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10.2 : Visualiser et caractériser l'ADN - Biologie

10.2 : Visualiser et caractériser l'ADN - Biologie


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Compétences à développer

  • Expliquer l'utilisation de sondes d'acide nucléique pour visualiser des séquences d'ADN spécifiques
  • Expliquer l'utilisation de l'électrophorèse sur gel pour séparer des fragments d'ADN
  • Expliquer le principe de l'analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction et ses utilisations
  • Comparer et contraster les taches du sud et du nord
  • Expliquer les principes et les utilisations de l'analyse des puces à ADN
  • Décrire les méthodes utilisées pour séparer et visualiser les variantes de protéines
  • Expliquer la méthode et les utilisations de la réaction en chaîne par polymérase et du séquençage de l'ADN

La séquence d'une molécule d'ADN peut nous aider à identifier un organisme par rapport aux séquences connues hébergées dans une base de données. La séquence peut également nous dire quelque chose sur la fonction d'une partie particulière de l'ADN, par exemple si elle code une protéine particulière. La comparaison des signatures protéiques - les niveaux d'expression de matrices spécifiques de protéines - entre les échantillons est une méthode importante pour évaluer les réponses cellulaires à une multitude de facteurs et de stress environnementaux. L'analyse des signatures protéiques peut révéler l'identité d'un organisme ou comment une cellule réagit au cours d'une maladie.

L'ADN et les protéines d'intérêt sont microscopiques et généralement mélangés à de nombreuses autres molécules, y compris l'ADN ou des protéines sans rapport avec nos intérêts. De nombreuses techniques ont été développées pour isoler et caractériser les molécules d'intérêt. Ces méthodes ont été développées à l'origine à des fins de recherche, mais dans de nombreux cas, elles ont été simplifiées au point qu'une utilisation clinique de routine est possible. Par exemple, de nombreux agents pathogènes, comme la bactérie Helicobacter pylori, qui provoque des ulcères d'estomac, peut être détecté à l'aide de tests à base de protéines. En outre, un nombre croissant de tests d'identification basés sur l'amplification d'ADN hautement spécifiques et précis peuvent désormais détecter des agents pathogènes tels que les bactéries entériques résistantes aux antibiotiques, le virus de l'herpès simplex, le virus varicelle-zona et bien d'autres.

Analyse moléculaire de l'ADN

Dans cette sous-section, nous décrirons certaines des méthodes de base utilisées pour séparer et visualiser des fragments spécifiques d'ADN qui intéressent un scientifique. Certaines de ces méthodes ne nécessitent pas la connaissance de la séquence complète de la molécule d'ADN. Avant l'avènement du séquençage rapide de l'ADN, ces méthodes étaient les seules disponibles pour travailler avec l'ADN, mais elles constituent toujours l'arsenal de base des outils utilisés par les généticiens moléculaires pour étudier les réponses du corps aux maladies microbiennes et autres.

Sondage d'acide nucléique

Les molécules d'ADN sont petites et les informations contenues dans leur séquence sont invisibles. Comment un chercheur isole-t-il un tronçon particulier d'ADN, ou l'ayant isolé, détermine-t-il de quel organisme il provient, quelle est sa séquence ou quelle est sa fonction ? Une méthode pour identifier la présence d'une certaine séquence d'ADN utilise des morceaux d'ADN construits artificiellement appelés sondes. Les sondes peuvent être utilisées pour identifier différentes espèces bactériennes dans l'environnement et de nombreuses sondes ADN sont désormais disponibles pour détecter les agents pathogènes en clinique. Par exemple, des sondes ADN sont utilisées pour détecter les agents pathogènes vaginaux Candida albicans, Gardnerella vaginalis, et Trichomonas vaginalis.

