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Pourquoi le sorbitol est-il utilisé dans les tampons ?

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De nombreux protocoles de mon laboratoire utilisent du sorbitol dans des tampons. Par exemple, en co-immunoprécipitation, nous l'incluons à une concentration finale de 200 mM dans notre tampon de lyse. Je ne suis pas tout à fait sûr pourquoi cependant. Je crois que cela pourrait être un agent de surpeuplement. Mais même si c'est la raison, je ne suis pas tout à fait sûr de ce que cela signifie. Quelqu'un pourrait-il expliquer?


Généralement, le sorbitol est l'un de ces « vieux trucs » dans le livre qui est jeté dans les cultures ou les tampons pour plusieurs raisons. En voici quelques-uns dont j'ai entendu parler :

  • Cultures bactériennes (par exemple E. coli BL21) optimisées pour exprimer (produire) des protéines, car on pense que le sorbitol augmente l'expression des protéines solubles. J'ai même entendu parler de personnes (qui travaillent avec des protéines très difficiles) qui ajoutent au final 0,6M de sorbitol dans leurs milieux de culture (notez que les cultures poussent très lentement).
  • Dans les tampons destinés aux protéines, car on pense qu'ils augmentent la solubilité (c'est-à-dire éviter l'agrégation), similaire à d'autres sucres tels que le glycérol ou les osmolytes tels que la bétaïne.
  • Le sorbitol est considéré (chimiquement) comme relativement inerte, et beaucoup préféreront donc ajouter du sorbitol plutôt que par ex. le glycérol ou le saccharose comme agents stabilisants lorsqu'ils travaillent avec des protéines.
  • Lorsque vous travaillez avec des glycoprotéines, vous dépendez généralement de l'ajout de sucre pour stabiliser la protéine d'intérêt - à la fois pendant l'isolement, la purification et l'analyse/les tests.

Le dernier point ici pourrait répondre à votre question, car les immunoglobulines sont des glycoprotéines, vous dépendez généralement d'une concentration élevée de certains sucres - tels que le sorbitol - pour travailler avec ces protéines (c'est-à-dire des antigènes et des anticorps) par exemple. immunoprécipitation.

Je ne crois pas que le sorbitol soit un agent de surpeuplement - car cela faciliterait peut-être l'agrégation, à l'opposé du but recherché. L'ajout d'agents d'encombrement se fait généralement dans la cristallographie des protéines avec l'ajout de divers PEG pour « obtenir » les protéines pour former des cristaux. Au lieu de cela, je pense que le sorbitol peut (d'une manière ou d'une autre) interférer avec la coque de solvatation des protéines - de la même manière que l'on suppose pour les osmolytes (par exemple, la bétaïne ou divers sucres); cependant, c'est quelque chose que je ne connais pas beaucoup et qui devrait être étudié.


Pourquoi ajouter du saccharose ? Rendements améliorés pour la préparation de virus adéno-associés

Vous avez probablement déjà entendu parler du service viral d'Addgene, mais saviez-vous qu'Addgene effectue également des recherches indépendantes ? Depuis le lancement du service viral en 2016, l'équipe de recherche d'Addgene étudie activement les moyens d'améliorer la production de vecteurs viraux. Qu'il s'agisse de reconcevoir des plasmides d'emballage viral, d'étudier différentes stratégies de production virale ou de développer de nouvelles méthodes d'analyse de données, l'objectif de notre équipe est de fournir aux scientifiques de nouveaux outils et protocoles qu'ils peuvent facilement intégrer dans leurs propres laboratoires. Cette semaine, nous avons le plaisir d'annoncer la soumission des résultats de notre première étude, accessible ici sur bioRxiv.


Pourquoi le sorbitol est-il utilisé dans les tampons ? - La biologie

Un aperçu des méthodes de fractionnement subcellulaire.

La séparation des compartiments cellulaires les uns des autres est une étape importante pour étudier une structure intracellulaire ou un organite ou une protéine spécifique, ou pour évaluer les associations possibles entre ces structures macromoléculaires. Le fractionnement subcellulaire utilise une ou plusieurs des propriétés de chaque compartiment, telles que la densité de flottabilité, la densité de charge de surface, la taille et la forme, et est principalement basé sur la centrifugation différentielle dans des milieux de haute viscosité à 4°C. Les milieux utilisés pour la centrifugation différentielle sont principalement le saccharose, le mannitol, le glycérol, le Ficoll 400 (un polymère de saccharose), le Percoll (un type de silice colloïdale) et l'iodixanol (OptiPrep, par exemple, le fractionnement cellulaire Hela ou THP1 pour le dosage de l'activité cGAS [4] ) . Le saccharose est largement utilisé car il est peu coûteux. Mais elles ont toutes leurs avantages et leurs limites, qui sont discutés en détail par Harford et Bonifacino, 2011. Ce sont principalement ces méthodes qui seront discutées ici, avec une préférence pour celles qui sont facilement accessibles à la plupart des laboratoires et prennent moins de temps, comme un prompt rétablissement est vital. La filtration sur gel, la chromatographie d'affinité, l'électrophorèse ou la perturbation sélective du décalage de densité peuvent également être utilisées. Les variations des conditions des protocoles disponibles dépendent du type d'organite, de tissu ou de cellule et de l'équipement utilisé, et il est fortement recommandé de lire les références citées pour plus de détails sur chaque procédure. Au final, la pureté et le rendement du fractionnement doivent être évalués par la détection de marqueurs distincts dans chaque fraction collectée pendant toute la procédure. Les méthodes d'isolement des condensats biologiques et des exosomes sont discutées ailleurs.

La centrifugation séquentielle peut être utilisée pour préparer les endosomes. Par exemple, les endosomes neuronaux ont été obtenus en lysant d'abord les neurones avec 20 fois d'aspiration à la seringue dans un tampon de lyse (250 mM de saccharose, 50 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM de MgCl2, 1 mM d'EDTA, 1 mM d'EGTA) avec un mélange d'inhibiteurs de protéase et puis centrifugation séquentielle à 1000 xg pendant 10 min, 16 000 xg pendant 20 min et 100 000 xg pendant 60 min à 4°C [5].

Les synaptosomes, ou terminaisons nerveuses isolées, sont couramment utilisés pour étudier la structure, les mécanismes moléculaires et les fonctions des synapses. La procédure générale pour les préparations synaptosomales implique l'homogénéisation du tissu cérébral suivie d'une centrifugation différentielle de l'homogénat à basse vitesse (600g ou 1000g) pour sédimenter les débris tissulaires, puis la centrifugation du surnageant résultant à grande vitesse (20.000g ou 14000g) pour séparer les mitochondries et les synaptosomes [1, 6]. La figure 1 montre un diagramme schématique des méthodes générales de préparation des synapses et des synaptosomes. Les synaptosomes peuvent être encore homogénéisés et centrifugés pour séparer les membranes synaptosomales du cytosol synaptosomal [7].

Les préparations de synaptosomes obtenues par de légères variantes de la méthode décrite ci-dessus ont déjà été utilisées pour plusieurs types d'études dans le domaine des neurosciences, en particulier des études qui déterminent les fonctions de protéines synaptiques spécifiques [8-10], l'analyse protéomique et phosphoprotéomique [11, 12] , et des études de gènes spécifiques à la maladie [8, 13] et de synthèse protéique locale dans les compartiments neuronaux pré- et postsynaptiques [14]. De plus, les synaptosomes ont été marqués avec divers composés et utilisés comme plates-formes pour charger les vésicules synaptiques avec les marqueurs souhaités [15].

