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Pourquoi la bêta-actine est-elle couramment utilisée comme contrôle dans les transferts Western ?

Pourquoi la bêta-actine est-elle couramment utilisée comme contrôle dans les transferts Western ?


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Il s'agit de la question du western blot. L'article : http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1931312813001145. Dans l'expérience de western blot dans cet article, ils utilisent la bêta-actine comme contrôle. Et j'ai également vu d'autres articles de recherche utiliser également la bêta-actine comme contrôle. Alors pourquoi la bêta-actine est-elle utilisée, pas un autre gène ? est-ce parce qu'il s'exprime dans toutes sortes de cellules ?


La β-actine appartient à une classe de gènes appelés gènes de ménage. Leurs protéines remplissent généralement des fonctions requises dans pratiquement tous les types de cellules (par exemple, la -actine fait partie des microfilaments du cytosquelette) et sont supposé * ne pas être affecté par les conditions expérimentales. En Western blot, ils sont exécutés en tant que « contrôle de chargement » pour montrer que des quantités très similaires de protéines ont été chargées dans chaque voie. Ceci est absolument essentiel dans certains systèmes expérimentaux où il peut ne pas être possible de toujours collecter exactement le même nombre de cellules pour chaque échantillon, comme lorsque vous travaillez avec des cellules primaires, des échantillons de tissus ou des systèmes où vous pouvez modifier la synthèse des protéines, la taille des cellules /nombre, ou apoptose.

Il existe de nombreux contrôles de charge différents parmi lesquels choisir, et certains peuvent être dictés par le type de cellule/tissu que vous examinez - par exemple, lorsque vous travaillez avec des cellules souches, vous voudrez peut-être montrer que vos conditions expérimentales n'ont pas induit de différenciation dans le cellules, donc un marqueur de pluripotence comme Oct-4A ou Sox2 peut être choisi. Dans d'autres cas, vous pouvez examiner des lysats fractionnés (une préparation membranaire, uniquement les noyaux, les mitochondries, uniquement la fraction soluble, etc.) et ainsi choisir respectivement Na/K ATPase, Histone H3, COX IV ou GAPDH.

Le choix du contrôle de charge peut également être influencé par la (les) taille(s) de la (des) protéine(s) que vous analysez, étant donné que les enquêteurs décapent fréquemment les Western blots et les sondent avec le contrôle de charge, ou analysent deux espèces différentes et détectent avec des couleurs différentes. anticorps secondaires lors de la réalisation de westerns fluorescents. Dans les deux cas, vous souhaitez que votre contrôle de chargement soit d'une taille différente de celle de vos cibles d'origine.

Enfin, tout cela suppose que le chercheur a déjà tenté de charger des quantités égales de protéines totales par piste en utilisant l'une des diverses méthodes de quantification de la concentration en protéines. Ceux-ci incluent les tests de type Bradford, Lowry et BCA, qui peuvent ou non être compatibles avec les détergents, tachant la membrane après transfert avec des colorants tels que Ponceau S, SYPRO Ruby ou l'encre de Chine, ou tachant le gel avec du Coomassie ou d'autres taches compatibles.

*En réalité, certains scientifiques prennent de plus en plus conscience que de nombreuses expériences faire affectent un certain nombre de gènes « de ménage », mais lorsque la plupart voient des variations, par exemple, par Western blot ou qPCR, ils choisissent souvent un contrôle de charge différent à utiliser.


Le contrôle de la bêta-actine garantit que l'effet que vous voyez dans l'expression des protéines n'est pas dû au changement global de la synthèse des protéines.

Par exemple, si vous étudiez une maladie, cela peut entraîner un changement dans le métabolisme, une perte de poids, une perte de capacité à synthétiser différentes protéines ou à absorber les acides aminés de l'alimentation. Vous devez contrôler cela, et quelque chose d'aussi universel que l'actine est une option.


Les contrôles de chargement sont couramment utilisés dans les techniques d'électrophorèse sur gel, telles que le buvardage occidental, pour vérifier que les voies de gel ont été uniformément chargées avec le matériel d'échantillon, et ils sont généralement utilisés pour normaliser les résultats de ces études. Étant donné que les protéines des contrôles de chargement sont abondamment exprimées, elles permettent également aux chercheurs de déterminer s'il y a un transfert uniforme sur l'ensemble du gel. Un contrôle de chargement est absolument nécessaire lorsque des western blots sont préparés pour la publication.

