données publics RNA-seq TCGA, en utilisant l'indice PSI comme guide pour prédire la proportion d'échantillons exprimant MDM4, soutient en effet cette conclusion. La réévaluation de ces grands ensembles de données sous-tend la possibilité qu'un très grand nombre de patients atteints de cancer puissent bénéficier d'une MDM4-ciblage, stratégie thérapeutique basée sur l'ASO.

Ensemble, nos données indiquent qu'un large éventail de cellules cancéreuses favorise un événement d'épissage autrement spécifique à l'embryon (26) pour favoriser l'expression de l'oncoprotéine MDM4 (figure 9). La thérapie par saut d'exon médiée par l'ASO cible l'abondance de MDM4 plutôt que son interaction avec p53 et inhibe donc, en principe, à la fois les fonctions oncogènes dépendantes et indépendantes de p53 de MDM4 (figure 9). Étant donné que le bénéfice thérapeutique potentiel d'une série d'ASO est à l'étude dans divers essais cliniques ( 39 ) et que l'un de ces ASO, le mipomersen, a récemment été approuvé par la FDA ( 52 ), cette approche thérapeutique peut être rapidement et largement appliquée. à la clinique.

Les lignées cellulaires humaines HEK293T, Phoenix-Eco/Ampho, A375, MCF7 et SK-N-SH ont été obtenues auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC) et propagées selon les instructions du fournisseur. Les cellules UACC-62 (NCI-60) et Tov21G (CRL-117) ont été fournies par Igor Kurochkin (Bioinformatics Institute, Singapour) et Ruby Yun-Ju Huang (Cancer Science Institute, Singapour), respectivement. Des lignées cellulaires de mélanome (lignées MM) ont été cultivées dans du milieu F-10 (catalogue 11550-043 Gibco, Thermo Fisher Scientific), 10 % de FBS (Invitrogen) et 1 % de pénicilline/streptomycine (Sigma-Aldrich) et 12 ml de L-alanyl -glutamine (à partir du catalogue stock 200 mM 30-2115 ATCC)/500 ml de milieu total.

Les mESC ont été cultivées dans du DMEM (Life Technologies), 15 % de FBS, 1 × acides aminés non essentiels, 0,1 mM de β-mercaptoéthanol, 1 % de pénicilline/streptomycine et 1 000 U/ml de facteur inhibiteur de leucémie (LIF). Des fibroblastes embryonnaires de souris irradiés (6,3 Gy) ont été utilisés comme nourrisseurs. Pour la différenciation, les cellules ont été cultivées sur des boîtes recouvertes de 0,1% de gélatine dans du DMEM, 10% de FBS, 1 × acides aminés non essentiels, 0,1 mM de β-mercaptoéthanol, 1% de pénicilline/streptomycine et 1 M d'alltrans-RA pour les durées indiquées dans le Les figures.

Les produits chimiques suivants ont été utilisés : TG003 (catalogue T5575) et RA (catalogue R2625) (tous deux de Sigma-Aldrich) et PLX4032 (catalogue S1267 Selleckchem).

Les culots de culture cellulaire récoltés ont été remis en suspension dans un tampon de lyse des protéines (25 mM HEPES, pH 7,5, 0,3 M NaCl, 1,5 mM MgCl2, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 1 mM DTT, 1% Triton X-100, 10% glycérol, cocktail inhibiteur de phosphatase/protéase) incubé sur glace pendant 15 minutes et centrifugé 15 minutes à 4°C à 20 000 g. Des échantillons de tissus ont en outre été homogénéisés avec un homogénéisateur Precellys (Bertin Technologies) dans un tampon de lyse des protéines avant incubation sur glace. Des quantités égales de protéines (quantification Bradford) ont été traitées sur des gels NuPAGE Novex Bis-Tris à 4 % à 12 % (Thermo Fisher Scientific) et transférées sur une membrane de nitrocellulose avec un système de transfert à sec iBlot (Thermo Fisher Scientific). Le blocage membranaire (5 % lait/TBS 0,2 % Tween-20) a été suivi d'une incubation avec les Ac primaires appropriés et les Ac secondaires conjugués à HRP (Cell Signaling Technology). Les protéines ont été détectées par ECL et Western blot (Thermo Scientific). Les Abs utilisés sont répertoriés dans le tableau supplémentaire 2.