Des réactifs commerciaux qui facilitent l'isolement des synaptosomes sont également disponibles, mais jusqu'à présent, moins populaires, très probablement en raison de leur coût plus élevé. Le réactif d'isolement de protéines Syn-Per Synaptic de Thermo Scientific a été utilisé par plusieurs groupes [16-19]. Le kit d'isolement de vésicules synaptiques Sigma Aldrich SV0100 a également été utilisé [20, 21], mais semble avoir été abandonné (Catalogue Sigma Aldrich du 11 octobre 2018). Les fractions synaptosomales déjà préparées peuvent être achetées auprès de Synaptic Systems (SySy).

Les fractions cytoplasmiques, nucléoplasmiques et chromatiniennes peuvent être facilement préparées à partir d'un culot de cellules cultivées [2]. Les cellules sont remises en suspension dans un tampon contenant 0,34 M de saccharose, 10 % de glycérol et une faible concentration d'un détergent doux (0,1 % de Triton X-100) ainsi que K + et Mg +2 (qui protègent les noyaux de la rupture) et les noyaux sont culotté par centrifugation à basse vitesse tandis que le surnageant est conservé comme fraction cytoplasmique. Ensuite, les noyaux sont lysés dans un tampon contenant des agents chélatants EDTA et EGTA et la fraction de chromatine insoluble est sédimentée par centrifugation à basse vitesse tandis que le surnageant est la fraction nucléoplasmique [2] (Figure 2).

Certains chercheurs utilisent une préparation « rapide et sale » de la chromatine avec ses protéines associées du cytoplasme/nucléoplasme. Ceci est simplement effectué en lysant les cellules dans un tampon de lyse contenant 1% de Triton X-100. Dans ce tampon, la chromatine et certaines structures du cytosquelette sont insolubles et peuvent être récupérées par centrifugation. Le culot peut être remis en suspension dans le tampon de choix, par exemple, Laemmli pour SDS PAGE [22].

Une fraction enrichie en cytosol peut être préparée avec 250 mM de saccharose et sans aucun détergent par centrifugation à 2000 g pour éliminer les noyaux et débris cellulaires et ultracentrifugation à 75 000 g pour éliminer les autres composants cellulaires [23].

  1. Les culots cellulaires, cultivés en monocouche ou en suspension, sont homogénéisés dans un tampon d'homogénéisation contenant du MgCl2 et KCl. Plus tard, du saccharose est ajouté jusqu'à 0,25 M et les noyaux sont sédimentés par centrifugation à basse vitesse (1000 g). Une seconde centrifugation du surnageant à 5000 g va sédimenter les mitochondries. Le culot est remis en suspension dans un milieu contenant du saccharose et du Mg +2 et est soumis à quelques coups doux dans un homogénéisateur Dounce. La dernière étape de centrifugation à 5000 g enrichira les mitochondries qui pourront être remises en suspension dans du tampon Tris contenant 0,25 M de saccharose ou dans le tampon de préférence pour les analyses ultérieures (e.g., Laemmli) [24].
  2. Les cellules de levure sont traitées avec de la zymolase pour briser la paroi externe dure et produire des sphéroplastes, qui sont lavés dans un tampon de sorbitol. Le culot est remis en suspension dans du tampon d'homogénéisation contenant 0,6 M de mannitol et les cellules sont lysées par quelques coups dans un homogénéisateur Dounce. Les noyaux sont retirés par centrifugation à basse vitesse, tandis que le surnageant contenant le cytoplasme est centrifugé dans un rotor à angle fixe à 6500 g pour agglomérer les mitochondries.

De plus, il existe des protocoles qui utilisent des séparations à gradient de densité qui fournissent des fractions mitochondriales plus pures, mais elles prennent plus de temps et sont évitées. Malgré la "contamination" par les lysosomes et les peroxysomes dans les fractions obtenues par les centrifugations différentielles, ils sont la méthode de choix. Par conséquent, la pureté souhaitée détermine la méthode la plus appropriée. Par exemple, si des études métaboliques présentent un intérêt, la centrifugation différentielle est préférée à titre d'alternative, si la localisation exacte d'une protéine est à l'étude ou si des échantillons de la forme la plus pure sont une nécessité, par exemple, en protéomique, les préparations à gradient de densité sont plus appropriées.

Les mitochondries peuvent également être immuno-isolées, le protocole MitoIP. Laflamme C et al ont isolé les mitochondries des cellules HEK293 transfectées avec 3xHA-eGFP-OMP25 (Addgene #83356) avec des billes magnétiques anti-HA de Thermo Fisher Scientific (cat # 88837) [25].

Les mitochondries ont une structure complexe comprenant la matrice, la membrane mitochondriale interne (IMM), l'espace intermembranaire et la membrane mitochondriale externe (OMM) qui est attachée à la membrane interne au niveau des "sites de contact". Des protocoles ont été publiés qui permettent l'enrichissement et l'isolement des différents compartiments mitochondriaux. L'isolement de l'OMM de la levure [26] et du foie de rat [27] impliquent tous deux l'isolement des mitochondries suivi d'un gonflement/rétrécissement osmotique pour libérer l'OMM suivi d'une centrifugation en gradient de densité pour produire une OMM hautement purifiée. Alors que la pureté est élevée, les rendements en OMM sont généralement de 1% de la protéine mitochondriale totale. Le détachement de l'OMM libère les protéines de l'espace intermembranaire. Les « mitoplastes » dépourvus d'OMM sont une source d'IMM enrichi. La lyse des mitoplastes libère les protéines de la matrice mitochondriale.

Des méthodes ont également été publiées pour l'isolement des membranes associées aux mitochondries (MAM) qui relient les mitochondries et le réticulum endoplasmique et jouent un rôle important dans le métabolisme des phospholipides [28-30].

Smith et al [31] ont utilisé un surnageant postnucléaire obtenu par centrifugation à 2 000 g, qui a ensuite été re-centrifugé à 20 000 g pendant 30 min. Le culot, qui contenait les peroxysomes et les mitochondries, a été remis en suspension dans du tampon MS (0,65 M de sorbitol, 5 mM de MES, pH 5,5) et a été placé au sommet d'un gradient de Nycodenz (17 %, 25 %, 35 %, 50 %) dans tampon MS. Après centrifugation à 116 000 g pendant 2h, les peroxysomes sont présents dans les fractions 2 à 8.

Une séparation supplémentaire des protéines associées à la membrane peroxysomale a été réalisée par la méthode de Fujiki (1982) et Nuttley et al 1990, comme cité dans [31]. Le culot de la centrifugation de 20 000 g susmentionnée a été remis en suspension dans 10 volumes de tampon Ti8 (Tris 10 mM, pH 8,0 et PINS (1 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 2 g de leupeptine/ml, 2 g d'aprotinine/ml et 0,4 g de pepstatine A /ml)) et séparés à 200 000 g pendant 1 h. Le culot, avec les membranes peroxysomales, a été remis en suspension dans du tampon Ti8 et par addition de carbonate de sodium 0,1 M et centrifugation subséquente à 200 000 g pendant 1 h, les membranes peroxysomales ont été séparées des protéines qui étaient associées mais non intégrées aux membranes. .

Les lysosomes, les mitochondries et les peroxysomes ont des densités très similaires dans les gradients de saccharose, il est donc préférable d'éviter cette méthode. Chez Percoll, ils sont plus denses et une telle méthode donne des lysosomes avec peu ou pas de contamination par d'autres organites.