Origine : Cellule entière / cytoplasmique
Poids moléculaire (kD) : 43
La bêta-actine est l'une des six isoformes de l'actine. L'actine est une protéine globulaire d'environ 42 kDa présente dans toutes les cellules eucaryotes (à l'exception des spermatozoïdes de nématodes) où elle peut être présente à des concentrations supérieures à 100 microM. C'est également l'une des protéines les mieux conservées, ne différant pas de plus de 20 % chez des espèces aussi diverses que les algues et les humains. C'est la sous-unité monomérique des microfilaments, l'un des trois composants majeurs du cytosquelette, et des filaments fins, qui font partie de l'appareil contractile des cellules musculaires. Ainsi, l'actine participe à de nombreuses fonctions cellulaires importantes, notamment la contraction musculaire, la motilité cellulaire, la division cellulaire et la cytokinèse, le mouvement des vésicules et des organites, la signalisation cellulaire et l'établissement et le maintien des jonctions cellulaires et de la forme cellulaire. Ce contrôle de chargement n'est pas adapté aux échantillons de muscles squelettiques. Les changements dans les conditions de croissance cellulaire et les interactions avec les composants de la matrice extracellulaire peuvent altérer la synthèse des protéines d'actine (Farmer et al, 1983).


Quels sont les gènes d'entretien?

Les gènes de ménage sont ainsi nommés car ils expriment des protéines dont les fonctions sont destinées au maintien des fonctions cellulaires de base. On pense qu'ils sont exprimés de manière constitutive avec peu de modifications du modèle d'expression.

Les gènes d'entretien courants utilisés pour normaliser les Western blots comprennent : la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GADPH), la bêta-actine, la tubuline ou la protéine de choc thermique 90 (HSP90).

On dirait qu'ils devraient être de bons contrôles, mais il y a des raisons majeures pour lesquelles les gènes d'entretien peuvent vous causer des problèmes.


Quels sont les contrôles de chargement les plus utilisés pour le Western Blot ?

Les anticorps de contrôle de charge sont parmi les anticorps les plus utilisés dans la recherche. Les anticorps contre plusieurs cibles différentes sont couramment utilisés et il n'est pas toujours évident de choisir. Nous fournissons un guide sur certains des types d'anticorps de contrôle de charge les plus couramment utilisés.

Pourquoi ai-je besoin d'un contrôle de chargement pour le Western Blot ?

  • Les contrôles de chargement sont essentiels pour des Western Blots dignes de publication. Ils vous permettent de vérifier que la charge en protéines est la même sur tout le gel, le niveau d'expression du contrôle de charge ne doit pas varier entre les différentes lignes d'échantillons.
  • Par exemple, ils peuvent être utilisés pour vérifier qu'il y a eu un transfert uniforme du gel à la membrane sur l'ensemble du gel.
  • Cela aide à protéger contre ce que l'on appelle « l'effet de bord », c'est-à-dire qu'en cas d'utilisation d'un grand nombre de voies, les protéines des voies externes sont transférées vers la membrane dans une position proche du cadre. Cela peut entraîner des taches plus intenses sur le bord qu'au milieu du gel. Les contrôles de chargement peuvent indiquer si cela s'est produit et permettre de prendre en compte cette variation.
  • Une fois que vous avez établi qu'il n'y a pas de grandes différences dans les niveaux de protéines, les contrôles de charge peuvent alors être utilisés pour normaliser petites variations de niveaux. Ils peuvent être utilisés pour quantifier les quantités de protéines dans chaque voie et normaliser les niveaux d'expression de votre protéine d'intérêt pour le contrôle de charge

Que rechercher dans un contrôle de chargement ?

Qu'est-ce qui fait un bon contrôle de chargement, demandez-vous ? Vous devez rechercher des protéines qui présentent un niveau d'expression constitutif élevé dans le type de cellule que vous examinez, car cela signifie qu'il aura des niveaux d'expression élevés constants. Pour cette raison, les gènes « de ménage » sont fréquemment choisis comme témoins de chargement. Deuxièmement, votre protéine de contrôle de charge doit avoir un poids moléculaire différent de celui de la protéine d'intérêt, cela garantit que les bandes sont distinctes et que les niveaux d'expression de votre protéine sont quantifiables.

Donc, pour vous aider, nous avons pensé décrire nos neuf principaux contrôles de chargement et vous donner des liens vers les recherches de ces contrôles de chargement ici sur CiteAb pour vous assurer de trouver le meilleur.

