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1.5 : Purification de l'ADN du capteur de toxines mutantes à partir de cellules bactériennes et évaluation de sa qualité à l'aide de l'électrophorèse sur gel d'agarose et de la spectroscopie UV - Biologie

1.5 : Purification de l'ADN du capteur de toxines mutantes à partir de cellules bactériennes et évaluation de sa qualité à l'aide de l'électrophorèse sur gel d'agarose et de la spectroscopie UV - Biologie


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5.1 Objectif d'apprentissage

La semaine dernière, vous avez généré l'ADN plasmidique contenant le capteur de toxine mutante à l'aide de l'amplification PCR QuickChange. Cette semaine, vous apprendrez comment extraire et purifier cet ADN plasmidique de E. coli cellules, et comment vérifier la qualité de l'ADN plasmidique en utilisant l'électrophorèse sur gel d'agarose et la spectroscopie UV.

5.2 Organigramme du mini-projet

Le bloc en gras dans l'organigramme ci-dessous met en évidence le rôle de l'expérience actuelle dans le mini-projet.

5.3 Purification de l'ADN plasmidique à partir de cellules bactériennes (Plasmid Prep)

La semaine dernière, vous avez utilisé l'amplification PCR pour synthétiser l'ADN plasmidique contenant le capteur de toxine mutante. L'amplification par PCR est un excellent outil pour changer la séquence de l'ADN, mais elle ne génère pas une quantité suffisante d'ADN plasmidique. L'amplification par PCR donne généralement quelques centaines de nanogrammes d'ADN. Lors du clonage, la transfection ou la synthèse d'ARN nécessitent généralement un ADN au niveau du microgramme ou même du milligramme. De plus, l'ADN plasmidique généré par amplification PCR est circulaire tandis que l'ADN plasmidique synthétisé par les bactéries est principalement super enroulé. L'ADN superenroulé a le même poids moléculaire que son homologue circulaire, mais il est plus compact. L'ADN dans la conformation superenroulée est plus petit et mieux protégé contre les dommages causés par les endonucléases de restriction ou les dangers environnementaux (Figure 5.1).

Pour ces raisons, l'amplification PCR n'est généralement pas utilisée pour produire de grandes quantités d'ADN. Pour synthétiser l'ADN pour la plupart des applications en chimie et en biologie, des cellules bactériennes doivent être utilisées. Pendant le préparation de plasmide, nous utilisons le régime de synthèse d'ADN des cellules bactériennes, typiquement E. coli, pour nous préparer l'ADN plasmidique. En d'autres termes, nous détournons E. coli synthétiser notre ADN.

Les étapes de la synthèse de vecteurs plasmidiques à l'aide de cellules bactériennes sont les suivantes :

  1. Transformer l'ADN plasmidique dans la cellule bactérienne.
  2. Cultiver des bactéries contenant le plasmide souhaité (5 à 500 ml).
  3. Purifier l'ADN plasmidique des cellules bactériennes.

5.4 Transformation

Afin d'utiliser des cellules bactériennes pour synthétiser de l'ADN plasmidique, l'ADN plasmidique doit être placé à l'intérieur de la cellule bactérienne ; ce qui signifie que nous devons forcer les bactéries à absorber l'ADN plasmidique. Ceci est problématique, car la membrane cellulaire bactérienne est apolaire et représente une barrière imperméable aux molécules polaires comme l'ADN. Transformation perce des « trous » sur la membrane cellulaire pour permettre l'entrée de l'ADN. Deux méthodes sont disponibles pour la transformation : le choc thermique et l'électroporation. Le choc thermique implique un chauffage et un refroidissement rapides des cellules bactériennes qui ont été précédemment traitées avec du CaCl2. Comme les membranes cellulaires sont perméables au Cl- ions, une fois Cl- passe sous forme d'anion hydraté, il conduit à un « gonflement de la cellule ». Le choc thermique à 42 °C entraîne la formation de trous (pores) sur la membrane qui permettent l'entrée de l'ADN. Lors de l'électroporation, ces trous sont générés par un bref électrochoc.