Pour cribler une bibliothèque génomique pour un gène ou une séquence d'intérêt particulier, les chercheurs doivent savoir quelque chose sur ce gène. Si les chercheurs disposent d'une partie de la séquence d'ADN du gène d'intérêt, ils peuvent concevoir une sonde d'ADN, un fragment d'ADN simple brin complémentaire à une partie du gène d'intérêt et différent des autres séquences d'ADN de l'échantillon. La sonde d'ADN peut être synthétisée chimiquement par des laboratoires commerciaux, ou elle peut être créée par clonage, isolement et dénaturation d'un fragment d'ADN d'un organisme vivant. Dans les deux cas, la sonde d'ADN doit être marquée avec une étiquette moléculaire ou une balise, telle qu'un atome de phosphore radioactif (comme c'est le cas pour l'autoradiographie) ou un colorant fluorescent (comme c'est le cas dans les in situ hybridation, ou FISH), de sorte que la sonde et l'ADN auquel elle se lie soient visibles (Figure (PageIndex{1})). L'échantillon d'ADN à sonder doit également être dénaturé pour le rendre monocaténaire de sorte que la sonde d'ADN monocaténaire puisse s'hybrider à l'échantillon d'ADN monocaténaire à des emplacements où leurs séquences sont complémentaires. Bien que ces techniques soient précieuses pour le diagnostic, leur utilisation directe sur les expectorations et d'autres échantillons corporels peut être problématique en raison de la nature complexe de ces échantillons. L'ADN doit souvent d'abord être isolé à partir d'échantillons corporels par des méthodes d'extraction chimique avant qu'une sonde d'ADN puisse être utilisée pour identifier les agents pathogènes.

Figure (PageIndex{1}) : Des sondes d'ADN peuvent être utilisées pour confirmer la présence d'un agent pathogène suspecté dans les échantillons de patients. Ce diagramme illustre comment une sonde d'ADN peut être utilisée pour rechercher un gène d'intérêt associé à l'agent pathogène suspecté.

partie 2

Les symptômes légers et grippaux que connaît Kayla peuvent être causés par un certain nombre d'agents infectieux. En outre, plusieurs maladies auto-immunes non infectieuses, telles que la sclérose en plaques, le lupus érythémateux disséminé (LED) et la sclérose latérale amyotrophique (SLA), présentent également des symptômes qui correspondent aux premiers symptômes de Kayla. Cependant, au cours de plusieurs semaines, les symptômes de Kayla se sont aggravés. Elle a commencé à ressentir des douleurs articulaires dans ses genoux, des palpitations cardiaques et une étrange mollesse dans ses muscles faciaux. De plus, elle souffrait d'une raideur de la nuque et de maux de tête douloureux. À contrecœur, elle a décidé qu'il était temps de consulter un médecin.

Exercice (PageIndex{1})

  1. Les nouveaux symptômes de Kayla fournissent-ils des indices sur le type d'infection ou d'autres problèmes médicaux qu'elle peut avoir ?
  2. Quels tests ou outils un fournisseur de soins de santé pourrait-il utiliser pour identifier l'agent pathogène à l'origine des symptômes de Kayla ?

Électrophorèse sur gel d'agarose

Il existe un certain nombre de situations dans lesquelles un chercheur peut vouloir séparer physiquement une collection de fragments d'ADN de différentes tailles. Un chercheur peut également digérer un échantillon d'ADN avec une enzyme de restriction pour former des fragments. La taille résultante et le modèle de distribution des fragments peuvent souvent fournir des informations utiles sur la séquence de bases d'ADN qui peuvent être utilisées, un peu comme un balayage de code-barres, pour identifier l'individu ou l'espèce à laquelle appartient l'ADN.

L'électrophorèse sur gel est une technique couramment utilisée pour séparer des molécules biologiques en fonction de leur taille et de leurs caractéristiques biochimiques, telles que la charge et la polarité. L'électrophorèse sur gel d'agarose est largement utilisée pour séparer l'ADN (ou l'ARN) de différentes tailles qui peuvent être générés par digestion par des enzymes de restriction ou par d'autres moyens, tels que la PCR (Figure (PageIndex{2})).

