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14.3 : Récepteurs 7-TM (couplés aux protéines G) - Biologie

14.3 : Récepteurs 7-TM (couplés aux protéines G) - Biologie


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Les récepteurs 7-transmembranaires, ou récepteurs couplés aux protéines G, sont, sans surprise, une famille de protéines qui traversent 7 fois la membrane cellulaire. Le terminal amino est extracellulaire et le terminal carboxyle est intracellulaire. La figure (PageIndex{2}) montre les régions transmembranaires étalées pour plus de clarté, mais les domaines transmembranaires se forment en fait ensemble dans une forme plus cylindrique.

Les protéines 7-TM sont utilisées comme récepteurs de neurotransmetteurs tels que l'épinéphrine (récepteur β-adrénergique), l'acétylcholine (récepteur muscarinique) et la sérotonine, ainsi que des hormones comme le glucagon ou la thyréostimuline, et même des ligands non moléculaires tels que la lumière. ! Les rhodopsines sont une classe de récepteurs 7-TM qui sont activés lorsqu'ils absorbent un photon (Figure (PageIndex{5})). L'activation de cette famille de récepteurs, que ce soit par photon ou par liaison de ligand plus classique, induit un changement de conformation du domaine cytoplasmique qui altère l'interaction entre le récepteur et un complexe protéique appelé protéine G hétérotrimérique.

La protéine G hétérotrimérique se compose d'une sous-unité a, b et g, dont la sous-unité a peut se lier soit au GTP soit au GDP, et peut hydrolyser le GTP en GDP. Lorsque le récepteur 7-TM est inactif, le complexe protéique G est généralement proche associé à la membrane par myristoylation ou palmitoylation de la sous-unité a et farnésylation ou géranylgéranylation de la sous-unité g. Une fois le récepteur 7-TM activé, il s'associe à la protéine G hétérotrimérique, ce qui amène le Ga à lâcher le GDP et à se lier à un GTP. Cela dissocie alors le Ga des deux autres sous-unités. Il peut ensuite s'associer à une enzyme et l'activer pour étendre la cascade de signalisation. L'une des deux voies classiques commence par l'activation par Ga de l'adénylate (adénylyl) cyclase. L'adénylate cyclase (AC) convertit l'ATP en AMPc. Étant donné que l'ATP est abondant et que l'AC est une enzyme relativement rapide, la première amplification du signal s'accompagne de la génération de la molécule «second messager» cAMP. Chaque molécule d'AMPc peut ensuite activer d'autres enzymes, la principale étant la protéine kinase A. La PKA peut ensuite phosphoryler une variété de substrats pour modifier l'activité cellulaire par l'expression de gènes, des moteurs moléculaires ou des changements métaboliques.

L'autre voie classique pour les récepteurs 7-TM est l'activation de la phosphlipase Cb, également par Ga. La PLCb produit en fait deux molécules messagères secondaires : elle hydrolyse le phosphatidylinositol en diacylglycérol (DAG) et en inositol triphosphate (IP3). IP3 induit principalement la libération de Ca2+ du réticulum endoplasmique. Le DAG peut activer la protéine kinase C. La PKC est également activée par Ca2+ et les deux Ca2+ et DAG peut activer PKC de manière synergique. La protéine kinase C est une kinase centrale importante qui s'est avérée phosphoryler et contrôler l'activité de nombreuses autres enzymes, des éléments cytosquelettiques aux facteurs de transcription.

Une variation intéressante des voies 7-TM classiques commence avec les récepteurs de la rhodopsine dans les cellules en bâtonnets. Ces récepteurs se lient aux photons pour l'activation et engagent une protéine G hétérotrimérique. Le Ga-GTP se lie alors à la sous-unité g de la phosphodiestérase (PDE), l'activant et catalysant la conversion du cGMP en GMP. À mesure que le cGMP diminue, les canaux ioniques se ferment, polarisant la membrane et modifiant le signal de la cellule en bâtonnets vers le cerveau (via les neurones connectés).

Les seconds messagers doivent avoir deux propriétés. Ils doivent être suffisamment petits pour diffuser efficacement, et la cellule doit pouvoir les générer rapidement. Californie2+ et l'AMPc entrent dans cette catégorie. En outre, ils peuvent tous deux être retirés de la circulation assez rapidement : l'ancien par Ca2+ pompes dans le RE et l'appareil de Golgi, et ce dernier par l'activité de la phosphodiestérase. Lorsque la voie des protéines G a été découverte, l'utilisation de seconds messagers lipidiques était surprenante. Les phospholipides membranaires étaient largement ignorés à l'époque en tant que simples composants statiques des membranes. Il est maintenant clair que certains des phospholipides sont biochimiquement actifs, avec plusieurs enzymes qui les modifient, notamment les phospholipases, les phospholipides kinases et les phospholipides phosphatases. Certaines de ces enzymes ont diverses fonctions car leur substrat de produit peut être une importante molécule messagère. Par exemple, PI3K (phosphatidylinositol-3-kinase) est une kinase de signalisation centrale car son produit, PIP3 (phosphatidylinositol (3,4,5)-triphosphate) est un activateur d'Akt/PKB et d'autres enzymes qui peuvent activer plusieurs voies de signalisation.