La transformation est une procédure à faible rendement : relativement peu de cellules absorbent le plasmide, malgré le traitement de choc thermique ou d'électroporation.

5.5 La croissance cellulaire

En raison du faible rendement, un marqueur sélectif doit être utilisé pour distinguer les cellules qui hébergent le plasmide des cellules qui ne le font pas. Le marqueur sélectif le plus couramment utilisé avec les systèmes bactériens est l'utilisation d'un antibiotique. Les plasmides abritent un gène de résistance à un antibiotique donné. Cela signifie que les cellules qui ont absorbé le plasmide se développeront sur un milieu contenant l'antibiotique, tandis que les cellules qui n'ont pas absorbé le plasmide ne le feront pas. Par conséquent, l'étalement du mélange de transformation sur un milieu solide contenant l'antibiotique sélectif, l'ampicilline dans notre cas, ne produira que des colonies de bactéries qui hébergent le plasmide contenant l'ARN capteur ykkCD.

Une fois que E. coli les cellules qui hébergent l'ADN plasmidique contenant le capteur ykkCD mutant sont identifiées, ces cellules sont inoculées dans un milieu liquide contenant l'antibiotique sélectif (ampicilline) et cultivées pendant 16 heures. à 37°C sous agitation vigoureuse.

5.6 Purification de l'ADN plasmidique à partir de cellules bactériennes

Lorsque l'ADN plasmidique est synthétisé par amplification PCR, l'ADN résultant est très propre. Cependant, lorsque l'ADN est synthétisé à l'aide de cellules bactériennes, l'ADN plasmidique est contaminé par des composants de cellules bactériennes : leur membrane cellulaire, leurs protéines cellulaires, leur ADN et leur ARN. Lors de la préparation du plasmide, tous ces contaminants doivent être éliminés. Les préparations de plasmides utilisent le fait que l'ADN est fortement chargé négativement (par rapport aux protéines), très soluble dans l'eau (par rapport aux lipides et aux protéines membranaires) et assez petit (par rapport à l'ADN génomique).

Assurez-vous de suivre le protocole de préparation du plasmide exactement comme écrit. Les premières étapes de la purification du plasmide (de la rupture des cellules au chargement de l'ADN sur la colonne de purification) ont un impact significatif sur la pureté et la quantité de l'ADN plasmidique.

Le protocole exact de purification du plasmide dépend du kit utilisé et sera fourni en laboratoire. Un aperçu général de la procédure est présenté ci-dessous.

  1. Les préparations plasmidiques ont commencé par briser la membrane cellulaire bactérienne (lyse) pour libérer l'ADN plasmidique. Cette étape est généralement réalisée par une lyse alcaline. La rupture des cellules peut également être obtenue en utilisant l'enzyme lysozyme. Veillez à ne PAS laisser la lyse cellulaire se poursuivre plus longtemps que prévu. Manipulez le lysat cellulaire doucement pour éviter le cisaillement de l'ADN chromosomique. Cela pourrait entraîner une contamination de l'ADN plasmidique par l'ADN génomique.
  2. Après la lyse cellulaire, l'ADN plasmidique sera en solution avec des protéines solubles, mais tout ce qui n'est pas soluble dans l'eau, l'ADN génomique, les lipides et les protéines membranaires, formeront un sédiment. Ce sédiment peut être éliminé par centrifugation ou filtration. Dans tous les cas, cette étape purifie l'ADN plasmidique des protéines, des lipides et de l'ADN génomique.
  3. L'ADN plasmidique est encore purifié par purification sur colonne. Souvent, une colonne de chromatographie échangeuse d'anions à base de silice est utilisée. Cette étape profite de la charge négative de l'ADN pour séparer l'ADN plasmidique de l'ADN génomique de l'hôte. Étant donné que l'ADN génomique est beaucoup plus gros, il a une charge négative plus élevée que l'ADN plasmidique, il interagit plus fortement avec la colonne échangeuse d'anions. En conséquence, l'ADN génomique reste lié à la colonne échangeuse d'anions tandis que l'ADN plasmidique est élué.