Les cellules lavées sont homogénéisées en 5 passages dans un homogénéisateur dans un tampon de 3 mL contenant 0,25 M de saccharose. Une centrifugation de 800 g pendant 10 min va sédimenter les noyaux intacts et les débris et le surnageant est stocké sur de la glace. Le culot nucléaire est remis en suspension dans 0,5 mL du même tampon, re-centrifugé comme précédemment et le surnageant est regroupé avec le surnageant de la première centrifugation. Dans cette solution, la solution mère de Percoll (contenant 0,25 % de saccharose) et la sérumalbumine bovine (BSA) sont ajoutées à une concentration finale de 20 % (Remarque : cela peut être augmenté à 27 %-35 %) et 0,4 %, respectivement (finale volume 4,5 mL), et centrifugé à 36 000 g pendant 30 min (Remarque : cela peut varier de 15 000 g pendant 60 min à 62 500 g pendant 40 min). Le gradient est collecté avec un déchargeur de gradient en fractions de 0,4 ml et les lysosomes sont généralement proches du bas du gradient. Pour mieux solubiliser les lysosomes et augmenter la récupération, du NP-40 est ajouté à une concentration finale de 0,5%, avant d'être centrifugé à 100 000 g pendant 1-2 h. Mais si les organites intacts présentent un intérêt, par exemple pour les tests métaboliques, le NP-40 doit être évité [32].

Les lysosomes peuvent être immuno-isolés avec le protocole LysoIP. Des kits commerciaux pour l'enrichissement des lysosomes sont disponibles. Yoon I et al ont obtenu des lysosomes de cellules HEK293T avec le kit d'enrichissement de lysosome de Thermo Fisher Scientific en utilisant une centrifugation discontinue en gradient de densité Optiprep pour le Western blot [33] de même que MC Silva et al avec des neurones différenciés [34]. Laflamme C et al ont isolé des lysosomes de cellules HEK-293 transfectées avec Tmem192-3xHA (Addgene #102930) avec des billes magnétiques anti-HA de Thermo Fisher Scientific (cat# 88837) [25].

Kushimoto et al et Basrur et al ont utilisé un gradient discontinu de saccharose dans du tampon HEPES [35, 36]. Plus spécifiquement, le lysat cellulaire a été remis en suspension dans du saccharose 2 M et déposé au sommet d'un gradient de saccharose discontinu (1,0, 1,2, 1,4, 1,5, 1,6, 1,8, 2,0 M). Après centrifugation à 100 000 g pendant 1 h, les mélanosomes de stade précoce (stade I et II) ont été récupérés dans la zone d'environ 1,0 à 1,2 M de saccharose. Cette fraction enrichie a ensuite été séparée en fractions riches en tyrosinase et riches en protéines par électrophorèse à flux libre (FFE) sur un appareil Octopus-PZE FFE à 2,0 ml/h. La FFE a été réalisée à 1000–1100 V et ≈110–125 mA en utilisant du saccharose 0,25 M dans de la triéthanolamine, pH 7,4, avec un débit d'élution de 3–4 ml/min [36]. Cette procédure a donné des échantillons mélanosomiques hautement enrichis pour les analyses protéomiques qui ont identifié > 60 protéines mélanosomales [35].

Un autre protocole qui aboutit à des fractions mélanosomales d'une grande pureté a été développé par les mêmes chercheurs. Le lysat cellulaire dans du saccharose 2 M a été déposé en couche au bas du gradient de saccharose discontinu. Après centrifugation à 100 000 g pendant 1 h, les mélanosomes de stade précoce, qui ont été récupérés dans la zone d'environ 1 M de saccharose, ont ensuite été stratifiés au milieu d'un gradient étendu de 0,8, 1,0 et 1,2 M de saccharose et centrifugés à nouveau comme auparavant. Cette étape supplémentaire a complètement éliminé la "contamination" des mitochondries.

Les mélanosomes tardifs (stade III et IV) ont également été récupérés de la couche de saccharose 1,8 M, car ils contenaient une plus grande quantité de mélanine et étaient donc plus lourds.

Les histones sont les protéines les plus basiques de l'environnement intracellulaire. C'est la principale caractéristique utilisée pour enrichir les histones à partir de cellules ou d'extraits de Xenopus laevis. Remettre en suspension des noyaux intacts et purifiés (comme discuté précédemment) dans du HCl 0,2 M [37], ou de l'acide sulfurique (H2DONC4), et après incubation par rotation à 4°C, la plupart des protéines cellulaires précipitent alors que les histones restent solubles et sont récupérées par centrifugation à 16 000 g pendant 15 min [38]. Les détails peuvent varier. Alternativement, les histones chromatinisées peuvent être extraites par incubation dans 2,5 M de NaCl.

Une méthode d'isolement des membranes de Golgi a été utilisée par Chen et al [39]. Un homogénat de tissu hépatique préparé dans un tampon contenant 0,5 M de saccharose a été déposé au-dessus de 0,86 M de saccharose et celui-ci a été complété par 0,25 M de saccharose. Après centrifugation à 103 800 g pendant 60 min, les membranes ont été recueillies à l'interface 0,5-1,3 M et ajustées à 0,5 M de saccharose.

Les centrosomes peuvent être isolés par des cellules épithéliales en culture attachées, mais toujours pas en grande quantité. Andersen et al ont utilisé plus de 2 milliards de cellules (2x10 9 ) [40]. Les noyaux sont isolés par lyse hypotonique et les centrosomes sont récoltés après deux étapes de centrifugation. Tout d'abord, par centrifugation sur coussin de saccharose à 50 % et ensuite par centrifugation sur un gradient de saccharose à 40 %, 50 % et 70 %.

Moritz et al ont isolé des centrosomes d'embryons de drosophile comme suit : un homogénat (en tampon BRB80 + 100mM KCl et 14% saccharose) d'embryons de 3,5h a été centrifugé à 1500 g pendant 10 min et les lipides ont été éliminés. Le surnageant a été utilisé pour isoler les centrosomes après addition de 0,1-0,5% de Triton X-100 et 50% de saccharose (concentrations finales), par chargement sur un gradient de saccharose (4 ml de 55% et 3 ml de 70%) et centrifugation à 100 000 g pendant 90 minutes. La plupart des centrosomes se sont accumulés au-dessus du coussin de 70 % [41].

Les cellules migrantes forment une extension sur un côté, qui s'attachera à un nouveau site et tirera ensuite le reste du corps cellulaire vers le nouveau site. Cette extension est appelée pseudopode. Klemke et ses collègues [42] ont développé une méthode pour isoler le pseudopode du corps cellulaire en réponse à un agent chimiotactique. Ceci est réalisé en utilisant des chambres de migration Transwell dans des plaques à 6 ou 24 puits. Brièvement, on laisse les cellules se fixer sur la face supérieure du filtre qui a de petits pores de 3 microns. Ils sont suffisamment petits pour que les cellules entières ne puissent pas passer. Mais les pseudopodes formés peuvent passer et ils se fixeront sur la face inférieure du filtre, lorsque les cellules sentiront l'agent chimiotactique qui a été placé dans le compartiment inférieur. Ensuite, les cellules sont fixées et les pseudopodes ou les corps cellulaires peuvent être collectés par lyse dans le tampon de choix [43].

Song et al ont effectué un fractionnement subcellulaire à partir de foies de souris, mais cette méthode pourrait également être utilisée pour d'autres tissus, après quelques modifications [3]. Un schéma de la figure 3 résume l'ensemble de la procédure. Brièvement, l'homogénat de foie a été centrifugé à 1000 g pendant 10 min pour séparer le culot (P1) et une fraction soluble (S1).

P1 suspendu dans un tampon final contenant 1,8 M de saccharose (pour les recettes complètes de tampon, le lecteur est dirigé vers les publications originales) a été centrifugé à 70 900 g pendant 90 min et a donné un culot (P2) avec les noyaux de cellules hépatiques, qui peuvent être stockées, et une fraction soluble entre l'interface 0,25-1,8 M (S2). S2 a été remis en suspension dans 0,25 M de saccharose, centrifugé à 1 200 g pendant 10 minutes, et le culot contenant la membrane plasmique brute a été encore suspendu dans un tampon final contenant 1,45 M de saccharose et centrifugé à 68 400 g pendant 60 minutes. La fraction soluble entre le saccharose 0,25 à 1,45 M a été additionnée d'un tampon contenant 0,25 M de saccharose et re-centrifugée à 17 600 g pendant 10 min. Le culot a été remis en suspension dans un tampon final contenant 1,35 M de saccharose et centrifugé à 230 000 g pendant 60 min. La fraction 0,25 à 1,35 M a été récupérée, diluée avec du saccharose 0,25 M et re-centrifugée à 40 000 g. Le culot suivant contenait les protéines membranaires plasmiques purifiées et a été stocké.