Les pastilles récoltées ont été remises en suspension dans QIAzol à l'aide d'un kit mRNeasy et traitées selon les instructions du fabricant (QIAGEN). Avant le traitement, les échantillons de tissus ont été homogénéisés avec un homogénéisateur Precellys dans QIAzol. L'ARN a été quantifié à l'aide d'un NanoDrop 1000 (Thermo Scientific) et 500 à 2 000 ng ont été rétrotranscrits avec un kit de transcription inverse d'ADNc à haute capacité (Life Technologies). Les qPCR ont été effectuées à l'aide de Fast SYBR Green Master Mix et d'un Roche LightCycler 384 (tous deux de Life Technologies). Le traitement des données avec le logiciel qbase+ 2.6 (Biogazelle) repose sur une normalisation avec un minimum de 2 gènes de référence, indiqués comme RefGen ci-dessous. Les amorces RT-qPCR sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 3.

MDM4 et Mdm4 l'épissage alternatif a été visualisé par semi-qPCR. L'amorce directe se lie à l'exon 4 (exon 5 chez la souris) et l'amorce inverse se lie à l'exon 7 (exon 8 chez la souris), générant 2 amplicons : MDM4-FL (250 nt) et MDM4-S (182 ent) (Mdm4-FL 227 nt et Mdm4-S 159 nt chez la souris). La PCR a été réalisée pendant 27 cycles (45 s à 95°C 30 s à 58°C 40 s à 72°C) en utilisant un

Modèle d'ADNc de 34 ng. GAPDH ou Gapdh a été utilisé comme témoin de chargement. Les produits ont été visualisés sur un gel d'agarose à 2%. Les amorces semi-qPCR utilisées sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 3.

Les amorces (tableau supplémentaire 6), s'hybridant aux exons 5 et 7, amplifiaient à la fois Floride et S MDM4 isoformes simultanément (figure supplémentaire 1B, étape1). Le produit PCR a été chargé sur un gel d'agarose à 2 %, et les 2 bandes (Figure supplémentaire 1B, étape 2) ont été purifiées à l'aide d'un kit d'extraction de gel QIAquick (catalogue 28706 QIAGEN). La quantité d'ADN purifié a été mesurée à l'aide d'un NanoDrop 1000 (Thermo Scientific), et la concentration du nombre de copies des amplicons a été dérivée sur la base de la longueur des amplicons (Floride: 162 pb, S: 94 pb). Des dilutions en série de l'ADN purifié (figure supplémentaire 1B, étape 3) ont été utilisées pour identifier une courbe standard et pour relier la valeur Ct au nombre de copies de chaque isoforme. Les mêmes amorces de l'étape 1 ont été utilisées pour la réaction TaqMan, ainsi qu'une sonde chevauchant la jonction exon 6–exon 7 conjuguée avec TET (PrimeTime 5′ TET/ZEN/3′ IBFQ, IDT, tableau supplémentaire 6) et une deuxième sonde chevauchant la jonction exon 5–exon 7 conjuguée avec FAM (PrimeTime 5′ 6-FAM/ZEN/3′ IBFQ, IDT, tableau supplémentaire 6 et figure supplémentaire 1B, étape 4). TaqMan Fast Universal PCR MasterMix (catalogue 4352042 Applied Biosystems) a été utilisé comme mélange maître 2X, et la réaction a été chargée sur un système de PCR en temps réel rapide 7900HT (Thermo Fisher Scientific) pour tracer les valeurs Ct pour les dilutions respectives des deux Floride et S isoformes (Figure supplémentaire 1B, étape 5). Nous avons dérivé le nombre de copies des 2 isoformes en utilisant la courbe standard.

Des vecteurs lentiviraux pLKO-1 MISSION (Sigma-Aldrich) ont été utilisés pour la protéine KD de SRSF dans des lignées cellulaires humaines (tableau supplémentaire 4). Un shRNA brouillé a été utilisé comme témoin. Des cellules HEK293T ont été transfectées avec le vecteur pLKO, ainsi que des vecteurs d'encapsidation. Les cellules ont été incubées pendant 18 heures, puis du milieu frais a été ajouté aux cellules. Après 24 heures, le milieu contenant les particules virales a été collecté, filtré à l'aide d'une unité de filtration de 0,22 µm, et ajouté sur les cellules cibles. Quarante-huit heures après la dernière infection, le milieu a été remplacé par du milieu de croissance frais contenant de la puromycine (catalogue 540411 EMD Millipore). Les cellules ont été sélectionnées pendant 2 jours avant la récolte.