En raison de son squelette chargé négativement, l'ADN est fortement attiré par une électrode positive. Dans l'électrophorèse sur gel d'agarose, le gel est orienté horizontalement dans une solution tampon. Les échantillons sont chargés dans des puits d'échantillon sur le côté du gel le plus proche de l'électrode négative, puis aspirés à travers le tamis moléculaire de la matrice d'agarose vers l'électrode positive. La matrice d'agarose empêche le mouvement des molécules plus grosses à travers le gel, tandis que les molécules plus petites le traversent plus facilement. Ainsi, la distance de migration est inversement corrélée à la taille du fragment d'ADN, les fragments plus petits parcourant une plus longue distance à travers le gel. Les tailles de fragments d'ADN dans un échantillon peuvent être estimées par comparaison avec des fragments de taille connue dans une échelle d'ADN également exécutée sur le même gel. Pour séparer de très gros fragments d'ADN, tels que des chromosomes ou des génomes viraux, l'électrophorèse sur gel d'agarose peut être modifiée en alternant périodiquement l'orientation du champ électrique pendant l'électrophorèse en champ pulsé (PFGE). En PFGE, les fragments plus petits peuvent se réorienter et migrer légèrement plus rapidement que les fragments plus gros et cette technique peut donc servir à séparer de très gros fragments qui autrement voyageraient ensemble lors de l'électrophorèse sur gel d'agarose standard. Dans n'importe laquelle de ces techniques d'électrophorèse, les emplacements des fragments d'ADN ou d'ARN dans le gel peuvent être détectés par diverses méthodes. Une méthode courante consiste à ajouter du bromure d'éthidium, un colorant qui s'insère dans les acides nucléiques à des emplacements non spécifiques et peut être visualisé lorsqu'il est exposé à la lumière ultraviolette. D'autres colorants plus sûrs que le bromure d'éthidium, un cancérogène potentiel, sont maintenant disponibles.

Figure (PageIndex{2}) : (a) Le processus d'électrophorèse sur gel d'agarose. (b) Un chercheur charge des échantillons dans un gel. (c) Cette photographie montre une électrophorèse terminée sur un gel d'agarose. L'échelle d'ADN est située dans les pistes 1 et 9. Sept échantillons sont situés dans les pistes 2 à 8. Le gel a été coloré au bromure d'éthidium et photographié sous lumière ultraviolette. (crédit a : modification du travail par Magnus Manske ; crédit b : modification du travail par le département américain de l'Agriculture ; crédit c : modification du travail par James Jacob)

Analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP)

Les sites de reconnaissance des enzymes de restriction sont courts (seulement quelques nucléotides de long), des palindromes spécifiques à la séquence et peuvent être trouvés dans tout le génome. Ainsi, des différences dans les séquences d'ADN dans les génomes des individus conduiront à des différences dans la distribution des sites de reconnaissance d'enzymes de restriction qui peuvent être visualisés sous forme de motifs de bandes distincts sur un gel après électrophorèse sur gel d'agarose. L'analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) compare les profils de bandes d'ADN de différents échantillons d'ADN après digestion par restriction (Figure (PageIndex{3})).

L'analyse RFLP a de nombreuses applications pratiques en médecine et en médecine légale. Par exemple, les épidémiologistes utilisent l'analyse RFLP pour suivre et identifier la source de micro-organismes spécifiques impliqués dans les épidémies d'intoxication alimentaire ou de certaines maladies infectieuses. L'analyse RFLP peut également être utilisée sur l'ADN humain pour déterminer les modèles d'hérédité des chromosomes avec des gènes variants, y compris ceux associés à des maladies héréditaires ou pour établir la paternité.

Les médecins légistes utilisent l'analyse RFLP comme une forme d'empreinte ADN, ce qui est utile pour analyser l'ADN obtenu à partir de scènes de crime, de suspects et de victimes. Des échantillons d'ADN sont collectés, le nombre de copies des molécules d'ADN de l'échantillon est augmenté par PCR, puis soumis à une digestion par des enzymes de restriction et à une électrophorèse sur gel d'agarose pour générer des motifs de bandes spécifiques. En comparant les modèles de bandes des échantillons prélevés sur les lieux du crime avec ceux prélevés sur les suspects ou les victimes, les enquêteurs peuvent déterminer avec certitude si les preuves ADN recueillies sur les lieux ont été laissées par des suspects ou des victimes.