La fraction soluble S1 a été re-centrifugée à 8.000 g pendant 15 min. Cela a donné une fraction insoluble (P5) qui contenait des mitochondries brutes et une fraction soluble (S5) contenant des ER (microsomes légers et lourds) ainsi que le complexe de Golgi.

Après lavage, P5 a été remis en suspension dans une solution de 12 ml contenant 25 % de Nycodenz [44] et déposé sur un gradient de Nycodenz discontinu (5 ml de 34 % et 8 ml de 30 %) et complété par 8 ml de 23 % et 3 ml de 20%. Après centrifugation à 52 000 g pendant 90 min, les mitochondries ont été récupérées à l'interface 25-30%. Cette fraction a été recueillie et diluée dans un tampon final qui a donné 200 mM de mannitol et 50 mM de saccharose avant d'être centrifugée à 15 000 g pendant 20 min. Le culot résultant contenant des mitochondries pures a été lavé et stocké.

La fraction soluble S5 a été centrifugée à 34 000 g pendant 30 min et a donné un culot (P6), et une fraction soluble avec les microsomes légers (S4). S4 a été centrifugé à 124 000 g pour séparer le cytosol, qui était stocké, des microsomes (pastille). P6 a été mélangé avec les microsomes légers de la centrifugation précédente et dilué dans un tampon final contenant 0,25 M de saccharose et 0,015 M de CsCl. La solution a été déposée sur une solution de saccharose 1,3 M et centrifugée à 237 000 g pendant 2 h. Cela séparait le RE brut (pastille) du RE lisse à l'interface 0,25-1,3 M. Cette fraction soluble a été diluée 1:1 avec du saccharose 0,25 M et centrifugée à 124 000 g pendant 60 min. Le RE lisse a été récupéré dans le culot et stocké [3].

Les noyaux neuronaux peuvent également être davantage isolés par tri nucléaire activé par fluorescence (FANS), au cours duquel les noyaux isolés sont fixés avec du paraformaldéhyde (ou de l'éthanol), marqués avec un anticorps anti-NeuN ou un autre anticorps nucléaire avec ou sans un anticorps secondaire approprié et contre-coloré avec de l'iodure de propidium ou du DAPI dans une solution contenant de la RNase A et des noyaux d'érythrocytes de poulet [45, 46], ou avec des variations pour, par exemple, RNA-seq à noyau unique [47], ChIP-seq, PLAC-seq ou ATAC- suite [48]. Les noyaux neuronaux diploïdes à déclenchement électronique sont ensuite déterminés par fluorescence PI/DAPI et immunomarquage par cytométrie en flux [45, 46].

Les granules de stress (SG), considérés comme un type de condensats biomoléculaires [49], sont des complexes ARN-protéines, qui sont générés en réponse aux effets de divers facteurs de stress exogènes [50], par transition de phase liquide-liquide. Chaque SG de mammifère contient une phase active externe, qui interagit dynamiquement avec le cytoplasme environnant, et un noyau ARN-protéine à haute stabilité [51]. Par rapport aux structures de stress des mammifères, les SG de levure se composent principalement de gros noyaux ARN-protéines avec des coquilles externes significativement plus petites.

L'isolement de SG standard est basé sur une centrifugation consécutive pour concentrer les noyaux de SG et une immunoprécipitation pour purifier les SG obtenues. Il existe plusieurs techniques pour générer des SG [52]. Des protocoles distincts ont été établis pour l'isolement des noyaux de SG ARN-protéines à partir de SG de mammifères et de levures [51]. Suite à l'induction de la SGc, les cellules sont généralement lysées par plusieurs passages via une aiguille 25G 5/8 sur glace. Pour l'enrichissement des scores SG, les lysats cellulaires sont centrifugés à 18 000 x g pendant 20 min à 4oC. La purification des SG peut être réalisée soit par des anticorps dirigés contre les structures de SG directement, soit par des anticorps contre des particules de SG marquées. L'analyse microscopique, l'exploration par spectrométrie de masse de la structure des protéines et l'évaluation des protéines à l'aide du gel SDS-PAGE sont généralement suggérées pour l'estimation de l'isolement efficace de la SG. Les problèmes potentiels liés à l'isolement des carottes de SG incluent un faible rendement de SG ou la détection de scores de SG dans des échantillons de contrôle intacts. Le faible rendement peut être corrigé en augmentant le volume d'échantillon initial ou en optimisant les anticorps pour l'immunoprécipitation. Il est recommandé de laver les cellules témoins dans un milieu cellulaire plutôt que du PBS pour éviter de détecter les SG dans les cellules non stressées.

Une nouvelle méthode de préparation de SG pour RNA-seq a récemment été développée [53, 54]. L'isolement d'ARN pour RNA-seq est effectué par la méthode basée sur TRIZOL. Les résultats RNA-Seq seraient confirmés par la méthode FISH. En bref, les cellules stressées sont fixées, colorées avec des sondes FISH et soumises à une imagerie en utilisant soit la fluorescence à champ large, soit la microscopie confocale.

Ces dernières années, plusieurs kits de fractionnement subcellulaire de cellules, obtenus à la fois à partir de cultures et de tissus, sont devenus disponibles dans le commerce. Ces kits commerciaux sont, en général, destinés à l'isolement rapide de fractions à partir de quantités relativement faibles de cellules/tissus (souvent 100 à 200 mg de cellules/tissu) sur une courte période (moins de 2 heures) et bon nombre des les kits ne nécessitent qu'une centrifugeuse de paillasse. Les kits de différents fabricants permettent différents degrés de fractionnement. Certains permettent un fractionnement en fractions cytoplasmique, membranaire, chromatine nucléaire et cytosquelettique tandis que d'autres offrent un fractionnement plus basique en fractions cytoplasmique, mitochondriale et nucléaire. Des kits existent également spécifiquement pour l'isolement des mitochondries à partir de cellules et de tissus. Par exemple, M Oginuma et al ont séparé les fractions nucléaires et cytoplasmiques des cellules iPS humaines avec le kit d'extraction nucléaire et cytoplasmique NE-PER (78833) de Thermo Fisher Scientific [55]. M Pradas-Juni et al ont obtenu des fractions cytoplasmiques et nucléaires à partir d'hépatocytes primaires fraîchement isolés à l'aide de Nuclei Isolation Kits : Nuclei EZ Prep de MilliporeSigma [56]. Virk HS et al ont préparé des lysats membranaires et cytosoliques pour le western blot en utilisant le kit d'extraction de protéines Mem-PER Plus de Thermo Fisher Scientific [57]. Liu Y et al ont obtenu la séparation nucléaire grâce au kit d'extraction nucléaire d'EpiGentek [58]. Wang L et al ont préparé des extraits nucléaires de cellules RAW264.7 avec le kit Nuclear Complex Co-IP (54001) d'Active Motif pour l'incubation avec l'ADN génomique du HSV-1 [59]. Lee YR et al ont séparé les fractions membranaires des cellules 293T, MEF ou PC3 pour les fractions cytosoliques avec le kit d'extraction de protéines membranaires natives ProteoExtract de Calbiochem pour étudier le recrutement membranaire de PTEM [60]. Saito T et al ont préparé des fractions nucléaires et cytoplasmiques à partir de foies et de cellules cultivées avec les réactifs d'extraction nucléaire et cytoplasmique NE-PER de Thermo Fisher pour le transfert de Western [61].