Cellules entières et protéines cytoplasmiques

Convient pour les extraits de cellules entières et cytoplasmiques

Ne convient pas aux échantillons de muscle squelettique –

Brève description – L'actine se présente sous trois formes principales. L'alpha-actine est un composant majeur de l'appareil contractile du muscle squelettique. Les actines bêta et gamma sont présentes dans la plupart des types cellulaires, où elles sont responsables du trafic, de la motilité et de la structure cellulaires.

L'actine est présente dans toutes les cellules eucaryotes, à l'exception des spermatozoïdes des nématodes. Leurs gamètes mâles ne savent pas nager, mais font plutôt des mouvements amibiens pour se diriger vers l'œuf. Exceptionnellement, ils n'utilisent pas d'actine pour cela, qui est la protéine la plus couramment utilisée pour effectuer des mouvements amibiens dans les cellules, ils utilisent la protéine MSP.

Convient aux extraits de cellules entières et cytoplasmiques

Brève description – Sert à décomposer les molécules de glucose et de carbone en agissant comme un catalyseur au cours de la sixième étape de la glycolyse. Présent dans la plupart des types de tissus et de cellules, bien que l'expression puisse différer d'un tissu à l'autre.

L'hypnose, le diabète et certains types de cancer peuvent augmenter l'expression de la GAPDH.

Convient pour les extraits de cellules entières et cytoplasmiques

Poids moléculaire – 50 – 55kD

Brève description – Composant principal des microtubules, la tubuline est exprimée de manière élevée et constante d'une espèce à l'autre. Les microtubules sont impliqués dans le maintien de la forme cellulaire et le positionnement des organites. Ils sont également importants dans la division cellulaire, y compris la formation de fuseaux mitotiques.

Les médicaments antimicrobiens et antimitotiques peuvent affecter l'expression de la tubuline.

Protéines mitochondriales

Convient aux protéines mitochondriales –

Brève description – La protéine de canal sélectif anionique dépendant de la tension 1 est également appelée porine 31 HL/HM ou porine plasmalemmale. Exprimées dans tous les tissus et conservées à travers les espèces, les VDAC1 sont des protéines bêta-baril qui traversent la membrane cellulaire, agissant comme un pore à travers lequel les molécules peuvent diffuser.

Convient aux protéines mitochondriales –

Brève description – L'anticorps COX IV (dit « Cox 4 ») est réactif avec la protéine COX IV, généralement exprimée à un niveau élevé et constant, cet anticorps constitue un contrôle de charge efficace pour les mitochondries. Cependant, sachez que de nombreuses protéines ont le même poids moléculaire que la COX IV, VDAC1 constitue un bon contrôle de charge mitochondrial alternatif pour les protéines de cette taille.

Protéines de l'enveloppe nucléaire

Convient aux protéines d'enveloppe nucléaire –

Brève description – La famille des protéines des lamines constitue la lame nucléaire, une matrice bidimensionnelle de protéines trouvée à côté de la membrane nucléaire interne. Hautement conservées d'une espèce à l'autre, les protéines lamines seraient impliquées dans la stabilité nucléaire, la structure de la chromatine et l'expression des gènes. Ce contrôle de chargement n'est pas adapté aux expériences où l'enveloppe nucléaire a été retirée.

Convient aux protéines nucléaires –

Brève description – La protéine de liaison TATA (TBP) est un facteur de transcription qui se lie spécifiquement à la boîte TATA, une séquence d'ADN présente dans la région promotrice des gènes archéens et eucaryotes. Il aide à positionner l'ARN polymérase II sur le site de transcription au début du gène, mais ne se trouve que dans 10 à 20 % des promoteurs humains qui ont des boîtes TATA, ce n'est donc probablement pas la seule protéine impliquée dans le positionnement de l'ARN polymérase II.

Convient aux protéines nucléaires –

Brève description – Histone de base impliquée dans la structure des nucléosomes de la chromatine chez les eucaryotes, l'histone H2B possède un domaine globulaire principal et une longue queue N terminale.

Convient aux protéines nucléaires –

Brève description – Protéine hautement conservée, la PCNA aide à augmenter la processivité de la synthèse des brins principaux lors de la réplication de l'ADN. Le PCNA est rapidement dégradé lorsque les voies d'endommagement de l'ADN sont activées.

Donc, c'est tout de nous – s'il vous plaît laissez un commentaire s'il y a des contrôles de chargement que vous recommanderiez fortement.