Figure (PageIndex{3}) : L'analyse RFLP peut être utilisée pour différencier les séquences d'ADN. Dans cet exemple, un chromosome normal est digéré en deux fragments, alors que la digestion d'un chromosome muté ne produit qu'un seul fragment. Les petites flèches rouges pointant vers les deux segments chromosomiques différents montrent les emplacements des sites de reconnaissance des enzymes de restriction. Après digestion et électrophorèse sur gel d'agarose, les motifs de bandes reflètent le changement en montrant la perte de deux bandes plus courtes et le gain d'une bande plus longue. (crédit : modification des travaux par le National Center for Biotechnology Information)

Southern blots et modifications

Plusieurs techniques moléculaires capitalisent sur la complémentarité des séquences et l'hybridation entre les acides nucléiques d'un échantillon et des sondes d'ADN. Typiquement, le sondage d'échantillons d'acides nucléiques à l'intérieur d'un gel est infructueux car lorsque la sonde d'ADN pénètre dans un gel, les acides nucléiques d'échantillons à l'intérieur du gel se diffusent. Ainsi, les techniques de transfert sont couramment utilisées pour transférer des acides nucléiques sur une fine membrane chargée positivement en nitrocellulose ou en nylon. Dans la technique du Southern blot, développée par Sir Edwin Southern en 1975, les fragments d'ADN d'un échantillon sont d'abord séparés par électrophorèse sur gel d'agarose, puis transférés sur une membrane par capillarité (Figure (PageIndex{4})). Les fragments d'ADN qui se lient à la surface de la membrane sont ensuite exposés à une sonde d'ADN simple brin spécifique marquée avec une balise moléculaire radioactive ou fluorescente pour faciliter la détection. Les Southern blots peuvent être utilisés pour détecter la présence de certaines séquences d'ADN dans un échantillon d'ADN donné. Une fois que l'ADN cible à l'intérieur de la membrane est visualisé, les chercheurs peuvent découper la partie de la membrane contenant le fragment pour récupérer le fragment d'ADN d'intérêt.

Figure (PageIndex{4}) : Dans la technique de Southern blot, les fragments d'ADN sont d'abord séparés par électrophorèse sur gel d'agarose, puis transférés par capillarité sur une membrane en nylon, qui est ensuite imbibée d'une sonde d'ADN étiquetée avec une balise moléculaire pour une visualisation facile.

Les variantes du Southern blot - le dot blot, le slot blot et le spot blot - n'impliquent pas d'électrophorèse, mais concentrent plutôt l'ADN d'un échantillon dans un petit endroit sur une membrane. Après hybridation avec une sonde ADN, l'intensité du signal détecté est mesurée, permettant au chercheur d'estimer la quantité d'ADN cible présente dans l'échantillon.

Un transfert de colonies est une autre variante du transfert de Southern dans lequel des colonies représentant différents clones dans une banque génomique sont transférées sur une membrane en pressant la membrane sur la plaque de culture. Les cellules sur la membrane sont lysées et la membrane peut ensuite être sondée pour déterminer quelles colonies au sein d'une banque génomique abritent le gène cible. Parce que les colonies sur la plaque sont encore en croissance, les cellules d'intérêt peuvent être isolées de la plaque.

Dans le Northern blot, une autre variante du Southern blot, l'ARN (pas l'ADN) est immobilisé sur la membrane et sondé. Les Northern blots sont généralement utilisés pour détecter la quantité d'ARNm produite par l'expression génique dans un échantillon de tissu ou d'organisme.

Analyse de puces à ADN

Une autre technique qui capitalise sur l'hybridation entre des séquences d'acides nucléiques complémentaires est appelée analyse microarray. L'analyse des puces à ADN est utile pour la comparaison des profils d'expression génique entre différents types de cellules, par exemple, des cellules infectées par un virus par rapport à des cellules non infectées, ou des cellules cancéreuses par rapport à des cellules saines (Figure (PageIndex{5})).

Typiquement, l'ADN ou l'ADNc d'un échantillon expérimental est déposé sur une lame de verre à côté de séquences d'ADN connues. Chaque lame peut contenir plus de 30 000 types de fragments d'ADN différents. Des fragments d'ADN distincts (englobant toute la bibliothèque génomique d'un organisme) ou des fragments d'ADNc (correspondant à l'ensemble complet des gènes exprimés d'un organisme) peuvent être repérés individuellement sur une lame de verre.