Pour de nombreuses utilisations, les kits commerciaux peuvent être une excellente approche, en particulier pour les laboratoires non spécialisés. Cependant, il existe des inconvénients potentiels. Les tampons d'isolement contiennent souvent des détergents qui peuvent interférer avec la fonction des protéines. En outre, la nature souvent exclusive des tampons rend difficile pour le chercheur plus expérimenté d'affiner l'isolement en fonction de la source cellulaire précise et/ou de l'utilisation finale des fractions isolées.

Certaines des fractions subcellulaires sont directement disponibles auprès de fournisseurs commerciaux, par exemple les microsomes de Sekisui XenoTech [62].

Si de grandes quantités d'un organite particulier ou d'une membrane subcellulaire sont nécessaires, il peut être nécessaire qu'il soit généralement peu pratique d'utiliser des méthodes impliquant des étapes de centrifugation en gradient de densité. Dans de tels cas, le protocole représenté sur la figure 3 peut être remplacé par un protocole basé uniquement sur la centrifugation différentielle. une centrifugation à basse vitesse (500 g pendant 10 min) donne une fraction nucléaire brute, une centrifugation à vitesse moyenne (10 000 g pendant 20 min) donne une fraction mitochondriale/peroxysomale brute, et une dernière étape d'ultracentrifugation (100 000 g pendant 60 min) donne une fraction microsomale brute) [63]. Comme pour tous ces protocoles, des variations existent [64].

Des méthodes ont été publiées pour l'isolement à grande échelle de membranes plasmiques enrichies à partir de fractions microsomales végétales et mammifères en utilisant un système aqueux à 2 phases [65, 66]. La partition dans un système Dextran/PEG à 2 phases est capable de produire des préparations de membrane plasmique d'une pureté de 85 à 90 % avec des rendements allant jusqu'à 20 %.

Un examen rapide de la littérature révèle une gamme apparemment déconcertante de différents protocoles pour le fractionnement subcellulaire. Cependant, en y regardant de plus près, la plupart sont des variations sur des protocoles établis de longue date. Les protocoles sont souvent affinés pour différents types de cellules et de tissus.

  • Quel(s) organite(s)/compartiment(s) cellulaire(s) je souhaite étudier ? Un ou plusieurs ?
  • A quoi est-ce que je veux utiliser les organites/compartiments isolés ? Par exemple, protéomique/lipidomique ou études fonctionnelles ?
  • De combien de matériel ai-je besoin ? De petites quantités pour l'analyse MS ou des quantités substantielles pour des études fonctionnelles détaillées ?
  • Quelle doit être la pureté des organites/compartiments ? Pour l'analyse protéomique quantitative, la pureté de chaque fraction peut être d'une importance primordiale. Pour les études fonctionnelles, il peut souvent être suffisant d'utiliser une fraction relativement enrichie brute plutôt qu'une fraction hautement purifiée.

Les réponses à ces questions aideront le chercheur à choisir le meilleur protocole de fractionnement subcellulaire pour ses besoins particuliers.

Suspendre l'homogénat de tissu végétal dans un milieu isotonique (0,35 mol/L de chlorure de sodium ou 0,4 mol/L de solution de saccharose) pour minimiser tout dommage aux chloroplastes. Centrifuger l'homogénat à 1000 rpm pendant 2 min pour éliminer les résidus tissulaires et les cellules restantes. Centrifuger ensuite à 3000 rpm pendant 5 min pour obtenir les pastilles de chloroplaste. La centrifugation doit être effectuée à 0

Oui. La force centrifuge n'endommage pas la structure mitochondriale. Par ailleurs, le tampon centrifuge a un rôle protecteur pour les mitochondries.


Objectifs du traitement des larmes artificielles

Bien qu'il existe de nombreux objectifs de traitement liés au patient, le but le plus courant des larmes artificielles est de réduire la sécheresse. Les humectants sont des composés qui favorisent l'hydratation et procurent une sensation de bien-être à l'application. Les larmes artificielles sont également des lubrifiants, ce qui signifie qu'elles diminuent la friction sur la surface oculaire causée par la paupière. Un autre objectif du traitement des maladies de la surface oculaire est d'augmenter la rétention des larmes. Les larmes artificielles le font en augmentant la viscosité des larmes, en augmentant l'adhérence des larmes à la surface oculaire, en diminuant l'évaporation des larmes et en diminuant la clairance des larmes. De plus, l'inflammation est connue pour jouer un rôle dans la sécheresse oculaire et il existe des composants lacrymaux artificiels qui diminuent l'inflammation en perturbant les processus qui favorisent le recrutement de cytokines [2]. Les larmes artificielles peuvent également réduire les rougeurs et l'enflure et servir à protéger l'œil de l'hyperosmolarité. L'osmolarité élevée du film lacrymal provoque la diffusion de l'eau hors des cellules épithéliales, déshydratant davantage la surface. Enfin, les larmes artificielles peuvent servir à adoucir et hydrater la surface oculaire en formant une couche huileuse qui emprisonne l'humidité existante présente dans les tissus.


Facteur X


Il est préférable de préparer des stocks concentrés de solutions tampons afin de gagner du temps et de l'espace. Ces stocks concentrés dureront longtemps et peuvent être facilement dilués pour être utilisés. These stocks are commonly labeled as X factors such as 10X, 5X, 100X etc. X-factor indicates that the solution is concentrated and must be diluted usually with water to 1X concentration for use.
For eg: - A 100X concentrated solution should be diluted to 100 fold.


Solubility: - A buffer solution should be fully soluble in water and sparingly soluble in other solvents. It is better to prepare concentrated stock solutions of these buffers such as 10X, 5X, or 100X at higher water solubility.


Permeability: - A buffer should not be permeable through biological membrane. If do so, it will change the required concentration in the cell or organelles but this buffer has high degree of fat solubility and there by permeate membrane. So it becomes toxic for most of the mammalian cells.


Ionic strength: - It is necessary to maintain physiological ionic strength of a system as it is an important factor for most of the enzymatic reactions. A change in normal ionic strength may affect the catalytic activity of enzyme.


Complex formation: - Complexes formed by buffer in the system should be soluble. Insoluble buffer complexes formed with metal ions may decrease the pH value by releasing protons.


Inert substances: - A buffer should be inert, i.e. it does not subject to any enzymatic or non enzymatic changes.


Matériaux et méthodes

Standard DNA extraction protocol

Sample grinding.

Effective tissue maceration is critical for good DNA yield. While mortar and pestle grinding with liquid nitrogen is optimal, the ability to process many samples quickly and simultaneously, is generally a prerequisite. The quantity of tissue used for a single tube mini-prep should be between 100–150 mg of fresh tissue or approximately 20–30 mg or 2 cm 2 in the case of silica gel or air-dried leaf material. Among the methods we tested, the most efficient one used prior lyophilization of fresh material, including fungal mycelium, in 2.0 ml microtubes. Two to three 20-second cycles of maceration in a bead mill (beadbeater, Model 1001, Biospec Products, Bartlesville, OK, USA) with approximately seven to ten 2.45 mm AISI 316 stainless steel ball bearings (measured using an improvised scoop), were usually sufficient to reduce dry samples to a fine powder. An alternative to lyophilization is freezing microtubes containing fresh tissue and ball bearings, along with the bead mill block, at -80°C, prior to maceration. Hard materials such as wood fragments still require freezing in liquid nitrogen. All of these methods could be scaled to a 96 x 1.2 ml polypropylene cluster tube format, if appropriate centrifuge and rotor are available.

Sorbitol pre-wash.