L'activation doit finalement se terminer, et elle le fait lorsque Ga hydrolyse le GTP qui lui est lié. De cette façon, le Ga agit comme une sorte de minuterie pour la cascade de signalisation. Ceci est important car pour que la signalisation soit efficace, elle doit être étroitement contrôlée. Très tôt dans ce cours, il a été souligné que Ca2+ est maintenu à une concentration très faible dans le cytoplasme de la cellule car nous voulons que Ca2+-des mécanismes sensibles pour pouvoir réagir rapidement à un afflux de calcium, mais nous voulons également pouvoir éteindre rapidement le signal en fonction des besoins, et c'est évidemment beaucoup plus facile à faire en séquestrant une petite quantité de Ca2+ que beaucoup. De même, si une activité soutenue d'une cellule receveuse est requise, elle est accomplie par une activation continue du récepteur et non par un effet durable d'une seule activation. Cela garantit que si un effet cellulaire doit être brusquement et rapidement interrompu, il peut être accompli sans période de latence significative entre l'arrêt de la sécrétion hormonale et l'arrêt de la signalisation intracellulaire.

Le récepteur fait également partie d'un autre mécanisme d'arrêt : pour éviter une surstimulation, les récepteurs sont désensibilisés pendant une courte période après leur activation. La kinase du récepteur couplé à la protéine G (GRK) phosphoryle le récepteur 7-TM. La phosphorylation crée des sites de reconnaissance pour les arrestations. Les arrêtines ont une variété de fonctions, dont la plus simple est d'agir comme un inhibiteur compétitif de la liaison aux protéines G par le récepteur. Il s'agit d'une désensibilisation de durée relativement courte.

Pour une désensibilisation plus longue, l'arrestine se lie à AP2 et à la clathrine, nucléant la formation d'une vésicule endocytaire recouverte de clathrine. Cela élimine le récepteur de la surface cellulaire, désensibilisant la cellule pendant une période beaucoup plus longue que la simple compétition entre l'arrestine et la protéine G.

Les arrêtines ont une autre fonction potentielle. Ils peuvent agir comme des protéines d'échafaudage qui apportent un complexe de signalisation complètement différent au récepteur 7-TM. La figure (PageIndex{8}) montre un exemple dans lequel le récepteur 7-TM est utilisé pour activer un facteur de transcription Jun.

La b-arrestine amène AJK-1, MKKY et JNK-1 à activer JNK-1, qui peut ensuite phosphoryler Jun. Cela permet la translocation de phospho-Jun dans le noyau et la dimérisation ultérieure, la convertissant en un facteur de transcription actif.

Quelles sont certaines des actions cellulaires qui peuvent être provoquées par l'activation du récepteur 7-TM ? Californie2+ la dynamique sera abordée dans une section distincte. IP3 Il a été démontré qu'il provoque la contraction des muscles lisses et squelettiques, la polymérisation de l'actine et les changements de forme cellulaire, la libération de calcium des réserves intracellulaires, l'ouverture des canaux potassiques et la dépolarisation membranaire. L'AMPc a été impliqué dans le contrôle de la dégradation du glycogène et de la néoglucogenèse, le métabolisme des triacyglycérols, la sécrétion d'œstrogènes par les cellules ovariennes, la sécrétion de glucocorticoïdes et l'augmentation de la perméabilité des cellules rénales à l'eau.


Informations structurelles sur les différences entre les dérivés du lactisole dans les mécanismes inhibiteurs contre le récepteur humain du goût sucré

Le lactisole, un inhibiteur du récepteur humain du goût sucré, possède un squelette d'acide 2-phénoxypropionique et il a été démontré qu'il interagit avec le domaine transmembranaire de la sous-unité T1R3 (T1R3-TMD) du récepteur. Un autre inhibiteur, le 2,4-DP, qui partage le même squelette moléculaire que le lactisole, s'est avéré être environ 10 fois plus puissant dans son activité inhibitrice que le lactisole, mais la base structurelle de leurs mécanismes inhibiteurs contre le récepteur reste à élucider. Les structures cristallines du TMD des récepteurs métabotropiques du glutamate, qui, avec les T1R, sont classés comme récepteurs couplés aux protéines G de classe C, ont récemment été rapportées et ont permis de créer un modèle structurel précis pour le T1R3-TMD. Dans cette étude, le mécanisme structurel détaillé sous-jacent à l'inhibition du goût sucré a été caractérisé en comparant l'action du lactisole sur le T1R3-TMD avec celle du 2,4-DP. Nous avons d'abord réalisé une série d'expériences utilisant des cellules cultivées exprimant le récepteur du goût sucré avec des mutations et examiné les interactions avec ces inhibiteurs. Sur la base des résultats, nous avons ensuite effectué des simulations d'amarrage, puis appliqué une minimisation d'énergie basée sur la dynamique moléculaire. Nos analyses ont clairement révélé que les isomères (S) du lactisole et du 2,4-DP interagissaient avec les mêmes sept résidus dans T1R3-TMD et que les pouvoirs inhibiteurs de ces inhibiteurs étaient principalement dus à des interactions stabilisatrices médiées par leurs groupes carboxyle. dans la dimension verticale de la poche de ligand de T1R3-TMD. De plus, le 2,4-DP s'est engagé dans une interaction hydrophobe médiée par son groupe o-Cl, et cette interaction peut être principalement responsable du pouvoir inhibiteur plus élevé du 2,4-DP.