Une fois déposé sur la lame, l'ADN génomique ou l'ARNm peut être isolé des deux échantillons à des fins de comparaison. Si l'ARNm est isolé, il est rétro-transcrit en ADNc à l'aide de la transcriptase inverse. Ensuite, les deux échantillons d'ADN génomique ou d'ADNc sont marqués avec différents colorants fluorescents (typiquement rouge et vert). Les échantillons d'ADN génomique marqués sont ensuite combinés en quantités égales, ajoutés à la puce de la puce à ADN et autorisés à s'hybrider à des points complémentaires sur la puce à ADN.

L'hybridation d'échantillons de molécules d'ADN génomique peut être surveillée en mesurant l'intensité de la fluorescence à des endroits particuliers sur la puce à ADN. Des différences dans la quantité d'hybridation entre les échantillons peuvent être facilement observées. Si les acides nucléiques d'un seul échantillon s'hybrident à un point particulier de la puce à ADN, alors ce point apparaîtra en vert ou en rouge. Cependant, si les acides nucléiques des deux échantillons s'hybrident, la tache apparaîtra jaune en raison de la combinaison des colorants rouge et vert.

Bien que la technologie des puces à ADN permette une comparaison holistique entre deux échantillons en peu de temps, elle nécessite un équipement de détection et un logiciel d'analyse sophistiqués (et coûteux). En raison du coût, cette technologie est généralement limitée aux paramètres de recherche. Les chercheurs ont utilisé l'analyse des puces à ADN pour étudier comment l'expression des gènes est affectée dans les organismes infectés par des bactéries ou des virus ou soumis à certains traitements chimiques.

Figure (PageIndex{5}) : (a) Les étapes de l'analyse des puces à ADN sont illustrées. Ici, les modèles d'expression génique sont comparés entre les cellules cancéreuses et les cellules saines. (b) Les informations sur les puces à ADN peuvent être exprimées sous forme de carte thermique. Les gènes sont affichés sur le côté gauche; différents échantillons sont affichés en bas. Les gènes exprimés uniquement dans les cellules cancéreuses sont représentés dans différentes nuances de rouge; les gènes exprimés uniquement dans les cellules normales sont représentés dans différentes nuances de vert. Les gènes exprimés dans les cellules cancéreuses et normales sont indiqués en jaune.

Explorez la technologie des puces électroniques sur ce site Web interactif.

Exercice (PageIndex{2})

  1. En quoi consiste une sonde ADN ?
  2. Pourquoi un Southern blot est-il utilisé après l'électrophorèse sur gel d'un produit de digestion d'ADN ?

Analyse moléculaire des protéines

Dans de nombreux cas, il peut ne pas être souhaitable ou possible d'étudier directement l'ADN ou l'ARN. Les protéines peuvent fournir des informations spécifiques à l'espèce pour l'identification ainsi que des informations importantes sur la façon dont une cellule ou un tissu réagit à la présence d'un micro-organisme pathogène. Diverses protéines nécessitent différentes méthodes d'isolement et de caractérisation.

Électrophorèse sur gel de polyacrylamide

Une variante de l'électrophorèse sur gel, appelée électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE), est couramment utilisée pour séparer les protéines. En PAGE, la matrice de gel est plus fine et composée de polyacrylamide au lieu d'agarose. De plus, la PAGE est généralement effectuée à l'aide d'un appareil à gel vertical (Figure (PageIndex{6})). En raison des charges variables associées aux chaînes latérales d'acides aminés, la PAGE peut être utilisée pour séparer les protéines intactes en fonction de leurs charges nettes. Alternativement, les protéines peuvent être dénaturées et recouvertes d'un détergent chargé négativement appelé sodium dodécyl sulfate (SDS), masquant les charges natives et permettant une séparation basée uniquement sur la taille. La PAGE peut être encore modifiée pour séparer les protéines en fonction de deux caractéristiques, telles que leurs charges à différents pH ainsi que leur taille, grâce à l'utilisation de la PAGE bidimensionnelle. Dans tous ces cas, après électrophorèse, les protéines sont visualisées par coloration, généralement avec du bleu de Coomassie ou une coloration à l'argent.