The sorbitol wash buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.35 M Sorbitol, 5 mM EDTA pH 8.0, 1% (w/v) Polyvinylpyrrolidone (average molecular weight 40,000 PVP-40)) was made ready for use by the addition of 2-mercaptoethanol (1% v/v) just before extraction. The buffer base may be stored at 4°C, for up to six months. An excess of sorbitol wash buffer, sufficient to fill sample tubes containing macerated plant material to approximately ¾ capacity (0.9–1.5 ml, depending on tubes used), was added. Tubes were capped and shaken for five seconds in the bead mill, shaken manually or mixed using a vortex. Tubes were inspected to confirm suspension of the powdered material and mixed again, if necessary. Samples were then centrifuged at 2,500–5,000 x g for five minutes at room temperature, where we found that 5,000 x g was the upper limit to avoid deformation or rupture of polypropylene tubes containing ball bearings. Different brands of tube should be tested empirically for resistance in pilot extractions. Following centrifugation, supernatants containing polysaccharides and polyphenols were carefully decanted or aspirated and discarded. For most species we have tested, we usually find the first supernatant to be lightly cloudy or clear and tan to light brown in color. In these samples, a single sorbitol pre-wash is sufficient. The sorbitol wash may be repeated, however, for especially challenging samples where the supernatant from the first wash is found to be viscous, densely turbid or dark brown in color. The pre-wash step(s) only adds 10–20 minutes to the standard CTAB protocol for a batch of 32 samples in 1.5 or 2.0 ml microtubes or a 96-well cluster tube array.

Sample lysis and extraction.

High salt CTAB lysis buffer, containing 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 3 M NaCl, 3% CTAB (cetyl trimethylammonium bromide), 20 mM EDTA and 1% (w/v) polyvinylpyrrolidone (PVP-40 average molecular weight 40,000), may be stored at room temperature, for up to six months. This lysis buffer is made ready for use by the addition of 2-mercaptoethanol (1% v/v) before extraction and pre-warmed to 65°C to aid pipetting. The pre-warmed lysis buffer was added to the sample tubes (500 to 700 μl or to approximately ½ the sample tube capacity) and the samples resuspended by shaking for five seconds in the bead mill or by vortexing. The ball bearings remaining in the tubes greatly assist the macerate mixing process. Tubes were then incubated in a water bath, oven or hot block at 65°C for a minimum of 30 minutes, up to 60 minutes, with mixing by inversion every ten minutes. Samples were then cooled at room temperature for five minutes. A volume of chloroform:isoamyl alcohol (24:1 v/v CIA), approximately equal to the lysis buffer, was added to the sample tubes, which were then shaken vigorously or vortexed for 10 seconds. This can be efficiently accomplished using the bead mill if desired. Samples were centrifuged at 2,500–5,000 x g for ten minutes at room temperature. The upper aqueous phase was carefully transferred to a new tube by pipetting, carefully avoiding disturbance of the debris between phases. Following extraction and centrifugation of the lysates, the aqueous phase was usually colorless or light tan. Although usually unnecessary, the CIA extraction can optionally be repeated with centrifugation at up to 13,000 x g (without ball-bearings) for 10 minutes and recovery of the upper phase to a fresh tube. Nucleic acids were precipitated from the recovered upper phase by the addition of 0.1 times its volume of 3 M sodium acetate pH 5.2 and 0.66 times its volume of cold isopropanol (stored at -20°C). Tubes were mixed by inversion and kept at -20°C for one hour. DNA was pelleted by centrifugation at 13,000 x g for 10 minutes at room temperature or, in case of 96 well cluster tube arrays, at the maximum allowable speed for the plate rotor. The supernatants were carefully decanted off and tubes drained by resting inverted on paper towels. Pellets were washed by the addition of 0.7–1 ml of 70% ethanol and tubes centrifuged for 10 minutes, as before. Supernatants were carefully removed by aspiration to avoid loss of the nucleic acid pellet and tubes left to dry open at room temperature for approximately one hour or vacuum dried at room temperature for 10 minutes. DNA pellets following isopropanol precipitation were usually small, compact, translucent and only rarely brownish, indicating that the pre-wash effectively removes polysaccharides and polyphenols. Pellets were then suspended in 100 μl TE containing 0.1 mg ml -1 DNase-free RNase A and incubated at 37°C for 30 minutes. The extracted DNA was stored at -20°C until required.

DNA quality evaluation.

DNA purity was estimated using a spectrophotometer, (Nanodrop 2000 Thermo Fisher Scientific). DNA yield was estimated, using a fluorimeter and fluorescent DNA-binding dye (Qubit TM dsDNA BR Assay Kit Thermo Fisher Scientific), according to the manufacturer´s instructions. DNA integrity was checked by agarose gel electrophoresis.

To test the effectiveness of the reported DNA extraction protocol, we performed a series of small-scale parallel DNA extractions, with and without the sorbitol pre-wash step. Leaves of several plant genera regarded as “demanding” in our laboratory were tested, including UNE. occidentale (Anacardiaceae) (Cashew), E. grandis (Myrtacées), Pereskia aculeata (Cactaceae), several different species of the genera Diplusodon et Lafoensia (both Lythraceae). DNA yields and purity were estimated spectrophotometrically. DNA quality was also inferred by a simple PCR amplification assay using the nuclear ribosomal ITS marker. Each reaction contained 1 X PCR buffer with 2.0 mM MgSO4, 0.2 mM dNTP’s, 0.2 M Trehalose, 0.3 μM each of the universal primers An5 and An4 [21], 1 U Taq DNA polymerase and 1 μl undiluted DNA. PCR cycling consisted of two minutes initial denaturation at 95°C then 35 cycles of 20 seconds at 95°C, 40 seconds at 55°C and 80 seconds at 72°C, followed by 7 minutes at 72°C. PCR products were analyzed using an ethidium bromide stained 1.5% w/v agarose gel, where the expected band size of the ITS fragment was approximately 650 bp.

Method variations

For applications requiring high yields and especially high molecular weight genomic DNA, such as long read single molecule PacBio sequencing (Pacific Biosciences, CA, USA), several grams of fresh tissue may be macerated with a mortar and pestle in the presence of liquid nitrogen. The extraction protocol is scaled up to use large 15-ml or 50-ml tubes or several microtubes in parallel and the DNA consolidated at the end. Gentle handling must be adopted throughout the entire procedure, using only slow vortexing and careful pipetting, preferably using wide-bore tips, including the resuspension of the tissue macerate following the sorbitol pre-washes. If the final DNA precipitate forms a visible clump, it should be recovered using a hook fabricated from a glass Pasteur pipette and transferred to a fresh tube to be washed with 70% ethanol. Otherwise DNA may be recovered by centrifugation for five minutes at 5,000 x g and washed with 70% ethanol. Following air drying for one hour at room temperature in an open tube, the DNA may be gently resuspended in an appropriate volume of water or buffer compatible with the intended downstream analysis. DNA integrity can be estimated using pulsed-field gel electrophoresis and the adequate fraction selected for downstream sequencing using the Blue pippin DNA size selection system (BluePippin Sage Science, Beverly, MA, USA).

RNA extraction protocol

For RNA extraction, the biological material was kept frozen at all times until the addition of sorbitol buffer. It is possible to freeze tubes containing samples and ball bearings at -80°C along with the bead mill sample block, before using the bead mill, but samples are frequently found to have thawed by the end of maceration. We also tried freezing tubes in liquid nitrogen before using the bead mill, but frequently lost samples because of broken tubes. If high throughput is not an issue, we prefer to macerate tissues using a mortar and pestle in liquid nitrogen for RNA extraction. Making sure to keep the tissue frozen with either liquid N2 or dry ice, macerated samples were transferred into 2.0 ml tubes. Immediately, an excess of sorbitol wash buffer with 1% 2-mercaptoethanol (v/v) was added to fill sample tubes to approximately ¾ capacity (0.9–1.5 ml, depending on tubes used). Tubes were capped and shaken in the bead mill, mixed using a vortex or manually. Tubes were inspected to confirm suspension of the powdered material and shaken again, if necessary. Tubes were then centrifuged at 2,500 x g for five minutes at room temperature, supernatants aspirated from samples and discarded. We routinely used two rounds of the sorbitol solution wash for RNA extraction.