5.7 Électrophorèse sur gel d'agarose

Pour évaluer la qualité de l'ADN plasmidique, une électrophorèse sur gel d'agarose sera utilisée. L'électrophorèse est une technique utilisée pour séparer des molécules en fonction de leur charge et de leur forme. La séparation est obtenue en déplaçant les molécules chargées négativement comme l'ADN à travers un champ électrique de l'électrode négative à l'électrode positive. Les molécules plus courtes migrent plus rapidement que les plus longues. Pour éviter la propagation de l'échantillon pendant l'électrophorèse, un milieu solide est utilisé comme l'agarose ou le polyacrylamide. Agarose est un polysaccharide qui est généralement extrait des algues et est utilisé pour séparer les gros acides nucléiques (> 500 paires de bases). La taille des pores du polymère dépend du pourcentage d'agarose utilisé (0,6 – 2 %). Un pourcentage plus élevé conduit à une taille de pores plus petite et est conçu pour séparer les molécules plus petites. Les gels d'agarose ne dénaturent (déplient) généralement pas l'ADN. Par conséquent, la conformation de l'ADN affecte également le taux de migration.

Le taux de migration dans un gel d'agarose est décrit par l'équation ci-dessous où v est la vitesse (taux), q est la charge de la molécule, E est la force du champ électrique et F est le frottement.

L'ADN migrant à travers un gel avec une taille de pores plus petite subit plus de friction et parcourt moins de distance que la même molécule migrant à travers un gel avec une taille de pores plus grande. De même, l'ADN de forme plus allongée parcourt une plus petite distance dans le gel que l'ADN compact, car l'ADN compact subit moins de friction lorsqu'il migre à travers le gel. Par conséquent, l'ADN superenroulé (plus compact) migre plus rapidement dans un gel d'agarose que l'ADN entaillé ou circulaire (de forme plus allongée). L'ADN avec un poids moléculaire plus élevé voyage moins loin que l'ADN avec un poids moléculaire plus faible, tant que leur forme est similaire. La relation entre la forme, le poids moléculaire et la distance parcourue dans un gel d'agarose est observée dans 5.2..

Les acides nucléiques sont visualisés sur un gel d'agarose en utilisant une coloration au bromure d'éthidium (EtBr). L'EtBr est fluorescent et interagit avec les bases nucléiques de l'ADN (s'intercale avec les bases de l'ADN). L'excès d'EtBr migre rapidement hors du gel en raison de sa petite taille. Lorsqu'ils sont exposés à la lumière UV, les acides nucléiques « s'allument » dans un gel d'agarose en raison de la fluorescence EtBr. Les colorations d'acide nucléique vert SYBR fonctionnent de la même manière (Figure 5.3).

5.8 Application de l'électrophorèse sur gel d'agarose

L'électrophorèse sur gel d'agarose est une technique puissante qui est utilisée pour séparer les acides nucléiques par taille et/ou forme. Il a des applications à la fois préparatoires et analytiques. En tant qu'outil analytique, l'électrophorèse sur gel d'agarose peut être utilisée pour évaluer le succès de toute réaction enzymatique qui entraîne un changement significatif de la forme de l'ADN, tel qu'un clivage par des endonucléases de restriction (voir plus de détails au chapitre 6). Les endonucléases de restriction sont des enzymes qui clivent l'ADN et transforment ainsi l'ADN superenroulé (migration rapide) en ADN linéaire (migration lente). En conséquence, le succès d'une réaction de clivage par endonucléase de restriction peut être jugé par la distance à laquelle l'échantillon d'ADN clivé migre sur un gel d'agarose par rapport à l'ADN d'origine (non coupé). Figure 5.2 comparer les voies avec les ADN coupés et non coupés. Une application préparatoire de l'électrophorèse sur gel d'agarose consiste à éliminer tout ADN non coupé (superenroulé) d'un échantillon traité avec une endonucléase de restriction. Dans ce cas, la bande à migration lente (ADN coupé) est excisée du gel d'agarose et l'ADN est élue du morceau de gel à l'aide de kits disponibles dans le commerce.