SRSF3 et SRSF3 marqué par Myc ont été clonés dans un vecteur pMX (Addgene). Des cellules Phoenix-Ampho ont été transfectées avec un vecteur d'encapsidation pour produire les particules rétrovirales portant pMX vide, pMX-SRSF3 et pMX-SRSF3-Myc-tag. Le même protocole a été utilisé pour la collecte, le filtrage et l'infection des particules virales et pour la collecte des cellules UACC-62.

Les morpholinos brouillés et MDM4 Les morpholinos ciblant l'exon 6 (les séquences sont indiquées dans le tableau supplémentaire 5) ont été obtenus auprès de Gene Tools. Les oligonucléotides lyophilisés ont été remis en suspension à une concentration stock de 1 mM. Étant donné que le squelette d'un morpholino n'est pas polaire, il doit être partiellement annelé avec un oligonucléotide d'ADN normal afin d'être transfecté avec le réactif Lipofectamine (Lipofectamine 3000 Life Technologies). La séquence oligo brouillée était : AAAAAAAAAAACACTAGAGAATGATA, et la séquence oligo de l'exon 6 était : AAAAAAAAAAACAACTGAAGGTAAAAT. Les transfections ont été réalisées dans des plaques à 6 puits lorsque les cellules étaient à environ 60 % confluentes. Pour chaque puits, un mélange a été préparé avec 21,85 l d'amorce d'ADN (à partir de 100 M de stock), 2,78 l de morpholino (à partir de 1 mM de stock), 125 l d'Opti-MEM (catalogue 31985070 Gibco, Thermo Fisher Scientific) et 5 l de réactif P3000 (issu du kit Lipofectamine 3000). Ce mélange a été ajouté à une solution contenant 7,5 µl de Lipofectamine 3000 et 125 µl d'Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific). Après une incubation de 5 minutes, la solution a été ajoutée goutte à goutte aux cellules.

Toutes les lignées cellulaires cancéreuses ont été transfectées avec des morpholinos comme décrit ci-dessus. Vingt-quatre heures après la transfection, les cellules ont été trypsinisées, comptées et remises en plaques sur des plaques à 6 puits à une densité de 5 × 103 cellules. Après 10 jours, les colonies ont été fixées et colorées dans une solution de cristal violet à 1 % dans du méthanol à 35 % pendant 15 minutes à température ambiante et lavées dans du PBS et de l'eau du robinet. Des images de puits entiers ont été réalisées et traitées automatiquement avec le logiciel ImageJ (NIH) pour déterminer le pourcentage de zone occupée et le nombre de colonies.

Immédiatement après la chirurgie, du tissu tumoral frais a été collecté dans un milieu de transport constitué de milieu RPMI 1640 additionné de pénicilline/streptomycine (100 U/ml 100 g/ml), de fongizone (1 g/ml) et de gentamicine (50 g/ml) ( tous de Life Technologies). Une partie représentative a été fixée dans du formol neutre tamponné (NBF) à 10 % et utilisée pour le diagnostic histopathologique de routine. Une seconde portion immédiatement adjacente à celle sélectionnée pour l'histopathologie a été utilisée pour la xénotransplantation. Pour s'assurer que le mélanome était correctement représenté dans ce dernier spécimen, une histopathologie a été réalisée sur de fines tranches de tissu obtenues à partir de l'échantillon pour la xénotransplantation.Le reste de la biopsie a été congelé dans de l'isopentane refroidi à l'azote liquide et conservé à -80°C ou refroidi progressivement dans du FBS (Perbio Science Sterile DMSO Uvasol Merck Millipore) et 10 % de DMSO et conservé à -180°C pour une retransplantation ultérieure. . Du tissu tumoral a été implanté chez la souris dans les 4 heures suivant le prélèvement. Avant l'implantation, le tissu tumoral a été rincé dans du PBS (Life Technologies) additionné de pénicilline/streptomycine et de fongizone, haché en morceaux mesurant 8 à 10 mm 3 et implanté dans la région interscapulaire de souris NOG femelles anesthésiées (NOD. Cg-Prkdc scid Il2rgtm1Sug/JicTac Taconic) pour générer les souris PDX de première génération (F1). Lorsque les tumeurs ont atteint un volume tumoral de 1500 mm3, les souris ont été sacrifiées, les tumeurs ont été récoltées et une autopsie générale a été réalisée. Les tumeurs xénogreffes ont été immédiatement congelées fraîches, fixées au formol et stockées dans du FBS et 10 % de DMSO ou placées dans du Matrigel (Matrigel Basement Membrane Matrix BD Bioscience) pour une transplantation en série dans un autre groupe de souris NOG. Ce processus a été répété pour produire les générations suivantes de modèles PDX (F2, F3, F4, etc.). Pour évaluer le maintien de la morphologie et les principales caractéristiques de la tumeur d'origine, des coupes de tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) provenant d'échantillons de tumeurs de patients et de xénogreffes de tous les modèles PDX établis ont été colorés avec H&E et individuellement observés et examinés par un pathologiste humain et vétérinaire.