Déclaration de conflit d'intérêts

Les auteurs ont déclaré qu'ils n'existaient pas de conflit d'intérêts.

Les figures

Fig 1. Lactisole et 2,4-DP comme sucré…

Fig 1. Lactisole et 2,4-DP comme inhibiteurs du goût sucré.

(A) Formules développées du (±)-lactisole et…

Fig 2. Simulations MD et leurs pré-simulations…

Fig 2. Simulations MD et leurs pré-simulations pour le lactisole et le 2,4-DP.

Fig 3. Comparaison des résultats de…

Fig 3. Comparaison des résultats des minimisations MD pour ( S )-lactisole et (…

Fig 4. Activité inhibitrice du goût sucré de…

Fig 4. Activité inhibitrice du goût sucré de ( S )-, ( R )-lactisole et (…


Résumé

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont au cœur de nombreuses voies de signalisation cellulaire fondamentales. Ils transmettent des signaux de l'extérieur vers l'intérieur des cellules dans des processus physiologiques allant de la vision à la réponse immunitaire. Il est extrêmement difficile de les examiner individuellement en utilisant des techniques expérimentales conventionnelles. Récemment, un modèle moléculaire pseudo-atomistique est apparu comme un outil précieux pour accéder à des informations sur les RCPG, plus précisément sur leurs interactions avec leur environnement dans leur membrane cellulaire native et les conséquences sur leur organisation supramoléculaire. Cette approche utilise le modèle Martini à gros grains (CG) pour décrire les récepteurs, les lipides et le solvant dans les simulations de dynamique moléculaire (MD) et avec suffisamment de détails pour permettre de conserver la spécificité chimique des différentes molécules. L'élimination des degrés de liberté inutiles a ouvert la voie à des simulations à grande échelle de l'organisation supramoléculaire à médiation lipidique des RCPG. Ici, après avoir présenté la méthode Martini CGMD, nous passons en revue ces études menées sur divers membres de la famille GPCR, y compris la rhodopsine (récepteur visuel), les récepteurs opioïdes, les récepteurs adrénergiques, les récepteurs de l'adénosine, le récepteur de la dopamine et le récepteur de la sphingosine 1-phosphate. Ces études ont mis en lumière un ensemble intéressant de nouveaux principes biophysiques. Les informations vont de la révélation de déformations localisées et hétérogènes de la bicouche membranaire à la surface de la protéine, des interactions spécifiques de molécules lipidiques avec des GPCR individuels, à l'effet de la matrice membranaire sur l'auto-assemblage global des GPCR. L'examen se termine par un aperçu des leçons tirées de l'utilisation de la méthode CGMD, les résultats biophysiques-chimiques sur l'interaction lipides-protéines.


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La famille cible de récepteurs couplés aux protéines G 7 TM †

Cette critique apparaîtra plus tard dans un chapitre du livre Biologie chimique : des petites molécules à la biologie des systèmes et à la conception de médicaments (Eds. : S. Schreiber, T. Kapoor, G. Wess), Wiley-VCH, Weinheim, dont la publication est prévue en novembre 2006.

Résumé

Les approches de biologie chimique ont une longue histoire dans l'exploration de la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), qui représente le groupe de cibles thérapeutiques le plus vaste et le plus important. L'analyse du génome humain a révélé un nombre important de nouveaux membres avec une fonction physiologique inconnue qui sont aujourd'hui au centre de nombreux programmes de découverte de médicaments en pharmacologie inverse. Étant donné que les sept segments transmembranaires hydrophobes sont une caractéristique structurelle commune de ces récepteurs et que la signalisation via les protéines G hétérotrimériques n'est pas démontrée dans tous les cas, ces protéines sont également appelées sept récepteurs transmembranaires (7 TM) ou serpentines. Cette revue résume les jalons historiques importants de la recherche GPCR, depuis le début, lorsque la pharmacologie était principalement descriptive, jusqu'à l'ère de la biologie moléculaire moderne, avec le clonage du premier récepteur et maintenant la disponibilité de l'ensemble du répertoire GPCR humain au niveau de la séquence et de la protéine. niveau. Il montre comment la découverte de médicaments dirigée par GPCR était initialement basée sur des tests minutieux de quelques composés chimiques spécifiquement fabriqués et est aujourd'hui poursuivie avec des approches modernes de découverte de médicaments, y compris la conception de bibliothèques combinatoires, la biologie structurelle, l'informatique moléculaire et les technologies de criblage avancées pour le identification de nouveaux composés qui activent ou inhibent spécifiquement les GPCR. De tels composés, en conjonction avec d'autres nouvelles technologies, nous permettent d'étudier le rôle des récepteurs en physiologie et en médecine, et, espérons-le, aboutiront à de nouvelles thérapies. Nous décrivons également comment la recherche fondamentale sur les mécanismes de signalisation et de régulation des RCPG progresse, menant à la découverte de nouvelles protéines interagissant avec les RCPG et ouvrant ainsi de nouvelles perspectives pour le développement de médicaments. Des exemples pratiques d'études d'expression GPCR, HTS (criblage à haut débit) et la conception de bibliothèques combinatoires axées sur le GPCR liées à la monoamine illustrent la recherche en cours sur la biologie chimique du GPCR. Enfin, nous décrivons les progrès futurs qui peuvent lier les découvertes d'aujourd'hui au développement de nouveaux médicaments.