RÉSULTATS

Validation de la PCR compétitive

Le titrage de chaque compétiteur de gène domestique contre des aliquotes constantes d'ADNc de cellules fluides BAL dans des expériences de changement de rapport a montré que, dans chaque cas, les rapports suivaient la ligne prédite pour des rapports de sortie supérieurs à environ 0,1 (figure 1). De même, le titrage en série de l'ARNc pAW109 compétiteur de l'IL-2 contre l'ARN PBMC stimulé par la PHA suivi d'une RT-PCR subséquente a produit des rapports de sortie qui ont changé proportionnellement aux rapports d'entrée. Ainsi, les produits PCR GAPDH, -actine et IL-2 étaient en concurrence égale avec leurs modèles concurrents respectifs, permettant de calculer les copies d'entrée de l'ARNm.

Test d'efficacité d'amplification égale de la PCR compétitive par titrage du concurrent. (A) PAGE de la RT-PCR compétitive IL-2 d'une série de rapports d'entrée changeants avec une quantité croissante de concurrents de gauche à droite. (B)–(D) Les ratios de sortie natifs/concurrents de chaque série sont représentés par rapport aux ratios d'entrée par rapport à un ou deux ratios de sortie les plus proches de 1. Les données réelles se trouvent près de la ligne de prédiction où les ratios de sortie sont égaux aux ratios d'entrée. La ligne de prédiction est indiquée par une ligne en pointillés avec une pente de 1. (B) IL-2 RT-PCR en double ont été menées pendant 35 et 40 cycles. Les titrages de -actine (C) et de GAPDH (D) ont été répliqués (objets ouverts et fermés) à 40 cycles.

Expression des gènes GAPDH et -actine

Les taux d'ARNm de GAPDH et de -actine étaient significativement corrélés dans les deux tissus de biopsie (r 2 =0,48, n=85, p=0,0001) et cellules fluides BAL (r 2 =0,51, n=97, p=0,0001 fig 2A et B). Les coefficients de corrélation indiquent que seulement la moitié de la variabilité de l'un est expliquée par l'autre, suggérant qu'à la résolution de cette méthodologie, les niveaux d'ARNm de GAPDH et de -actine ne sont pas équivalents. De plus, l'expression du gène GAPDH était plus variable dans les échantillons de biopsie et était environ cinq fois plus faible dans les cellules fluides BAL que l'expression de la -actine.

Corrélations de Pearson entre la GAPDH et l'expression du gène de la -actine dans l'ARN de (A) cellules de fluide BAL et (B) tissu de biopsie.

Comparaisons transversales de l'expression des gènes

L'expression génique de la -actine et de la GAPDH a été comparée en ce qui concerne le statut atopique, le statut asthmatique et l'utilisation des ICS. L'expression du gène GAPDH dans les échantillons de biopsie de sujets asthmatiques n'utilisant pas d'ICS (moyenne des moindres carrés (SE) 8,1 (1,3) × 10 5 copies d'ARNm/μg d'ARN) était significativement plus faible que dans les échantillons de biopsie de témoins normaux (1,1 (0,1) × 10 7 Copies d'ARNm/μg d'ARN, différence médiane 1,0 × 10 7 , intervalle de confiance (IC) à 95 % 0,68 à 1,4 × 10 7 , p=0,0001) et de sujets asthmatiques utilisant des CSI (1,2 (0,2) × 10 7 copies d'ARNm/μg d'ARN , différence médiane 1,1 × 10 7 , IC à 95 % 0,71 à 1,5 × 10 7 , p = 0,0001, fig 3A). Les sujets asthmatiques en tant que groupe, qu'ils prennent ou non des CSI, étaient significativement différents des témoins (7,1 (1,9) × 10 6 copies d'ARNm/μg d'ARN, différence médiane 3,9 × 10 6 , IC à 95 % 1,9 à 5,9 × 10 6 , p= 0,0003). Les niveaux de cellules BAL de -actine et d'ARNm de GAPDH ont montré des différences similaires entre les groupes comme les niveaux d'ARNm de GAPDH de biopsie, avec des valeurs p correspondantes (fig. 3B et D). Ces différences dans l'expression des gènes contrastent avec le profil des types cellulaires dans le liquide BAL qui ne différait pas significativement entre les groupes de patients (tableau 2).

Profils des principaux types de cellules dans les échantillons de cellules fluides BAL*

Comparaisons transversales de l'expression des gènes GAPDH et -actine. Expression du gène GAPDH dans (A) tissu de biopsie et (B) cellules fluides BAL. Niveaux d'ARNm de -actine dans (C) tissu de biopsie et (D) cellules fluides BAL. Les niveaux d'ARNm dans le tissu de biopsie ont été corrigés pour la contamination par des séquences de pseudogènes. Les petites différences entre le nombre de points de données dans les figures et le nombre d'échantillons dans le tableau 1 sont dues au faible pourcentage de réactions échouées attendues. Les réactions ayant échoué n'ont pas été répétées afin de réduire le potentiel de biais systématique.