Figure (PageIndex{6}) : (a) Le SDS est un détergent qui dénature les protéines et masque leurs charges natives, les rendant uniformément chargées négativement. (b) Le processus de SDS-PAGE est illustré dans ces étapes. (c) Une photographie d'un gel SDS-PAGE montre des bandes colorées de Coomassie où des protéines de différentes tailles ont migré le long du gel en réponse à la tension appliquée. Une voie standard de taille est visible sur le côté droit du gel. (crédit b : modification de l'œuvre par « GeneEd »/YouTube)

Exercice (PageIndex{3})

Sur quelle base les protéines sont-elles séparées en SDS-PAGE ?

partie 3

Lorsque Kayla a décrit ses symptômes, son médecin a d'abord suspecté une méningite bactérienne, ce qui correspond à ses maux de tête et à sa raideur de la nuque.Cependant, elle a rapidement exclu cette possibilité car la méningite progresse généralement plus rapidement que ce que connaissait Kayla. Bon nombre de ses symptômes ressemblaient toujours à ceux de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et du lupus érythémateux disséminé (LED), et le médecin considérait également la maladie de Lyme comme une possibilité étant donné le temps que Kayla passe dans les bois. Kayla ne se souvenait d'aucune piqûre de tique récente (le moyen typique par lequel la maladie de Lyme est transmise) et elle n'avait pas l'éruption cutanée typique associée à la maladie de Lyme (Figure (PageIndex{7})). Cependant, 20 à 30% des patients atteints de la maladie de Lyme ne développent jamais cette éruption cutanée, le médecin n'a donc pas voulu l'exclure.

Le médecin de Kayla a ordonné une IRM de son cerveau, une numération formule sanguine complète pour tester l'anémie, des tests sanguins évaluant la fonction hépatique et rénale, et des tests supplémentaires pour confirmer ou exclure le LED ou la maladie de Lyme. Les résultats de ses tests étaient incompatibles avec ceux du LED et de la SLA, et le résultat du test de recherche d'anticorps contre la maladie de Lyme était « équivoque », ce qui signifie non concluant. Après avoir exclu la SLA et le LED, le médecin de Kayla a décidé d'effectuer des tests supplémentaires pour la maladie de Lyme.

Exercice (PageIndex{4})

  1. Pourquoi le médecin de Kayla suspecterait-il encore la maladie de Lyme même si les résultats des tests n'ont pas détecté d'anticorps de Lyme dans le sang ?
  2. Quel type de test moléculaire pourrait être utilisé pour la détection des anticorps sanguins contre la maladie de Lyme ?
Réponse

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Figure (PageIndex{7}) : Une éruption cutanée est l'un des symptômes courants de la maladie de Lyme, mais jusqu'à 30% des personnes infectées ne développent jamais d'éruption cutanée. (crédit: Centers for Disease Control and Prevention)

Méthodes d'analyse d'ADN basées sur l'amplification

Diverses méthodes peuvent être utilisées pour obtenir des séquences d'ADN, qui sont utiles pour étudier les organismes pathogènes. Avec l'avènement de la technologie de séquençage rapide, notre base de connaissances sur l'ensemble des génomes d'organismes pathogènes a connu une croissance phénoménale. Nous commençons par une description de la réaction en chaîne par polymérase, qui n'est pas une méthode de séquençage mais a permis aux chercheurs et aux cliniciens d'obtenir les grandes quantités d'ADN nécessaires au séquençage et à d'autres études. La réaction en chaîne par polymérase élimine la dépendance que nous avions autrefois vis-à-vis des cellules pour faire plusieurs copies de l'ADN, obtenant le même résultat grâce à des réactions relativement simples à l'extérieur de la cellule.