Récepteurs couplés à la protéine G d'insecte et transduction du signal

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont des protéines à sept transmembranes (7-TM) qui transforment les signaux extracellulaires en réponses physiologiques cellulaires grâce à l'activation de protéines de liaison aux nucléotides de guanine hétérotrimériques (sous-unités αβγ). Leurs propriétés générales sont remarquablement bien conservées au cours de l'évolution. Malgré cette ressemblance générale, une grande variété de signaux différents sont véhiculés via cette catégorie de récepteurs. Plusieurs GPCR-(sous)familles ont une origine ancienne qui se situe avant la divergence des animaux protostomiens et deutérostomiens. Nevertheless, an enormous diversification has occurred since then. The availability of novel sequence information is growing very rapidly as a result of molecular cloning experiments and of metazoan genome (Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Homo sapiens) and EST (expressed sequence tags) sequencing projects. The Drosophila Genome Sequencing Project will certainly have an important impact on insect signal transduction and receptor research. In parallel, convenient expression systems and functional assay procedures will be needed to investigate insect receptor properties and to monitor the effects of natural and artificial ligands. The study of the evolutionary aspects of G protein–coupled receptors and of their signaling pathways will probably reveal insect-specific features. More insight into these features may result in novel methods and practical applications. Cambre. Insecte Biochem. Physiol. 48:1–12, 2001. © 2001 Wiley-Liss, Inc.


Résumé

Prostaglandins play a critical physiological role in both cardiovascular and immune systems, acting through their interactions with 9 prostanoid G protein-coupled receptors (GPCRs). These receptors are important therapeutic targets for a variety of diseases including arthritis, allergies, type 2 diabetes, and cancer. The DP prostaglandin receptor is of interest because it has unique structural and physiological properties. Most notably, DP does not have the 3–6 ionic lock common to Class A GPCRs. However, the lack of X-ray structures for any of the 9 prostaglandin GPCRs hampers the application of structure-based drug design methods to develop more selective and active medications to specific receptors. We predict here 3D structures for the DP prostaglandin GPCR, based on the GEnSeMBLE complete sampling with hierarchical scoring (CS-HS) methodology. This involves evaluating the energy of 13 trillion packings to finally select the best 20 that are stable enough to be relevant for binding to antagonists, agonists, and modulators. To validate the predicted structures, we predict the binding site for the Merck cyclopentanoindole (CPI) selective antagonist docked to DP. We find that the CPI binds vertically in the 1–2–7 binding pocket, interacting favorably with residues R310 7.40 and K76 2.54 with additional interactions with S313 7.43 , S316 7.46 , S19 1.35 , etc. This binding site differs significantly from that of antagonists to known Class A GPCRs where the ligand binds in the 3–4–5–6 region. We find that the predicted binding site leads to reasonable agreement with experimental Structure–Activity Relationship (SAR). We suggest additional mutation experiments including K76 2.54 , E129 3.49 , L123 3.43 , M270 6.40 , F274 6.44 to further validate the structure, function, and activation mechanism of receptors in the prostaglandin family. Our structures and binding sites are largely consistent and improve upon the predictions by Li et al. ( Confiture. Chem. Soc. 2007 , 129 (35), 10720) that used our earlier MembStruk prediction methodology.


Death Receptor Signaling Pathway

Death receptors are cell surface receptors that transmit apoptotic signals initiated by specific ligands and play a central role in instructive apoptosis. Death receptors belong to the tumor necrosis factor receptor (TNFR) gene superfamily. Eight members of the death receptor family have been characterized so far: TNFR1 (also known as DR1, CD120a, p55 and p60), CD95 (also known as DR2, APO-1 and Fas), DR3 (also known as APO-3, LARD, TRAMP and WSL1), TRAILR1 (also known as DR4 and APO-2), TRAILR2 (also known as DR5, KILLER and TRICK2), DR6, ectodysplasin A receptor (EDAR) and nerve growth factor receptor (NGFR). These death receptors are distinguished by a cytoplasmic region of

80 residues termed the death domain (DD). When these receptors are triggered by corresponding ligands, a number of molecules are recruited to the death domain and subsequently a signaling cascade is activated. Two types of death receptor signaling complex can be distinguished. The first group comprises the death-inducing signaling complexes (DISCs) that result in the activation of caspase-8, which plays the central role in transduction of the apoptotic signal. DISC is formed at the CD95 receptor, TRAILR1 or TRAILR2. The second group comprises the TNFR1, DR3, DR6 and EDAR. These recruit a different set of molecules, which transduce both apoptotic and survival signals.