L'expression de l'ARNm de l'-actine dans le tissu de biopsie différait en ce que les asthmatiques prenant des ICS étaient similaires à ceux qui n'en prenaient pas (p = 0,26, fig 3C). Cependant, en commun avec les autres comparaisons, les contrôles normaux (1,5 (0,1) × 10 7 copies d'ARNm/μg d'ARN) avaient des taux d'ARNm de -actine plus élevés que les sujets asthmatiques ne prenant pas de CSI (8,1 (1,4) × 10 6 copies d'ARNm/μg ARN, différence médiane 6,9 ​​× 10 6 , IC à 95 % 3,4 à 10 × 10 6 , p = 0,001) et des taux plus élevés que tous les asthmatiques (9,3 (1,5) × 10 6 copies d'ARNm/μg d'ARN, différence médiane 5,7 × 10 6 , IC à 95 % 1,4 à 10 × 10 6 , p = 0,013).

Effet de l'utilisation de gènes d'entretien comme dénominateurs

Pour démontrer l'effet de l'utilisation de la -actine et de la GAPDH comme dénominateurs de l'expression de l'ARNm pour les gènes d'intérêt, une PCR compétitive d'IL-2 a été réalisée sur l'ARN des cellules BAL en utilisant la même réaction d'ADNc que pour la -actine et la GAPDH. Les taux d'ARNm d'IL-2 dans les cellules BAL ne différaient pas entre les témoins normaux (4,6 (0,9) × 10 4 copies/μg d'ARN), les asthmatiques n'utilisant pas de CSI (4,8 (1,2) × 10 4 copies/μg d'ARN) et les asthmatiques prenant des ICS (3,0 (0,7) × 10 4 copies/μg d'ARN fig 4). Cependant, lorsque les taux d'ARNm d'IL-2 étaient exprimés sous forme de rapport avec la β-actine, il y avait des différences significatives, les asthmatiques n'utilisant pas de CSI ayant un rapport plus élevé (1,2 (0,4) × 10 –3 ) que les témoins normaux (6,2 (1,8) × 10 –4 , différence médiane 9,24 × 10 –4 , IC à 95 % 0,95 à 21,0 × 10 –4 , p=0,03) et asthmatiques utilisant le CSI (4,5 (0,9) × 10 –4 , différence médiane 1,1 × 10 –3 , 95 % IC 0,3 à 2,1 × 10 –3 , p=0,003). Ainsi, les différences apparentes dans les rapports IL-2/β-actine sont confondues par les différences dans les niveaux d'ARNm de -actine entre les groupes (figure 4).

Effet de l'utilisation de la -actine comme dénominateur des niveaux d'ARNm des cellules fluides IL-2 BAL. Pour comparer les niveaux d'ARNm d'IL-2 et de -actine et leurs rapports, les moyennes des moindres carrés des groupes de sujets sont présentées sous forme de pourcentages de la moyenne des moindres carrés du contrôle normal respectif. Les barres d'erreur sont données en pourcentage SE. *Des différences significatives ont été observées pour la β-actine (comme sur la figure 3D), et les ratios IL-2/β-actine chez les sujets asthmatiques n'utilisant pas de corticoïdes inhalés (CSI) sont significativement différents des témoins normaux (p=0,03) et des sujets asthmatiques utilisant ICS (p=0,003).


Deux bandes pour l'actine ? - (22 février 2008 )

J'aimerais savoir s'il est normal d'avoir deux groupes pour l'actine. J'ai essayé avec 2 anticorps. J'avais testé dans des cultures primaires d'échantillons d'astrocytes et de canaux déférents de rat et j'ai obtenu une seule bande avec un anticorps (qui n'est pas le mien) mais avec mon anticorps, j'ai obtenu deux bandes pour les astrocytes et une pour les canaux déférents de rat. Les deux bandes ont une forme et une intensité si similaires et un poids moléculaire si proche qu'elles semblent être 2 isoformes de la protéine, mais je n'ai jamais vu cela dans les articles. Il ne peut pas s'agir d'échantillons danifiés car j'avais testé les mêmes échantillons avec les deux anticorps et les résultats étaient ceux décrits. Et cela ne semble pas être une bande non spécifique, car lorsque je dilue le primaire, les deux bandes disparaissent. Y a-t-il quelqu'un qui peut m'aider?
Merci.