RNA extraction is then continued, essentially as previously described [22]. High salt CTAB extraction buffer was made ready for use by the addition of 2% (v/v) 2-mercaptoethanol just before extraction and pre-warmed to 65°C. For minipreps in 2 ml microtubes, 1.0 ml of pre-warmed CTAB extraction buffer was quickly added. Tubes were then shaken vigorously and placed in a 65°C water bath for at least 20 minutes. The amount of tissue used for a single miniprep is dependent on type, we routinely use approximately 100 mg for fresh leaves and 80 mg for cambium.

About 750 μl of chloroform was added, tubes shaken vigorously and centrifuged for 10 minutes at 12,000 x g. The upper aqueous phase was carefully aspirated, transferred to a fresh tube and the chloroform extraction repeated. The upper aqueous phase was again carefully transferred to a fresh tube, placed on ice and an equal volume of a 7.5 M LiCl, 50 mM EDTA solution added. Following mixing by inversion, RNA was precipitated for two to four hours at -20°C and pelleted by centrifugation at 12,000 x g for 20 minutes at 4°C. Alternatively, precipitation can take place overnight at 4°C, but in our experience, there is usually no significant gain in yield. The supernatant was carefully removed and discarded, taking care not to lose the pellet, which was then dissolved in 500 μl SSTE. Samples were then extracted once with 500 μl chloroform, shaking or vortexing before centrifuging at full speed for ten minutes. The aqueous phase was transferred to a new microtube, two times its volume of 95% ethanol added and, following mixing, the RNA allowed to precipitate for a minimum of 15 minutes at -80°C. RNA was then pelleted by centrifugation at full speed for 20 minutes at 4°C. The supernatant was discarded, being careful not to lose the pellet, which was then washed with 200 μl cold 70% ethanol and centrifuged at full speed for five minutes. The supernatant was carefully aspirated. Pellets were then allowed to air dry, for 5 to 10 minutes and dissolved in RNase free water.

The protocols contained in this paper have been deposited, in detailed form, at protocols.io: http://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.tzfep3n.


Why is sorbitol used in buffers? - La biologie

Total RNA Isolation From Yeast

Based on handout by Dr. Karen Bernd, at Davidson College
http://www.bio.davidson.edu/Biology/GCAT/protocols/GCATRNA.html
Revised by Dr. Terrie Rife Back to Bio 480 Lab Schedule

This protocol will allow you to isolate enough total RNA from yeast to label for our microarray experiments. There are five basic steps we will go through--1. Growing the Yeast Cultures, 2. Preparing Yeast Spheroplasts, 3. Preparing Yeast RNA, 4. Determining the concentration of yeast RNA, 5. Checking the RNA for degradation using gel electrophoresis.

Remember as you step through this procedure that there are RNases (Enzymes that break down RNA) everywhere. Your hands and breath are two major sources. You should wear gloves throughout these procedures and avoid using your gloves to touch your skin or hair during the procedures. Do not directly breathe or talk over the tubes. Do not have anything unneeded on your benches and think the protocol through before you begin.

Your benches should be washed down with a special detergent called RNAZap (Ambion) that will help get rid of Rnases before you start the protocol.
Growth of Yeast Cultures

Cultures of wild-type and yeast containing various mutations will be started the day before the experiment. On the day of the experiment the cultures will be assessed to make sure both the mutant and wild type cells will have the same amount of yeast in them by the time class starts. Each section will be given one wild type yeast culture and a culture containing one of the mutant varieties that we have discussed in class.

Yeast are grown very similiarly to bacteria. Like bacteria, they have different phases of growth. The three phases of growth are called the lag phase, log phase and stationary phase. Yeast start off in something called lag phase, its called the lag phase because it takes awhile for cells to turn on the genes they need to start growing. Then they begin to double exponentially, this is called log phase. Finally, when the nutrients in the media are used up, the yeast enter into what is known as stationary phase where their growth stops. Reading the absorbance of a culture on a spectrophotometer at 600 nm is the way in which you can determine what phase of the yeast growth cycle you are in and how many cells you have. The results of these readings are measured as optical density units or O.D. We want to harvest our yeast cells in late log phase because we want yeast that are still growing and the maximum amount of yeast we can have in our culture. Haploid yeast cells only contain approximatley 1.2 pg of RNA per cell so we need a lot of cells to get the ug of RNA we need to work with! Below are some results from a growth curve experiment done by Bobby East, a student in a previous class. He started both a wildtype and a ZMS2 knockout culture at an O.D. of 0.3. How many hours does it take before the yeast in his experiment stop growing and enter stationary phase? If we start our yeast off at an OD of 0.3 at 8:30 a.m. in the morning, will they be in late log phase at 2 p.m. when we harvest them for our class? Let me know if you think we should modify our timing?

Growth Time for Yeast (Minutes)

OD 600 of WT OD 600 of ZMS2 Knockout
0 0.3 0.27
231 min. (

4 hours)

0.579 0.537
281 min. (

4.5 hours)

0.813 0.744
326 min. (

5.4 hours)

0.909 0.912
356 min. (

6 hours)

0.957 0.942
386 min. (

6.5 hours)

1.02 1.03
416 min. (

7 hours)

1.06 1.07
466 min. (

Preparing Yeast Cells by Making Spheroplasts


Yeast contain a hard cell wall. Spheroplasts are yeast cells where the cell wall has been enzymatically degraded. These spheroplasts are very fragile so we must be careful with them. Once we have spheroplasts it will be very easy to lyse the yeast cells and quickly release the RNA and proteins in the cell into a controlled environment where we can temporarly keep the cellular RNases from degrading the RNA. We don't want to lyse the cells before they are in this controlled environment.

1) Place 50 ml tubes containing 30 ml of the yeast cultures at the appropriate O.D. reading in the centrifuge next door (Make sure it is balanced). Centrifuge at 2,500 RPM (1,500 x G) for 5min to pellet the cells. Please share the centrifuge as there is only one.

The next 3 steps are called a wash--they serve to move the cells from the growth media into a solution that is correctly buffered for the next procedure.
2) Remove tubes from centrifuge. Carefully pour supernatant into the liquid waste container. Try not to disturb pellet. Add 1ml of Potassium Phosphate/Sorbitol buffer (1.2 M sorbitol, 10 mM potassium phosphate, pH = 7.2) and resuspend the pellet by pipetting.

3) Transfer the cells from each conical tubes into separate 2 ml microcentrifuge tubes (these are colored). Spin at 80% for 3min.

4) Pour off supernatant (without disturbing pellet). Remove remaining supernatant with pipet Resuspend pellet in 1ml Potassium Phosphate/Sorbitol buffer.

5) Take tubes to the fume hood. Add:

  • 3µl b mercaptoethanol (a reducing agent that smells very bad)
  • 320 µl of 1 mg/ml lyticase (enzyme that degrades cell wall components)

6) Place tubes in shaker at 30°C for 15min.
The cells are now spheroplasts. Without a cell wall they are alive but strucutrally much weaker.

Right before breaking the cells we must get rid of the lyticase and b -MeOH.
7) Spin in microcentrifuge at 40% for 3 min. Remove supernatant by pipetting (discard in hood to contain the smell).

8) Add 500µl potassium phosphate/sorbitol buffer. Repeat step 7 (one time).

9) While centrifuging get an ice bucket ready containing:

BE EXTRA CAUTIOUS ABOUT RNASES FROM HERE ON .

The RNA isolation will be done using the RNAsafe kit from Qbiogene. Solution 1 and 2 contain ions and detergents that will inactivate cellular RNases that are released when you lyse the cells and help to break through the cell membrane. Eventually you will spin the mixture down and get rid of all of the proteins in the solution and the 900 ul you take out in step 15 should contain mainly nucleic acids. The next few steps help to remove the DNA from the solution.