The Molecular Basis of G Protein𠄼oupled Receptor Activation

G protein–coupled receptors (GPCRs) mediate the majority of cellular responses to external stimuli. Upon activation by a ligand, the receptor binds to a partner heterotrimeric G protein and promotes exchange of GTP for GDP, leading to dissociation of the G protein into α and βγ subunits that mediate downstream signals. GPCRs can also activate distinct signaling pathways through arrestins. Active states of GPCRs form by small rearrangements of the ligand-binding, or orthosteric, site that are amplified into larger conformational changes. Molecular understanding of the allosteric coupling between ligand binding and G protein or arrestin interaction is emerging from structures of several GPCRs crystallized in inactive and active states, spectroscopic data, and computer simulations. The coupling is loose, rather than concerted, and agonist binding does not fully stabilize the receptor in an active conformation. Distinct intermediates whose populations are shifted by ligands of different efficacies underlie the complex pharmacology of GPCRs.


RÉSULTATS

??1AR Disrupts Kv11.1/14-3-3ε Association

Figure 1A shows that Kv11.1 coimmunoprecipitated with cotransfected 14-3-3ε, a result that is consistent with the report of Kagan et al. (2002). Interestingly, coexpression of β1ARwt disrupts the interaction, both in basal and Iso stimulated conditions. A detailed electrophysiological analysis of Kv11.1 currents upon Iso β1AR stimulation was performed in CHO cells stably expressing Kv11.1 channels cotransfected or not with the cDNA encoding β1ARwt. Figure 1, B and E, shows families of current traces for control conditions and after 10-min exposure to 1 nM Iso, obtained by applying 5-s pulses, imposed in 20-mV increments between −80 and +60 mV. The holding potential was fixed at −80 mV, and tail currents were recorded upon repolarization to −60 mV. In nontransfected cells (which express low levels of endogenous βAR, unpublished data), Iso accelerated the time course of activation but did not modify the maximum outward current and the time course of deactivation (n = 6 Figure 1B, Table 1). In cells expressing β1ARwt, Iso decreased both the outward and the tail current and accelerated the time course of the initial phase of deactivation, without modifying the time course of activation (n = 6 Figure 1E, Table 1). Panels C, F and D, G show the current-voltage plots of steady-state current at the end of the depolarizing step and the activation curves obtained in the presence and the absence of Iso in nontransfected (C and D) and in β1ARwt-transfected (F and G) cells. In nontransfected cells, Iso did not significantly modify either the steady state current or the slope of the activation curve (Figure 1, C and D), whereas it slightly shifted the midpoint of the activation curve to more negative potentials (Table 1). Such minor Iso-induced changes in channel activity in the absence of transfected β1AR appear to be not receptor-mediated, because it was also observed in the presence of 1 μM propranolol (unpublished data). In cells expressing β1ARwt Iso significantly decreased the current amplitude at −20 and −10 mV (Figure 1F) and the tail current amplitude after pulses between −20 and +60 mV (Figure 1G), without modifying the voltage dependence of activation (n = 6, p > 0.05 Table 1).

Figure 1. β1AR disrupts Kv11.1/14-3-3ε association and Iso inhibits Kv11.1 currents. (A) HEK-293 cells were cotransfected with Kv11.1 and HA-14-3-3ε in the absence or presence of β1ARwt. After stimulation or not with Iso (10 μM) for 5 min, the presence of Kv11.1 in HA-14-3-3 immunoprecipitates was assessed by using specific channel antibodies. The expression levels of the different proteins in cell lysates were analyzed by immunoblot analysis as detailed in Matériaux et méthodes. Results are representative of three independent experiments. (B and E) Kv11.1 current traces obtained by applying 5-s pulses that were imposed in 20-mV increments between −80 mV and +60 mV. Deactivating Kv11.1 tail currents were recorded at −60 mV. Currents were obtained in the absence and the presence of 1 nM Iso in cells transfected (E) or not (B) with β1ARwt. (C and F) Mean Kv11.1 current-voltage relationship 5-s isochronal in the absence and presence of 1 nM Iso in the indicated experimental conditions. (D and G) Mean Kv11.1 activation curves in the absence and presence of 1 nM Iso in the indicated conditions. Each point represents the mean of ≥6 experiments and *p < 0.05 versus control.

Table 1. Effects of 1 nM Iso on the time course of activation, fast phase of deactivation, and voltage dependence of activation of Kv11.1 currents recorded in CHO cells

τ, time constant of current activation at 0 mV τF, time constant of the fast phase of tail current deactivation, recorded after pulses to +60 mV Vh, midpoint of the activation curve k, slope of the activation curve.

a p < 0.05 vs. data obtained in control conditions.

??1AR Directly Interacts with 14-3-3ε

A possible explanation for the inhibition of Kv11.1/14-3-3ε interaction in the presence of β1AR may be a direct competition between Kv11.1 and β1AR for 14-3-3ε proteins. In this regard, in the third cytoplasmic loop and the C-terminal region of the β1AR there are PKA phosphorylation sites (Rapacciuolo et al., 2003 RRPSRLV and RPRASGCL, respectively) that exhibit certain homology with the consensus binding site of 14-3-3 proteins (Muslin et al., 1996 Yaffe et al., 1997). Therefore, we explored whether 14-3-3ε proteins bind to β1AR. To this end, HEK-293 cells were transiently transfected with tagged β1AR and 14-3-3ε constructs. Figure 2A shows that upon immunoprecipitation of β1AR, HA-tagged 14-3-3ε could be detected in the receptor complexes and that the presence of Iso promoted a marked increase in β1AR/14-3-3ε coimmunoprecipitation at 5 min of stimulation. These results suggest that activation of β1AR promotes conformational changes and/or triggers signaling pathways that facilitate the recruitment of 14-3-3 proteins to the receptor complex. The basal association of β1AR and 14-3-3ε in cotransfected cells is decreased upon incubation with the β-antagonist betaxolol (unpublished data), consistent with the idea that the reported basal β1AR activity associated with receptor overexpression (Engelhardt et al., 2001) also triggers to certain extent the mechanisms underlying the association. To more clearly visualize the modulation of β1AR/14-3-3 binding by different agents, cells were pretreated with betaxolol to lower such basal recruitment.