Les deux anticorps reconnaissent-ils la même isoforme d'actine ? J'utilise normalement la bêta-actine comme contrôle de chargement pour les transferts occidentaux.

Eh bien, dans les deux fiches, il est dit que les anticorps reconnaissent une large gamme d'isoformes, mais cela ne spécifie pas quelles isoformes. En fait, ce sont tous deux des anticorps polyclonaux mais les taches présentes dans les fiches techniques ne montrent qu'une seule bande pour les deux. J'étais convaincu que ce genre de technique ne permettait pas de distinguer les isoformes (je fais tourner un gel de polyacrylamide à 12%) et qu'il faudrait faire une PAGE 2D (IEF+SDS-Page).

Eh bien, dans les deux fiches, il est dit que les anticorps reconnaissent une large gamme d'isoformes, mais cela ne spécifie pas quelles isoformes. En fait, ce sont tous deux des anticorps polyclonaux, mais les taches présentes dans les fiches techniques ne montrent qu'une seule bande pour les deux. J'étais convaincu que ce genre de technique ne permettait pas de distinguer les isoformes (je fais tourner un gel de polyacrylamide à 12%) et qu'il faudrait faire une PAGE 2D (IEF+SDS-Page).

Les anticorps polyclonaux peuvent être connus pour se lier à des protéines non apparentées. S'il existe un anticorps monoclonal sur lequel vous pouvez mettre la main, cela devrait vous aider. J'ai un lapin anti-HIF-1a polyclonal qui se lie aux Igg & 39s ainsi qu'au marqueur d'échelle 50kda pré-teinté de Fisher&# 39s. Donc, peu importe ce que je fais, j'obtiens des bandes non spécifiques à des endroits où je sais qu'il ne devrait pas y avoir de traces de HIF-1a, et c'est plus que cet anticorps polyclonal de lapin a une grande affinité pour certains igg et BSA. Donc, si je bloque la membrane avec du BSA au lieu du lait, j'obtiens une tache noire car le primaire colle à tout.


Les Western blots sont-ils « semi-quantitatifs » ? - (29 novembre 2011 )

Que signifie le quantitatif « SEMI » ? qu'il ne quantifie pas complètement les protéines ?

Avec les logiciels d'analyse des intensités et des volumes de bandes, cela serait-il totalement quantitatif ?

Dans quelle mesure est-il courant d'utiliser des westerns pour quantifier l'expression des protéines ?

Cela signifie que vous avez besoin d'une courbe standard avec des quantités connues pour comparer vos inconnues à quelque chose. C'est pourquoi il est semi-quantitatif. Dans les méthodes quantitatives, vous mesurez ou quantifiez directement une quantité, par ex. temps de pesée ou de mesure. Aucun logiciel ne peut vous aider. C'est comme ça.
Il est assez courant d'utiliser l'occident pour quantifier l'expression des protéines tant que vous êtes conscient des lacunes.

BioMiha le mardi 29 novembre 18:37:25 2011 a dit :

Auriez-vous toujours besoin d'une « courbe standard » pour l'analyse des WB ? Ou pouvez-vous simplement utiliser un contrôle suffisamment approprié - ratio de protéines d'entretien et contrôle internalisé ? Le logiciel que j'utilise mesure le volume/l'intensité de la bande.

Hola, les réponses ci-dessus consistent à connaître la concentration en protéines par rapport à l'intensité de la bande, et vous feriez probablement mieux d'avoir une courbe standard, mais dans d'autres cas, le taux de phosphorilation des protéines, j'imagine que c'est votre domaine, par d'autres de vos questions dans le forum, ici nous comparons l'intensité de la bande de protéine phosphorylée à celle de la bande déphosphorée et en voyant ainsi le taux d'inhibition de n'importe quelle molécule, pour plus de précision, vous pouvez associer cela à la bande d'actine comme contrôle du chargement mais ce n'est pas nécessaire, pour moi , si la quantité de protéine chargée est similaire

Vous pouvez essayer, mais vous constaterez que les résultats sont très variables. Vous devez pouvoir charger la même quantité de protéines totales dans chaque voie, tout transférer uniformément, puis obtenir de belles expositions qui ne sont pas sur ou sous-exposées de manière cohérente pour chaque membrane que vous exécutez. J'ai trouvé qu'il était presque impossible d'obtenir exactement les mêmes résultats (ou même similaires) pour les mêmes lysats exécutés en même temps sur différents gels, transférés en même temps dans le même appareil de transfert et sondés dans les mêmes solutions avec toutes les conditions identiques.

bob1 le mar 6 décembre 03:11:06 2011 a dit :

Qu'en est-il de l'utilisation d'un gène domestique comme contrôle ? Par exemple. actine, tubuline, GAPDH.