5.9 Contrôle de la qualité de l'ADN par spectroscopie UV

La spectroscopie UV est couramment utilisée pour déterminer la concentration d'ADN plasmidique. Les acides nucléiques absorbent fortement la lumière UV à 260 nm, en raison des nucléobases (composés aromatiques hétérocycliques). La concentration d'ADN produite est estimée à l'aide de la formule ci-dessous :

e est le coefficient d'absorption (20 ml/mg*cm pour l'ADN plasmidique), je est la longueur du trajet (1 cm) et c est la concentration de l'ADN plasmidique en mg/ml. En mesurant l'absorbance de l'ADN plasmidique produit, la concentration peut être calculée.

PROTOCOLES

Les besoins en réactifs et équipements sont calculés par six équipes d'étudiants. Il y a environ 20% de franchise inclus.

Matériel/verrerie nécessaire

  1. Trois erlenmeyers bouchonnés de 100 ml
  2. Trois cylindres gradués de 100 ml
  3. Trois jeux de micropipettes 20-100 µl et 2-20 µl.
  4. Spectromètre UV
  5. Système de documentation des gels
  6. Bain-marie (pour transformation)
  7. Agitateur orbital (pour la croissance cellulaire)
  8. Six tubes de 10-15 ml (stériles)
  9. Six tubes à centrifuger de 1,5 ml (Eppendorf)

Solutions nécessaires

  1. 3 l 1 x TAE (Tris-acétate-EDTA) pH=8,0
  2. 30 ml d'EtBr à 1 % (ou colorant d'acide nucléique équivalent)
  3. 20 ml de colorant de chargement de gel d'agarose (6x, Biorad)
  4. 30 ml 1 kb échelle de poids moléculaire (Biorad)
  5. 30 ml de bouillon LB (Luria-Bertani) et six plaques LB/Ampicilline (100 mg/ml)
  6. 30 ml 100 mg/ml (1000 x) Ampicilline (pour la croissance cellulaire)

Transformation (peut être effectuée par les assistants d'enseignement à l'avance)

  1. Réglez le bain-marie à 42 °C.
  2. Étiqueter 1 tube en verre ou en plastique stérile et 1 tube de microcentrifugation pour chaque mutant.
  3. Étiqueter 1 plaque de gélose LB contenant 100 mg/ml d'ampicilline pour chaque mutant.
  4. Dégel E. coli Cellules compétentes Dh5a sur glace (100 ml de cellules compétentes sont utilisés pour chaque mutant).
  5. Ajouter 10 ul d'ADN mutant amplifié par PCR dans chaque tube contenant des cellules compétentes. Gardez les cellules sur la glace pendant 20 min.
  6. ADN de choc thermique comme suit :
    1. Placer la cellule à 42 ° C pendant 2 min.
    2. Déplacer les cellules sur la glace pendant 3 min.
  7. Tout en effectuant la pipette de traitement de choc thermique 900 pi de bouillon LB dans des tubes stériles préalablement étiquetés et placez-les dans un agitateur orbital à 37 ° C pour le préchauffage.
  8. Ajouter des cellules soumises à un choc thermique dans des tubes contenant 900 pi de bouillon LB préchauffé.
  9. Cultivez les cellules tout en secouant doucement (120 tr/min) pendant 1 heure.
  10. Transférer les cellules dans des tubes à centrifuger préalablement étiquetés. Pellet cellules pendant 2 min dans une microcentrifugeuse en utilisant 5000 rpm.
  11. Retirer le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans 100 ul de bouillon LB et plaquer puis sur les plaques LB/ampicilline préalablement étiquetées.
  12. Cultiver les cellules pendant la nuit dans un incubateur à 37 ° C.