Figure 2. β1AR stimulation increases β1AR/14-3-3ε association in HEK-293 cells and guinea pig heart. (A) HEK-293 cells transiently transfected with Flag β1AR and HA-14-3-3ε and pretreated with betaxolol for 1 h were challenged with Iso, and the association between β1AR and 14-3-3 proteins was investigated by immunoprecipitation and Western blot analysis as detailed in Matériaux et méthodes. Data indicate the amount of coprecipitated 14-3-3ε proteins, normalized by receptor immunoprecipitation and referred to association in basal (i.e., nonstimulated) conditions, and are mean ± SEM of four independent experiments. Representative gels are shown left. (B) Endogenous β1AR/14-3-3ε complexes are present in guinea pig heart extracts. After incubation of dissociated heart tissue with Iso 10 μM for the indicated periods of time, β1AR were partially purified from solubilized heart membrane extracts by affinity chromatography using alprenolol-Sepharose columns. After elution, fractions were assayed for the presence of receptor and 14-3-3ε proteins by Western blot using specific antibodies as detailed in Matériaux et méthodes. In the case of the β1AR, two bands are apparent in some fractions likely due to different glycosylation patterns. Gels are representative of two independent experiments.

To validate this association in a more physiological setting, we searched for the occurrence of these molecular complexes in endogenous conditions. After exposure of guinea pig heart samples to Iso for different periods of time, β1AR were partially purified by affinity chromatography using the antagonist alprenolol. On elution of bound receptors and their associated proteins, fractions were analyzed for the presence of β1AR and 14-3-3ε proteins by using specific antibodies. Figure 2B indicates that 14-3-3ε proteins coeluted with purified endogenous receptors and that such coelution is increased upon agonist stimulation. This result confirms that β1AR and 14-3-3ε proteins associate ”in situ“ in the heart in an agonist-dependent way.

Consistent with the idea that stimulation of the cAMP/PKA pathway is involved in triggering β1AR/14-3-3ε binding, their coimmunoprecipitation is rapidly promoted by incubating cells with forskolin, a well-known AC activator (Figure 3A). Conversely, both basal and agonist-induced association is blocked in the presence of the PKA inhibitor H-89 (Figure 3B), but not by protein kinase C or mitogen-activated protein kinase/ERK kinase (MEK) inhibitors (Ro-31-8220 and PD98059, respectively). Overall, these data clearly establish that PKA activity is directly or indirectly required for triggering the presence of β1AR and 14-3-3ε proteins in the same molecular complex.

Figure 3. The association between β1AR and 14-3-3 proteins is direct and dependent on PKA activity. HEK-293 cells transiently transfected with Flag β1AR and HA-14-3-3ε were stimulated with forskolin (A) or Iso in the absence or presence of the indicated protein kinase inhibitors (B). The receptors were then immunoprecipitated and the presence of 14-3-3ε proteins analyzed and quantitated as in Figure 1. Gels representative of three independent experiments are shown. The fold-stimulation of β1AR/14-3-3ε association in each experimental setting with respect to wild-type receptor in basal conditions, normalized by the amount of β1AR present in the immunoprecipitates, is shown in Supplementary Figure 3, A and B. (C) Phosphorylation of β1AR cytoplasmic domain by PKA. The indicated GST fusion protein, encompassing the third intracellular loop of the β1AR, or GST as a control was incubated with PKA as detailed in Material and Methods, resolved by electrophoresis and analyzed by Coomassie blue staining or autoradiography ( 32 P). (D) The β1AR GST fusion protein (or GST as a control) was incubated in the absence or presence of PKA as in C. After washing, the GST proteins were incubated for 3 h in the presence of purified GST 14-3-3ε, and association to the latter protein was analyzed by immunoprecipitation with specific 14-3-3ε antibodies or a nonrelated IgG as a control. The immunoprecipitates were resolved by electrophoresis and blotted with 14-3-3ε or anti-GST antibodies to detect β1AR fusion protein, migration of which (including a GST-3il-β1AR proteolytic fragment) is shown with asterisks. Results are representative of two independent experiments.

To test if PKA phosphorylated β1AR would directly recruit 14-3-3 proteins, we next performed in vitro assays with purified 14-3-3ε and a β1AR cytoplasmic domain fusion protein. As shown in Figure 3C, a GST-fusion protein encompassing the third intracellular loop of the β1AR (GST-3il-β1AR) was readily phosphorylated in the presence of purified PKA. The GST-β1AR construct were subsequently incubated with purified GST-14-3-3ε, followed by immunoprecipitation with specific 14-3-3ε antibodies (or control nonrelated antibodies). Figure 3D shows a robust, specific interaction of 14-3-3ε with GST-3il-β1AR in a PKA phosphorylation–dependent way.