Le traitement par morpholinos a commencé lorsque le volume tumoral chez la souris atteignait 100 à 200 mm 3 . Les cohortes ont été traitées i.t. ou i.v. avec 0,12 mg de Vivo-Morpholinos (GeneTools LLC) brouillés ou ciblant l'exon 6 (GeneTools LLC) dissous dans 70 ul de PBS, tous les 2 jours pendant la durée de l'expérience. L'inhibiteur de BRAF (BRAFi) dabrafenib a été préparé en dissolvant une capsule de Tafinlar (dabrafenib) dans du DMSO concentré à 30 mg/ml, puis aliquoté et conservé à –20°C. Des aliquotes ont été décongelées et diluées à 1:10 dans du PBS avant le gavage. Les souris traitées ont reçu une dose plafonnée de 0,6 mg dans 200 ul de volume total. Les souris témoins ont été gavées avec 10 % de DMSO dans un volume total de 200 µl de PBS.

La croissance tumorale a été surveillée avec un pied à coulisse et le volume a été calculé en utilisant la formule suivante : V = a × b 2 × 0,5, où a est le plus grand et b le plus petit diamètre de la tumeur. Les tumeurs ont été disséquées à la fin du traitement et utilisées pour un traitement ultérieur pour l'ARN, les protéines et les analyses histologiques.

Electroporation de morpholinos dans les cellules DLBCL

Les morpholinos ont été électroporés dans des cellules DLBCL à l'aide du système de transfection au néon (Invitrogen), avec les paramètres suivants : 1 200 V × 20 ms × 2 impulsions. Deux microlitres d'une solution mère 1 mM ont été dilués dans un volume final de 2 ml de milieu pour l'électroporation dans un seul puits d'une plaque à 6 puits.

Les dosages du titre cellulaire Glo (Promega) et Caspase-Glo 3/7 (Promega) ont été effectués 48 heures après l'électroporation comme décrit plus en détail ci-dessous.

L'échantillon tumoral utilisé pour construire la xénogreffe DLBCL a été obtenu chez un homme de 53 ans ayant des antécédents de DLBCL de stade I 10 ans plus tôt et qui a été traité par chimiothérapie CHOP (cyclophosphamide, doxorubicine, vincristine, prednisolone) avec rémission complète. Il présentait une rechute de la BM, des leptoméninges et des épanchements pleuraux. Il a été traité par 2 cures de RICE (rituximab, ifosfamide, carboplatine, étoposide) et méthotrexate/cytarabine intrathécal, puis 4 cures de DHAP (dexaméthasone, cytarabine, cisplatine) et méthotrexate intrathécal, mais la maladie a continué à progresser, et le patient est décédé 1 an après la rechute de la maladie. L'examen cytologique du liquide pleural a montré une population lymphomateuse dischésive avec de grandes cellules avec une chromatine vésiculaire et des nucléoles visibles. Les cellules néoplasiques ont exprimé des marqueurs pan-B (PAX5, CD20, CD22, CD79a), avec une expression aberrante de CD5, une forte expression de BCL2 et une fraction de prolifération élevée de 70 à 80 %. Les lymphocytes néoplasiques présentaient un phénotype de centre non germinatif (CD10 – BCL6 + MUM1 + FOXP1 + ), mais la coloration pour c-Myc était faible, à 20 %. La fluorescence interphase ISH a montré des gains de BCL2 et des réarrangements des gènes BCL6 et IGH, alors que des schémas normaux ont été observés pour c-Myc.