Croissance cellulaire (peut être effectuée par les assistants d'enseignement à l'avance)

  1. Étiqueter 1 tube de verre stérile pour chaque mutant.
  2. Inoculer une seule colonie dans 1 ml de LB/bouillon additionné de 100 g/ml d'ampicilline. Cultivez les cellules pendant 5-6 heures. dans un agitateur orbital à 37°C sous agitation vigoureuse (280 rpm).
  3. Étiqueter 1 flacon Erlenmeyer stérile de 120 ml pour chaque mutant.
  4. Utilisez 100 l de cellules de « l'étape 2 » pour ensemencer 40 ml de bouillon LB complété par 100 g/ml d'ampicilline pour chaque mutant.
  5. Cultivez ces cellules pendant la nuit avec une agitation vigoureuse (280 rpm).
  6. Les cellules peuvent être récoltées (centrifugation 10 min avec 5000 x g; éliminer le surnageant) et stockées à -20 ° C.

Purification de plasmide à partir de cellules d'E. coli

Le protocole dépend du kit utilisé et sera fourni en laboratoire. Voir page 47 pour un aperçu de base.

Électrophorèse sur gel d'agarose

  1. Peser 1 g d'agarose et le placer dans un Erlenmeyer bouché fourni.
  2. Ajouter 100 ml de tampon 1 x TAE à l'aide d'un cylindre gradué.
  3. Chauffer 1 min au micro-ondes, agiter la fiole et laisser refroidir brièvement sous l'eau.
  4. Ajouter 10 ul EtBr (Porter des gants. EtBr est mutagène); ballon tourbillon pour le mélange.
  5. Verser le liquide dans la cassette de gel et positionner les peignes. Il faut environ 20 minutes pour que le gel d'agarose durcisse.
  6. Une fois le gel fixé, chargez votre échantillon plus 10 ul d'échelle de poids moléculaire (avec 2 ul de colorant de charge). Exécutez le gel pendant 20 min avec 100 V.
  7. Prenez une photo du gel à l'aide d'un système de documentation du gel.

Spectroscopie UV (ce protocole est pour le spectromètre Nanodrop ; pour le spectromètre UV conventionnel, de grands volumes d'ADN doivent être utilisés)

  1. Allumez le spectromètre et choisissez la configuration du test d'acide nucléique.
  2. Spectromètre à blanc avec 2 l d'eau millipore.
  3. Mesurez l'absorbance d'un échantillon d'eau pour vous assurer que le spectromètre est propre.
  4. Utilisez 2 ul d'échantillon d'ADN plasmidique pour mesurer la concentration de votre ADN plasmidique.
  5. Enregistrez la concentration d'ADN en mg/ml.

Notes à l'instructeur

L'expérience du chapitre 5 est conçue pour isoler l'ADN plasmidique contenant l'ARN capteur de tétracycline ykkCD mutant en utilisant E. coli cellules. Le même protocole avec une modification minimale pourrait être utilisé pour effectuer la purification plasmidique de tout ADN de E. Dans l'établissement des auteurs, les étudiants ont reçu des cultures de cellules liquides contenant l'ADN du capteur de toxine mutante. La transformation et la croissance cellulaire ont été effectuées par des assistants d'enseignement en l'absence des étudiants. Cette configuration permet de gagner du temps en laboratoire, mais limite quelque peu la compréhension des étudiants des étapes nécessaires pour fabriquer de l'ADN plasmidique. Si vous le souhaitez, une session de laboratoire distincte peut être allouée où les étudiants effectuent la transformation et la croissance cellulaire. Tout disponible dans le commerce E. coli La cellule compétente Dh5α convient à la transformation. Les E. coli souche et le protocole pour les rendre aptes à la transformation utilisé par les auteurs est disponible sur demande. Le Plasmid Midi Kit de Qiagen fonctionne bien pour purifier l'ADN plasmidique, mais des kits similaires d'autres fournisseurs peuvent bien fonctionner. Un kit de purification de plasmide de taille moyenne est recommandé pour s'assurer qu'une quantité suffisante d'ADN plasmidique est produite.