Mutation of PKA Phosphorylation Sites Renders β1AR Unable To Associate to 14-3-3ε and To Compete Its Interaction with Kv11.1

Overall, these results demonstrated a direct interaction between 14-3-3ε and PKA-phosphorylated β1AR. To further explore this point, we generated different β1AR mutants (β1ARS312A, β1ARS412A, and the double mutant β1ARS312,412A) in which serine residues 312 and 412 were substituted for alanines, a modification reported to prevent their phosphorylation by PKA upon receptor stimulation (Rapacciuolo et al., 2003). All these receptor constructs showed a similar pattern of adenylyl cyclase stimulation upon expression of comparable levels in HEK-293 cells and challenge with Iso (see Supplementary Figure S1). Despite such efficient activation of the cAMP signaling pathway, the ability of these mutants to associate to cotransfected 14-3-3ε isoforms, both in basal and agonist-stimulated conditions is completely lost in the double mutant β1ARS312,412A (Figure 4A) or markedly decreased for the individual mutants (Figure 4B), in comparison with β1ARwt. These results clearly indicate that PKA phosphorylation of the β1AR at these residues is required for the association of 14-3-3 proteins. In contrast, mutation of S312 to aspartate, which would mimic receptor phosphorylation, leads to an increased β1AR/14-3-3ε interaction even in basal conditions (Figure 4C).

Figure 4. Mutation of residues critical for PKA-mediated phosphorylation render β1AR unable to associate to 14-3-3ε proteins. HEK-293 cells were transiently transfected with HA-tagged 14-3-3ε and different Flag-tagged β1AR constructs. Cells were stimulated with Iso (10 μM) for the time indicated, and the association between the different receptors and 14-3-3ε proteins assessed as in previous figures. Gels are representative of 3–4 independent experiments. The fold-stimulation of β1AR/14-3-3ε association in each experimental setting with respect to the wild-type receptor in basal conditions, normalized by the amount of β1AR present in the immunoprecipitates, is shown in Supplementary Figure 3, C–E.

??1ARwt and Mutants Unable To Interact with 14-3-3ε Display a Different Pattern of Modulation of Kv11.1

Our data suggested that β1AR stimulation would sequentially lead to PKA activation, receptor phosphorylation, and recruitment of 14-3-3ε proteins to the complex, which would displace these molecules from their binding sites in Kv11.1 channels. To explore this hypothesis, we tested whether the presence of β1AR mutants, differing in their ability to recruit 14-3-3ε, had different effects on the interaction between Kv11.1 and 14-3-3ε.

In contrast to the disruption of binding observed with β1ARwt, the Kv11.1/14-3-3ε association is preserved upon expression of similar levels of β1ARS312,412A (Figure 5A). In this case the presence of Iso leads to an enhanced association, in agreement with the expected increase in PKA-phosphorylated Kv11.1. Consistently, the β1ARS312A mutant, which barely displays association with 14-3-3, is also unable to disrupt the Kv11.1/14-3-3 binding, whereas β1AR S312D markedly inhibits Kv11.1/14-3-3 coimmunoprecipitation, as the β1ARwt does (Figure 5A, right panel).

Figure 5. Modulation of Kv11.1/14-3-3ε interaction and Kv11.1 currents by expression of different β1AR mutants. (A) HEK-293 cells were cotransfected with Kv11.1 and HA-14-3-3ε in the absence or presence of the indicated β1AR constructs. After stimulation or not with Iso (10 μM) for 5 min, the presence of Kv11.1 in HA-14-3-3 immunoprecipitates was assessed as in Figure 1A. The expression levels of the different proteins in cell lysates were analyzed by immunoblot analysis as detailed in Materials and Methods. Results are representative of three independent experiments. (B and E) Kv11.1 current traces were obtained and analyzed as detailed in Figure 1 in the absence and the presence of 1 nM Iso in cells transfected with β1ARS312,412A or β1ARS312D as indicated. (C and F) Mean Kv11.1 current–voltage relationship 5 s isochronal in the absence and presence of 1 nM Iso in cells transfected with the indicated receptor constructs. (D and G) Mean Kv11.1 activation curves in the absence and presence of 1 nM Iso in cells transfected with the indicated receptor constructs. Each point represents the mean of ≥6 experiments and *p < 0.05 versus control.

Interestingly, in cells expressing β1ARS312,412A (Figure 5B) Iso increased the maximum outward current and accelerated the time course of activation but did not modify the time course of deactivation (Table 1). In contrast to the results obtained with β1ARwt (see Figure 1, E–G), Iso significantly increased the maximum outward current amplitude at negative potentials (Figure 5C) and markedly shifted the voltage-dependence of activation (Figure 5D), which may explain the increase in the tail and maximum outward currents observed at negative potentials (n = 6–9 p < 0.05 vs. control Table 1). It should be stressed that in cells expressing β1ARS312A or β1AR S412A the effects produced by Iso on current amplitude, as well as on the time- and voltage-dependent properties of the channels, were almost identical to those produced in cell expressing β1ARS312,S412A (Table 1). On the contrary, in cells expressing the β1ARS312D mutant (Figure 5, E–G), Iso accelerated the time course of the initial phase of deactivation (Table 1) and decreased the maximum outward current at potentials between −20 and +20 mV and the tail current elicited by applying pulses positive to −30 mV, without modifying the voltage-dependence of the activation (Figure 5G and Table 1), a situation reminiscent of the effects observed in cells expressing β1ARwt (Figure 1, E–G).