Construction et traitement de la xénogreffe

Le liquide pleural a été recueilli dans du milieu RPMI 1640 froid et stérile à 20 %. Les cellules néoplasiques dans le liquide pleural ont été isolées avec Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare) puis remises en suspension dans du milieu RPMI 160 (Life Technologies) avec 20 % de FBS (Life Technologies). Une partie représentative de l'échantillon tumoral a été fixée dans 10 % de NBF, et l'autre partie a été utilisée pour la xénotransplantation. La suspension cellulaire a ensuite été implantée s.c. chez des souris NOD/SCID âgées de 4 à 6 semaines. Les tumeurs ont été surveillées périodiquement et laissées s'établir et croître jusqu'à une taille maximale de 1 000 mm3. Les souris ont ensuite été sacrifiées, les tumeurs ont été récoltées et une autopsie générale a été réalisée. Les tumeurs xénogreffes ont été immédiatement congelées fraîches, fixées au formol, stockées dans 90 % de FBS et 10 % de DMSO, ou placées dans du milieu RPMI 160. Ce processus a été répété pour produire les générations suivantes de modèles PDX (P2, P3, P4, etc.). Pour évaluer le maintien de la morphologie et des principales caractéristiques de la tumeur d'origine, des coupes de tissus FFPE provenant d'échantillons de tumeurs de patients et de xénogreffes de tous les modèles PDX établis ont été colorées avec H&E. De plus, ces coupes ont été immunocolorées pour déterminer l'expression de divers marqueurs. Toutes ces lames ont été examinées individuellement et revues par un pathologiste clinique.

Pour la présente étude, des fragments de tumeur (environ 50 mg, P4) ont été implantés s.c. sur le flanc de souris femelles NOD/SCID âgées de 4 à 6 semaines. On a laissé les tumeurs atteindre une taille d'environ 150 à 250 mm3. Les animaux ont été randomisés dans les 2 groupes suivants (m = 5) : groupe 1 : Vivo-Morpholinos brouillé (dose : 0,13 mg dans 70 l de PBS, i.t.), et groupe 2 : Vivo-Morpholinos ciblant l'exon 6 (dose : 0,13 mg dans 70 l de PBS, i.t.).

Les animaux ont été surveillés régulièrement et le poids corporel a été mesuré chaque jour pendant la période de traitement. A la fin de la période de traitement, tous les animaux ont été sacrifiés et les tumeurs ont été prélevées, pesées et observées pour la pathologie macroscopique. Chaque morceau de tumeur a ensuite été divisé en 2 parties. Un morceau de la tumeur a été fixé dans 10 % de NBF pendant 24 heures à température ambiante et a ensuite été inclus en paraffine. L'autre morceau a été surgelé pour l'analyse de l'ARN et des protéines.

Pour l'analyse immunohistochimique, les tumeurs ont été disséquées, fixées pendant 48 heures dans du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) et traitées pour l'inclusion dans la paraffine (Thermo Scientific Excelsior AS Tissue Processor et HistoStar Embedding Workstation). Les échantillons ont ensuite été sectionnés à 5 m, montés sur Superfrost Plus Adhesion Slides (Thermo Scientific) et immunocolorés pour MDM4 (1 : 250 IHC-00108, lapin polyclonal Bethyl Laboratories), Ki67 (1 : 200 RM-9106-S, clone SP6 , lapin monoclonal Thermo Scientific) et la caspase 3 clivée (Technologie de signalisation cellulaire polyclonale Asp175 de lapin 1:300), comme brièvement détaillé ci-dessous. Les lames pour IHC ont été déparaffinées dans du xylène puis réhydratées dans une série de bains d'éthanol (100 %, 95 % et 70 %) et distillées H2O. L'inhibition de la peroxydase endogène a été obtenue en incubant les lames dans 3% H2O2 pendant 15 minutes à température ambiante. La récupération d'épitope a été réalisée dans un tampon citrate (pH 6) en utilisant un 2100 Retriever (Electron Microscopy Sciences). Les coupes ont été bloquées dans 1% de BSA pendant 40 minutes à température ambiante puis incubées pendant une nuit à 4°C avec l'Ab primaire. Pour les deux Ab primaires élevés chez le lapin, le réactif EnVision+ HRP (catalogue K400311 Dako) a ensuite été appliqué sur les coupes pendant 45 minutes à température ambiante. L'immunoréactivité a finalement été révélée via une réaction de diaminobenzidinechromogène (DAB Peroxydase Substrate Kit, SK-4100 Vector Laboratories). Ensuite, les lames ont été contre-colorées à l'hématoxyline (catalogue C0302 Diapath), déshydratées dans une série de bains d'éthanol, nettoyées au xylène et montées en permanence avec un milieu de montage résineux (catalogue 60200 Micromount Diapath). Une solution de Tween-20 et de TBS (0,1%) a été utilisée comme tampon de lavage entre les étapes.