On m'a également dit d'utiliser des voies de contrôle communes à toutes les membranes (par exemple, utiliser un contrôle positif) pour contrôler toute différence de manipulation entre les gels.

Mon autre question est la suivante : lors de l'utilisation de plusieurs chambres de transfert, quels sont les paramètres à rechercher (c'est-à-dire courant constant ou tension constante ?) ?

Essayez-le et voyez - mon expérience personnelle (10 ans) est que cela ne fonctionne pas entre les gels, peu importe à quel point vous êtes bon dans les westerns, même avec les femmes de ménage, à moins que vous ne puissiez écarter les variations de transferts, d'expositions, d'étapes d'anticorps, de lavages , etc.

bob1 le vendredi 9 décembre 02:42:38 2011 a dit :

Merci pour les conseils, bob1! 10 ans faisant des western blots fait de vous un pro!

Donc, vous n'utiliseriez pas les westerns pour quantifier les protéines, mais simplement les utiliser comme indicateur qualitatif si l'expression des protéines est régulée à la hausse ou à la baisse en fonction de l'intensité de la bande ? Alors, disons que si j'ai n = 10, je lancerais n = 1 en tant que « tache représentative » ? ou exécuter tous les n=10 ?

Oui, qualitatif est ce que j'appellerais ça. Cela fonctionne certainement pour les tendances générales, mais vous n'en tirerez pas de concentrations absolues, il y a tout simplement trop de variables avec lesquelles travailler. Je suppose que cela pourrait fonctionner si vous pouviez ajouter des quantités connues d'une certaine protéine sur le gel et comparer, comme vous le feriez pour la qPCR.

bob1 le ven 9 décembre 23:29:15 2011 a dit :

Quelque chose comme une courbe standard avec disons BSA.

La seule méthode pour quantifier l'expression des protéines à laquelle je peux penser est ELISA. Ce sera certainement entièrement quantitatif. Les biologistes cellulaires hésitent à utiliser la cytométrie en flux car l'état des cellules est quelque peu différent lors de l'analyse (en suspension). L'immunocoloration est également qualitative (à moins que vous n'ayez un bon logiciel pour compter les cellules colorées par rapport aux cellules non colorées). Cependant, si les deux cellules sont colorées, ne pensez pas que vous pouvez distinguer l'intensité de la coloration (sur/sous-expression) entre elles.


Concentration d'antigène

La résolution de SDS-PAGE est limitée à 50-100 bandes. Si la concentration relative de l'antigène d'intérêt est trop faible (moins de 0,2 % de la protéine totale), il peut être difficile à détecter (par exemple, la synaptobrevine/VAMP comigre avec les histones dans les homogénats cellulaires qui interfèrent avec sa détection). L'amélioration du signal peut alors conduire à l'apparition de bandes artificielles. L'enrichissement de l'antigène par fractionnement ou par immunoprécipitation doit être envisagé.

D'un autre côté, une trop grande abondance d'antigène ou trop d'anticorps primaire peut produire un signal trop robuste.


Coloration de l'actine et de la tubuline – de la WB à l'imagerie des cellules vivantes

Fig. 1 : Images d'immunofluorescence de cellules Swiss 3T3 de souris colorées avec un anticorps anti-actine (027AAN01).

L'actine et la tubuline, en tant que structures majeures du cytosquelette, sont des composants cruciaux d'une pléthore de processus en biologie cellulaire. Les deux sont très impliqués dans la stabilisation de la forme cellulaire, et en particulier dans les mouvements cellulaires (par exemple, la migration cellulaire) et les mouvements intracellulaires et les mécanismes de transport.

Ainsi, visualiser l'actine et la tubuline dans des cellules fixes ou vivantes et les détecter dans des échantillons biologiques (par exemple dans des Western Blots) fait partie des dispositifs expérimentaux de base en biologie cellulaire.

Une large gamme d'outils est disponible pour tous les types de niveaux expérimentaux. Dans cet article, nous examinerons certains d'entre eux que vous pouvez utiliser, de Western Blot à Live Cell Imaging.

Détection de l'actine et de la tubuline avec des anticorps

Fig. 2 : Western blot d'actine purifiée et d'extraits cellulaires sondés avec un anticorps anti-actine (027AAN01).