To better compare the effects induced by Iso, in Figures 6, I–K the percentages of change in the maximum outward current that elicited at −20 mV and in the amplitude of tail currents elicited after pulses to +60 mV or to −20 mV are shown. In cells expressing β1ARWt or β1ARS312D, Iso decreased the current amplitude at −20 mV by 19.9 ± 5.4% (n = 6) and by 23.5 ± 1.8% (n = 7), respectively (panel I), whereas in cells not transfected with β1AR, Iso increased the current by 13.9 ± 3.2% (n = 6). In cells expressing β1ARS312A, β1ARS412A, or β1ARS312,412A, Iso markedly increased the current amplitude (n = 6–9, p < 0.05 vs. increase in nontransfected cells panel I). In cells expressing β1ARwt or β1ARS312D, Iso inhibited the tail current after pulses to + 60 mV (panel J) by 30.1 ± 5.3 and 32.1 ± 12.3%, respectively. In contrast, the reduction of the tail currents induced by Iso in nontransfected cells and in cells expressing β1ARS312A, β1ARS412A, or β1ARS312,412A was significantly lower (p < 0.01, n = 6–9 panel J). Moreover, in these mutants again in contrast to the ≈20% inhibition observed in cells expressing β1ARwt or S312D, Iso significantly increased the tail current amplitude after pulses to −20 mV (n = 6–9 Figure 6K).

Figure 6. The differential effect of Iso on Kv11.1 currents mediated by β1ARwt or β1AR S312,412A is abolished in the presence of 14-3-3 inhibitors. (A, C, E, and G) Mean Kv11.1 current–voltage relationship 5 s isochronal in the absence and presence of 1 nM Iso for cells transfected with β1AR wt or β1ARS312,412A in the presence of R18 (A and C) or in cells cotransfected with DN14-3-3 mutant (E and G). (B, D, F, and H) Mean Kv11.1 activation curves in the absence and presence of 1 nM Iso for cells transfected with β1ARwt or β1ARS312,412A in the presence of R18 (B and D) or in cells cotransfected with DN14-3-3 mutant (F and H). (I–K) Percentage of change induced by 1 nM Iso in the different conditions in the amplitude of Kv11.1 currents elicited after 5-s pulses to −20 mV (I) and tail currents elicited on repolarization to −60 mV after 5-s pulses to +60 mV (J) and −20 mV (K). In I *p < 0.05 versus Kv11.1. In J, *p <0.05 versus data obtained in β1ARwt transfected cells, # p < 0.05 versus data obtained in β1ARS312,S412A-transfected cells. Each point or bar represents the mean ± SEM of ≥6 experiments.

To confirm that 14-3-3 proteins are involved in these differential effects of the β1AR phosphorylation deficient mutants on Kv11.1 current modulation, we next performed similar experiments in conditions where endogenous 14-3-3 function was inhibited. We first studied the effects of Iso in the presence of R-18 (200 nM), an unphosphorylated peptide that binds to all 14-3-3 isoforms with equal affinities producing a competitive inhibition (Wang et al., 1999). Because it can be presumed that the membrane diffusion of R-18 would be limited, this inhibitor was added to the internal solution that dialyzed the cells when the patch seals were broken. Kv11.1 currents recorded in R-18 dialyzed cells were of similar amplitude to those recorded in not dialyzed cells (p > 0.05) and exhibited the same time- and voltage-dependent properties. Interestingly, under these conditions, the differential effects produced by Iso on Kv11.1 currents in β1ARwt- and β1ARS312,412A-transfected cells were not observed. Iso similarly inhibited the maximum outward current elicited in cells expressing either β1ARwt or β1ARS312,S412A (Figure 6, A and C), as well as the tail currents elicited on return to −60 mV (Figure 6, B and D). Furthermore, Iso did not modify either the time course of channel activation and deactivation, or the voltage-dependence of activation (Table 2). Similar results were obtained when a different strategy of inhibition of 14-3-3 function based on cotransfection with a DN14-3-3 mutant was used (Figure 6, E–H, and Table 2). The effects of Iso on Kv11.1 channels in cells expressing β1AR wt or β1ARS312,S412A in the presence of 14-3-3 inhibitors, were qualitatively identical and not quantitatively different to those produced in cells expressing β1ARwt in the absence of inhibitors.

Table 2. Effects of 1 nM Iso on the time course of activation, fast phase of deactivation, and voltage-dependence of activation of Kv11.1 currents recorded in CHO cells

τ, time constant of current activation at 0 mV τF, time constant of the fast phase of tail current deactivation, recorded after pulses to +60 mV Vh, midpoint of the activation curve k, slope of the activation curve.


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Commentaires:

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