Pour évaluer les index prolifératifs et apoptotiques, les noyaux Ki67 ou clivés de caspase 3 positifs et négatifs ont été comptés dans 3 champs microscopiques sélectionnés au hasard dans différentes régions de chaque section tumorale en appliquant un algorithme d'analyse d'image numérique créé sur la plate-forme logicielle ImageJ. Les indices de prolifération et d'apoptose ont ensuite été exprimés comme le rapport entre le nombre positif et le nombre total de noyaux.

Tests de viabilité et d'apoptose

Le test de prolifération cellulaire CellTiter-Glo ou CellTiter 96 AQueous One Solution (Promega) a été utilisé comme test de viabilité cellulaire. Les cellules ont été trypsinisées, comptées et ensemencées (5 000 cellules/puits) dans des plaques à 96 puits transparentes à fond plat (Corning). Après 48 ou 72 heures, les cellules ont été incubées avec CellTiter-Glo ou CellTiter 96 AQueous One Solution et après 1 heure, la luminescence et l'absorbance ont été notées à l'aide d'un lecteur de microplaques Tecan Safire2.

Le kit Caspase-Glo 3/7 Assay (Promega) a été utilisé comme test d'apoptose. Les cellules ont été trypsinisées, comptées et ensemencées (5 000 cellules/puits) dans des plaques opaques à fond plat à 96 puits (Corning). Après 48 ou 72 heures, les cellules ont été incubées avec Caspase-Glo 3/7 Assay selon le protocole du fabricant. Après 1 heure, la luminescence et l'absorbance ont été lues avec un lecteur de microplaques Tecan Safire2.

Calcul de l'utilisation relative des exons. À partir du tableau avec le nombre brut de jonctions exon-exon de MDM4 (ENST00000367182.3) (= j), la valeur totale d'expression de jonction par échantillon (somme de toutes les jonctions) (= JG) a été calculée. Tous les échantillons avec un JG inférieur à (0,05 × Max[JG]) ont été rejetés. Les échantillons restants ont été normalisés (j ≤ j/JG) (nombre total de jonctions par gène = 1), et la moyenne de chaque jonction sur tous les échantillons a été calculée et normalisée à la jonction exon-exon la plus abondante (jonction exon 10–exon 11 ). Sur les 375 échantillons originaux téléchargés depuis TCGA à l'aide de Firehose (http://gdac.broadinstitute.org/), 90 échantillons n'avaient aucun compte pour la jonction exon 5–exon 6 ou la jonction exon 5–exon 7 et ont été exclus de l'analyse .

Calcul de l'indice PSI dans des échantillons de tissus cancéreux. Les données sur le nombre de jonctions et les informations sur l'état des mutations géniques ont été téléchargées à partir de TCGA à l'aide de Firehose (http://gdac.broadinstitute.org/) pour les différents types de tumeurs à partir du gel des données 2014_09_02. Pour chaque échantillon, l'indice PSI a été calculé sur la base des décomptes de jonctions quantifiés par Firehose. Les échantillons dans lesquels les jonctions de forme courte et longue se situaient dans le quantile inférieur de 10 % pour chaque jonction ont été exclus. Le PSI de la MDM4-FL nombre de jonctions (de chr1:204501374:+ à chr1:204506558:+) et le MDM4-S jonction (de chr1:204501374:+ à chr1:204507337:+) ont été calculés, triés et tracés.