Les anticorps peuvent être utilisés dans diverses méthodes, telles que les Western Blots, ELISA et l'immunocytochimie. De bons résultats dans différentes méthodes ne peuvent être obtenus qu'avec quelques anticorps.

Anti pan Actin a été minutieusement testé dans ces applications et a donné des résultats brillants (voir Fig 1 et 2).

Fig. 3 : Image d'immunofluorescence d'une cellule en métaphase d'Arabidopsis thaliana colorée avec un anticorps polyclonal anti-tubuline (027ATN02).

Fig. 4 : Western blot d'extraits cellulaires sondés avec un anticorps polyclonal anti-tubuline (027ATN02)

De plus, vous pouvez parcourir ici une sélection d'autres anticorps anti-actine.

L'anti-alpha/bêta tubuline a été testée positivement dans les mêmes applications et peut en outre être utilisée pour des expériences d'immunoprécipitation. Les résultats sont présentés dans les figures 3 et 4.

Voici un aperçu complet d'une gamme d'anticorps anti-tubuline.

Coloration à l'actine des cellules fixées

Fig. 5 : Fibroblastes Swiss 3T3 colorés avec ActiStain 488 (vert), Dapi (bleu) et Anti Vinuclin (orange).

Dans les cellules fixées, l'actine peut être colorée avec des anticorps (voir ci-dessus), mais des phalloïdines fluorescentes sont souvent utilisées. La phalloidine appartient au groupe des phallotoxines produites par le champignon Amanite phalloïde (champignon de la mort). La toxicité naturelle de la Phalloïdine est due à son effet stabilisant sur la F actine dans les cellules. Basé sur son affinité pour la F actine et couplé à un colorant fluorescent, il peut être utilisé pour visualiser la F actine.

Cytoskeleton Inc. propose un ensemble de colorants à base de phalloïdine (Acti-Stains) couplés à un certain nombre de fluorophores différents compatibles avec les ensembles de filtres populaires tels que FITC, TRITC et Cy5. Les colorants sont exceptionnellement brillants et stables et sont en effet proposés à des prix très économiques par rapport à d'autres colorants à base de phalloïdine couplés à des fluorophores de stabilité similaire. Les résultats de la coloration des cellules Swiss 3T3 avec ActiStain 488 sont présentés sur la figure 5.

Imagerie des cellules vivantes de l'actine et de la tubuline

Fig. 6 : Image de microscopie 3D-SIM de microtubules dans le corps neuronal primaire du cortex de rat marqué avec de la SiR-tubuline.

Enfin, je voudrais présenter de nouveaux outils pour colorer l'actine et la tubuline dans les cellules vivantes sans avoir besoin de les transfecter avec des vecteurs portant les informations pour l'actine/tubuline ou les protéines de liaison marquées par fluorescence. Le spirochrome a récemment publié des colorants fluorescents uniques pour surveiller facilement les deux principaux composants du cytosquelette dans les cellules vivantes. Ces colorants fluorescents (SiR-Actine et SiR-Tubuline) sont des composés perméables aux cellules qui colorent la F-actine (et les microtubules, voir respectivement Fig. 6 et Fig.7).

Fig. 7 : Image de microscopie 3D-SIM de fibres de stress d'actine dans des fibroblastes dermiques primaires humains marqués avec SiR-actine.

Pour en savoir plus sur ces colorations passionnantes, jetez un œil à mon récent article 2 nouvelles colorations d'imagerie de cellules vivantes d'actine et de tubuline - sans transfection !

Intéressé par la coloration de l'actine et/ou de la tubuline ? Contactez-nous en laissant vos questions ou commentaires ci-dessous!


Contributions des auteurs

LWT a conçu et réalisé des expériences, analysé les données et co-écrit le manuscrit. JS et CE ont conçu et réalisé des expériences, analysé les données. ASHC et CF ont réalisé des expériences de métabolomique. Le TSB et le GS ont assisté à l'analyse d'imagerie NAD/NADH. MA a fourni le concept de l'étude, conçu des expériences, analysé les données, co-écrit le manuscrit et obtenu le financement. Tous les auteurs ont revu et édité le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.



Commentaires:

  1. Groramar

    S'il te plaît! =)

  2. Hakeem

    une très bonne phrase

  3. Beaton

    Bien sûr. Ça arrive. Nous pouvons communiquer sur ce thème.

  4. Sharamar

    Et comme lui pour comprendre

  5. Magee

    Je garderai le silence peut-être juste

  6. Tanos

    Et vous avez compris?



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