Questions préliminaires pour la préparation du plasmide

Définir les termes suivants.

  1. Transformation

  2. Gel d'agarose

  3. ADN superenroulé vs ADN linéaire

  4. Loi Bière-Lamber. Définissez chaque terme de l'équation.

  5. Quel type de précautions devez-vous observer lors de la manipulation d'EtBr et pourquoi ?

Aperçu du rapport de laboratoire et distribution des points

1. Plusieurs phrases définissant le but/le but de cette expérience. Veuillez indiquer le rôle que joue cette étape dans le mini-projet (5 pts.).

2. Décrivez brièvement la stratégie utilisée pour purifier l'ADN plasmidique des cellules (10 pts.). (Quels sont les principaux contaminants ? Quelles propriétés de votre ADN plasmidique sont exploitées lors de la purification et comment ? Quelles sont les différences entre votre ADN plasmidique et les autres macromolécules cellulaires ?)

3. Dessinez un organigramme détaillé de la préparation du plasmide. Assurez-vous d'indiquer le volume de chaque tampon qui doit être ajouté et quelle fraction (soluble/insoluble ou colonne/filtrat) contient l'ADN plasmidique et quelle fraction est rejetée (20 pts.).

4. Définir/décrire la transformation (5 pts.).

5. Définir/décrire le rôle de la digestion DpnI dans le processus Quickchange (5 pts.).

Dépannage d'une préparation de plasmide

6. Votre collègue avait une contamination importante de l'ADN génomique dans sa préparation de plasmide. À votre avis, à quelle(s) étape(s) de la préparation une erreur a-t-elle été commise ? Expliquez brièvement (5 pts.).

Ensemble de problèmes d'électrophorèse

1. (9 pts.) Décrivez les effets que ce qui suit aurait sur une électrophorèse sur gel d'agarose d'ADN. Utilisez l'équation, v = qE/f, de manière qualitative dans le cadre de votre explication.

  1. La concentration en agarose est augmentée de 1% à 1,5%.
  2. La tension pour l'électrophorèse est diminuée de 100 volts à 60 volts.
  3. Le pH est passé d'environ neutre à des conditions acides (pH = 3,0).

2. (5 pts.) On vous demande de séparer 1 µg d'ADN sur un gel d'agarose. L'échantillon doit contenir 1 x tampon TAE et la taille de l'échantillon est de 10 ul. Quels volumes des éléments suivants utiliseriez-vous pour préparer cet échantillon : 0,5 g/μl de solution mère d'ADN, 10 x tampon TAE et eau.

3. (9 pts.) Un gel d'agarose a été utilisé pour déterminer la taille de plusieurs morceaux d'ADN. La voie « M » a une échelle de taille d'ADN de 11 étapes (en haut 10 kb, 9 kb, 8 kb, 7 kb, 6 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb en bas). Mesurez les distances parcourues au millimètre près. Construire un graphique du log (kb) en fonction de la distance parcourue pour l'échelle d'ADN.

  • (a) À l'aide du tracé, déterminez la taille de l'ADN (en kb) dans les pistes 4 et 1.
  • (b) La grande bande de la piste 1 est en fait un ADN plasmidique circulaire de la même taille que l'ADN linéaire de la piste 4. Expliquez brièvement pourquoi le plasmide circulaire se déplace plus loin dans le gel que l'ADN linéaire.


Voir la vidéo: SBI4U - Problèmes sur lélectrophorèse sur gel dagarose (Juin 2022).


Commentaires:

  1. Jedadiah

    Je félicite, pensée remarquable

  2. Ceawlin

    Remarkable idea and it is duly

  3. Bembe

    En effet et comment je ne réalisais pas auparavant



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