Analyse des sites de liaison à l'ARN près de MDM4 chez la souris. Les lectures traitées à partir du séquençage IP croisé (CLIP-seq) ont été téléchargées à partir de starBase, v2.0 (http://starbase.sysu.edu.cn). Les lectures brutes pour SRSF3/4 ont été téléchargées à partir de la base de données ArrayExpress (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) sous le numéro d'accession E-MTAB-747 et mappées sur le génome mm9 à l'aide de Bowtie (http:// nœud papillon-bio.sourceforge.net/index.shtml). La région génomique mm9 entourant les exons 7 et 8 de MDM4 a été visualisé à l'aide de l'environnement R (http://cran.r-project.org/).

DÉCHIRURE. Le culot cellulaire A375 a été lavé deux fois dans du PBS glacé et remis en suspension dans du tampon de lyse (tampon Tris contenant 50 mM, pH 8, NaCl 150 mM, 0,5% NP40, 0,5% de désoxycholate de sodium, 0,005% SDS, SUPERase fraîchement ajoutée dans l'inhibiteur de RNase [1:200 Ambion, Thermo Fisher Scientific] et cocktail d'inhibiteurs de protéase [1:1 000, catalogue 539134 Calbiochem]). Le lysat a été placé sur de la glace pendant 20 minutes, suivi d'une sonication dans un Diagenode BioRuptor UCD-200 (trois coups de 30 s marche/arrêt). Les lysats ont été clarifiés par centrifugation (10 min/20 800 g à 4°C), et la teneur en protéines a été déterminée (Bradford Thermo Scientific). Dix pour cent des entrées ont été enregistrées et le lysat restant a été pré-clarifié avec des Dynabeads de protéine A (Invitrogen) à 4°C pendant 1 heure avec rotation. Les billes ont toujours été lavées 3 fois dans du tampon de lavage avant utilisation (tampon Tris-HCl 200 mM, pH 8 NaCl 100 mM 0,5% NP40 SUPERase In RNase Inhibitor fraîchement ajoutée, 1:200 et cocktail d'inhibiteur de protéase, 1:1000). Le lysat a été séparé des billes et ajouté à 60 ul de Dynabeads lavées (boue à 50 %) préincubées avec 5 ug de SRSF3 Ab pendant 1 heure à température ambiante. Après une rotation de 3 heures à 4°C, les billes liées à Ab ont été lavées 3 fois avec du tampon de lavage. L'ARN a été extrait avec 1 ml de TRIzol, en ajoutant 0,35 µl de coprécipitant GlycoBlue (catalogue AM9516 Thermo Fisher Scientific). La restrotranscription d'ARN a été réalisée à l'aide d'un kit de synthèse d'ADNc SuperScript VILO (catalogue 11754050 Thermo Fisher Scientific). Les MDM4 L'élément régulateur d'épissage de l'exon 6 a été détecté dans l'ARN immunoprécipité par qPCR à l'aide des amorces indiquées dans le tableau supplémentaire 7.

Un non apparié t Le test a été utilisé pour évaluer les différences statistiques dans la figure 3A (la signification statistique unilatérale a été déterminée à l'aide de la méthode Holm-Sidak, avec α = 5 000 %) et la figure 8, B–D (bilatérale). Une paire à 2 queues t test a été utilisé pour évaluer les différences statistiques dans la figure supplémentaire 3F. à deux queues P des valeurs inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. Une ANOVA à deux facteurs a été utilisée pour déterminer la signification statistique sur les figures 5, A et E et sur la figure 6B.

Mélanome PDX. Des biopsies tumorales humaines originales de mélanomes primaires et métastatiques ont été obtenues fraîchement en salle d'opération, et tous les patients ont donné leur consentement éclairé écrit pour l'utilisation de leurs échantillons de biopsie.

Toutes les procédures impliquant des échantillons humains ont été approuvées par le comité d'éthique médicale de l'UZ Leuven/KU Leuven (Commissie Medische Ethiek, numéro d'approbation ML8713/S54185). Toutes les procédures impliquant des animaux ont été réalisées conformément aux directives de l'IACUC de la KU Leuven et approuvées dans les demandes de projet P147/2012 (configuration de la plate-forme PDX) et P038/2015 (expériences ASO).