10) Resuspend pellets from step 9 in 800ul Solution 1 by gently flicking tube.

11) Pour glass beads from tube in icebucket into tube containing cells.

12) Add 200µl of Solution 2 to each cell+bead tube. Solution 1 and 2 contain buffers and chaotropes that will help stabilize the RNA in solution).

13) Vortex the cells on high for 10 cycles of vortexing / ice alternatations ( 1 cycle = 30 seconds of vortexing / and then 30 seconds on ice). This step breaks open the yeast by brute force.

14) Incubate tubes for 2min on ice.

15) Centrifuge at 95% for 10min.

16) Transfer 900µl of supernatant to a clean tube (if you can't get this much it is okay just adjust the isopropanol amount in the next step).

AVOID ALL DEBRIS at the bottom of the tube as well as 'gunk' layer at the top. It is better to take less than 900ul and avoid 'gunk'. The debris contains membranes, unbroken cells, and proteins. Since the yeast contain cellular RNases (a protein) it is important to separate them from your RNA.

17) Add 900µl isopropanol to each tube. Mix by inverting the tubes. Then allow to set at RT for 2 min.

18) Centrifuge tubes at 95% for 5min to pellet the RNA precipitate.

19) Carefully decant the supernatants by inverting a tube and giving it a decisive flick to remove all the supernatant.

20) Spin the tubes again for 30 sec and remove any residual supernatant with a pipetman.

21) Resuspend each pellet in 200µl Solution 3. Make sure pellet is resuspended--flick it, vortex it, make sure the pellet is gone.

22) Add 40µl Solution 4 to the samples. Mix by vortexing for 10sec.(Solution 4 contains a resin that binds DNA but not RNA)

23) Incubate in your rack at room temp for 5min.

25) Carefully MOVE the SUPERNATANT to the correct clean tube. Make sure it is well labeled as you will need to store this in the freezer until next week. Always keep your RNA on ice.

The concentration of RNA is read by measuring the absorbance of a sample at A260 on a spectrophotometer. The RNA sample is placed in a quartz cuvette in order to read the optical density (OD). Common glass and plastic will also absorb at this wavelength so special quartz cuvettes that do not absorb light at this wavelength are used to measure the absorbance of the RNA. Be very careful with these, as they are very expensive.

You will need to use it to determine the concentration of your RNA. Scientists have determined an absorbence coefficient to use to determine the concentration of RNA in your sample preparation. An RNA with the concentration of 40 ug/ml has an optical density of 1 at A260. When you get the reading of your sample you can use this information to find out how much RNA you have.

To get your reading put 20 ul of your sample in 1 ml of water and place it in a quartz cuvette. Once you obtain your reading the equation should be used to help you determine your sample concentration

O.D. reading x ((40 ug/ 1000 ul )/ 1 O.D. unit )x dilution factor = concentration in ug/ ul

The dilution factor in this case would be 1000/20 = 50 since you dissolved 20 ul in 1000 ul of water.

Scientists often measure the absorbence of their RNA sample at A280 as well as A260. Both proteins and nucleic acids absorb light at 280 nm. By obtaining the ratio of A260/A280 scientists can thus get an idea of the purity of their RNA sample. For pure RNA without a lot of protein this ratio should be 1.9-2.2.
Checking the RNA for degradation using gel electrophoresis

You will use 2 ug of RNA to run on a 1.2% agarose gel at 100 V for 1/2 hour.

To each sample of RNA add the appropriate amount of loading dye and 1 ul of Ethidium Bromide

Remember to wear gloves and safety glasses as Ethidium Bromide is a mutagen.

Several groups can run on one gel. We are looking for the ribosomal RNA bands. They should look very distinct and not degraded for the best quality RNA. See the picture below for an example using rat RNA.


Q: The rate of reaction in terms of the "rate law expression" includes the rate constant (k), the conce.

A: Click to see the answer

Q: Why we use ethanol to rinse the crystal instead of distilled water Better yield of crystal can be ob.

A: Hello. Since you have posted multiple questions and not specified which question needs to be solved.

Q: Consider the titration of a 25.0mL sample of 0.195M acetic acid (CH3COOH) with 0.300M NaOH. Determin.

A: Buffers find variety of uses in chemical reactions requiring constant pH. They are prepared by addin.

Q: Most of the ultraviolet radiation reaching the surface of the earth is UV-A radiation, which has a w.

A: Click to see the answer

Q: The first-order reaction of decomposition of azomethane is given below: CH3―N═N―CH3(g) →N2(g) + C2H6.

A: Given: Rate constant= 2.45 x 10-3 s-1

Q: Which of the following reagents do not react with ketone carbonyls (Question 3)

A: Please find below the reactions taking place with each reagent

Q: 6.72 Many portable gas heaters and grills use propane, CHg(g), as fuel. Using standard enthalpies of.

A: Answer 6.72 The combustion reaction of propane is as follows This process follows Hess's Law. Stan.

Q: Consider the titration of a 25.0mL sample of 0.195M acetic acid (CH3COOH) with 0.300M NaOH. How many.

A: During titration, the point at which the moles of added titrant becomes equivalent to moles of that .

Q: You are holding two balloons of the same volume at STP. One balloon contains 1.0 g of helium. The ot.


Examples of Osmotic Pressure

Wilting Plants

Many plants actually use osmotic pressure to maintain the shape of their stems and leaves.

If you have kept potted plants, you probably know that your plants can become very wilted very quickly if they are not watered. But within just minutes of watering, they can perk right back up!

This is because the stems and leaves of many plants are essentially “inflated” by osmotic pressure – the salts in the cells cause water to be drawn in through osmosis, making the cell plump and firm.

If not enough water is available, the plant will wilt because its cells are becoming “deflated.” In scientific terms, they are “hypertonic” – which means “the concentration of solute is too high.”

Plants can also demonstrate the power of osmotic pressure as they grow.

You may have seen plants springing up through asphalt, or tree roots growing through bricks or concrete.

This, too, is made possible by osmotic pressure: as plants grow, their cells draw in more water. The slow but inexorable pressure of water moving through the plant cell’s membranes can actually push through asphalt!

Effects of Dehydration – And Overhydration

We all know the dangers of dehydration, where lack of water can cause dangerous effects in our body. What we might not realize is that these effects are directly related to osmotic pressure.

When our bodies don’t have enough water, water can actually move out of our cells into our blood. This can cause the concentrations of salts and other solutes in our cells to become too high, interfering with cellular function.

When we drink water, the water enters the body through our bloodstreams, and is able to diffuse back into our cells through osmosis, restoring their proper function.

The opposite is also possible: it is actually possible to die from drinking too much water.

It is hard to accidentally “overdose” on water, but in extreme cases such as water-drinking contests, it is possible to drink so much water that too much of it diffuses into your cells. In extreme cases this can cause swelling of the brain.

Rapid rehydration after severe dehydration can be dangerous for the same reason. It is advised to undertake rehydration slowly, because filling dehydrated cells suddenly with large volumes of water can cause them to burst!

The graphic below shows how dehydration – or overhydration – can affect our blood cells by causing them to shrivel or burst:


Chromatography and pH

There are several ways that the pH of a mobile phase can change. Perhaps the most obvious is when an injection is made and the sample and mobile phase mix &mdash especially if the sample&rsquos pH is significantly different to the mobile phase pH. A mobile phase can also absorb carbon dioxide on standing, this makes it more acidic, similar to ocean absorbing CO2 de l'atmosphère.

pH is important in chromatography because the retention time of the sample&rsquos components can be pH dependent. If the pH changes, the retention time will change making the analysis much more difficult. For further information in this area, an article highlighting the importance of buffers is: Controlling Selectivity on Zwitterionic HILIC Columns by Adjusting pH and Buffer.