DLBCL PDX. Toutes les procédures ont été approuvées et exécutées conformément aux principes éthiques de l'IRB de l'hôpital général de Singapour. Un consentement éclairé écrit a été obtenu pour l'utilisation de ces échantillons à des fins de recherche spécifiques uniquement.

Le protocole expérimental a été approuvé par l'IACUC du Centre de ressources biologiques, A*STAR, et les animaux ont été maintenus en conformité avec les directives institutionnelles d'A*STAR.

MD, TT, KW et MB ont mené des expériences et acquis et analysé des données. FR, MF et DHPL ont effectué une analyse biostatistique. AR a mené des expériences sur le mélanome PDX. SXT a fourni une assistance technique. CMK a mené des expériences sur le DLBCL. FAD, RMC et ZB ont mené des expériences sur des lignées cellulaires de mélanome. ER et MAH ont effectué des analyses pathologiques et IHC de souris. EH et FA ont géré l'installation de mélanome PDX. SYT, STL, ML, RCK et VT géraient l'installation DLBCL PDX. HY et CB ont fourni des réactifs pour les mESC. MS a lu et édité le manuscrit. JCM et EG ont conçu les études de recherche et rédigé le manuscrit.

Nous remercions P. Kaldis, D. Messerschmidt, G. Gargiulo et M. Serresi pour leurs discussions utiles et pour la lecture critique du manuscrit. Nous remercions les installations partagées du Centre de ressources biologiques (BRC) pour le soutien technique. Mark Shackleton a été soutenu par le Conseil national australien de la santé et de la recherche médicale (NHMRC), Pfizer Australie et le Victorian Endowment for Science, Knowledge and Innovation. J.-C. Marine reconnaît le soutien du NHMRC (subvention 1058897), du Fonds Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO, subvention G.0646.14N), de l'Interuniversitaire Attractiepolen (IUAP, subvention P7/03) et de la Fondation contre le cancer (Sticching tegen Kanker, subvention STK 2014-126 ). Ce travail a également été soutenu par une bourse AGA-SINGA (SINgapore Graduate Award) à M. Bezzi et T. Tabaglio et par l'IMCB, A*STAR. E. Guccione reconnaît le soutien des subventions du Conseil conjoint A*STAR 1134c001 et 11/03/FG/07/04.

Conflit d'intérêt: Les auteurs ont déclaré qu'il n'existe aucun conflit d'intérêts.

Informations de référence: J Clin Invest. 2016126(1) :68-84. doi:10.1172/JCI82534.


La région de codon de début de traduction est sensible à l'inhibition de PNA antisens dans Escherichia coli

Les acides nucléiques peptidiques antisens (PNA) peuvent inhiber l'expression des gènes bactériens avec une spécificité de gène et de séquence. En utilisant des peptides porteurs attachés qui facilitent la perméation cellulaire, les effets antisens lors du ciblage des gènes essentiels sont suffisants pour empêcher la croissance et même tuer les bactéries. Cependant, de nombreuses incertitudes de conception demeurent, y compris la question difficile de la sélection de la séquence cible. Dans cette étude, nous avons synthétisé 90 peptides-PNA antisens pour cibler des séquences de manière tête-à-queue sur toute la longueur de l'ARNm codant. ??-lactamase. Les résultats de ce balayage ont indiqué que la région du codon de départ était la plus sensible à l'inhibition. Pour confirmer et affiner le résultat, un balayage à plus haute résolution a été effectué sur la région du codon de départ du ??-le gène de la lactamase et l'essentiel Escherichia coli acpP gène. Pour les deux gènes, la région du codon de départ, y compris le motif Shine-Dalgarno, était sensible, alors que les agents antisens ciblés en dehors de cette région étaient largement inefficaces. Ces résultats sont en accord avec les mécanismes antisens naturels, qui entravent généralement la région du codon de départ, et la sensibilité de cette région devrait être vraie pour la plupart des gènes bactériens ainsi que pour d'autres agents antisens indépendants de la RNase H qui reposent sur un mécanisme de blocage stérique. Par conséquent, bien que d'autres paramètres de conception soient également importants, la région du codon de départ dans E. coli L'ARNm est le site cible le plus fiable pour les PNA antisens.