Réaction en chaîne par polymérase (PCR)

La plupart des méthodes d'analyse de l'ADN, telles que la digestion par des enzymes de restriction et l'électrophorèse sur gel d'agarose, ou le séquençage de l'ADN nécessitent de grandes quantités d'un fragment d'ADN spécifique. Dans le passé, de grandes quantités d'ADN étaient produites en faisant croître les cellules hôtes d'une banque génomique. Cependant, les bibliothèques prennent du temps et des efforts pour se préparer et les échantillons d'ADN d'intérêt viennent souvent en quantités infimes. La réaction en chaîne par polymérase (PCR) permet une amplification rapide du nombre de copies de séquences d'ADN spécifiques pour une analyse plus approfondie (Figure (PageIndex{8})). L'une des techniques les plus puissantes de la biologie moléculaire, la PCR a été développée en 1983 par Kary Mullis alors qu'il travaillait chez Cetus Corporation. La PCR a des applications spécifiques dans les laboratoires de recherche, de médecine légale et cliniques, notamment :

  • déterminer la séquence de nucléotides dans une région spécifique de l'ADN
  • amplification d'une région cible d'ADN pour le clonage dans un vecteur plasmidique
  • identifier la source d'un échantillon d'ADN laissé sur une scène de crime
  • analyser des échantillons pour déterminer la paternité
  • comparer des échantillons d'ADN ancien avec des organismes modernes
  • déterminer la présence de micro-organismes difficiles à cultiver ou incultivables chez l'homme ou dans des échantillons environnementaux

La PCR est un in vitro technique de laboratoire qui tire parti du processus naturel de réplication de l'ADN. Les enzymes ADN polymérases thermostables utilisées dans la PCR sont dérivées de procaryotes hyperthermophiles. Taq ADN polymérase, couramment utilisé en PCR, est dérivé de la Thermus aquatique bactérie isolée d'une source chaude dans le parc national de Yellowstone. La réplication de l'ADN nécessite l'utilisation d'amorces pour l'initiation de la réplication afin d'avoir des groupes 3'-hydroxyle libres disponibles pour l'ajout de nucléotides par l'ADN polymérase. Cependant, alors que les amorces composées d'ARN sont normalement utilisées dans les cellules, les amorces d'ADN sont utilisées pour la PCR. Les amorces d'ADN sont préférables en raison de leur stabilité, et les amorces d'ADN avec des séquences connues ciblant une région d'ADN spécifique peuvent être synthétisées chimiquement dans le commerce. Ces amorces d'ADN sont fonctionnellement similaires aux sondes d'ADN utilisées pour les diverses techniques d'hybridation décrites précédemment, se liant à des cibles spécifiques en raison de la complémentarité entre la séquence d'ADN cible et l'amorce.

La PCR se déroule sur plusieurs cycles, chacun contenant trois étapes : dénaturation, annelage et extension. Des machines appelées thermocycleurs sont utilisées pour la PCR ; ces machines peuvent être programmées pour faire défiler automatiquement les températures requises à chaque étape ([link]). Tout d'abord, l'ADN matrice double brin contenant la séquence cible est dénaturé à environ 95°C. La température élevée requise pour séparer physiquement (plutôt qu'enzymatiquement) les brins d'ADN est la raison pour laquelle l'ADN polymérase thermostable est requise. Ensuite, la température est abaissée à environ 50 °C. Cela permet aux amorces d'ADN complémentaires aux extrémités de la séquence cible de s'hybrider (coller) aux brins de matrice, avec une amorce s'hybridant à chaque brin. Enfin, la température est portée à 72 °C, la température optimale pour l'activité de l'ADN polymérase thermostable, permettant l'ajout de nucléotides à l'amorce en utilisant la cible simple brin comme matrice. Chaque cycle double le nombre de copies d'ADN cible double brin. En règle générale, les protocoles PCR comprennent 25 à 40 cycles, permettant l'amplification d'une séquence cible unique de dizaines de millions à plus d'un billion.

La réplication naturelle de l'ADN est conçue pour copier l'intégralité du génome et s'initie sur un ou plusieurs sites d'origine. Les amorces sont construites pendant la réplication, pas avant, et ne consistent pas en quelques séquences spécifiques. La PCR cible des régions spécifiques d'un échantillon d'ADN à l'aide d'amorces spécifiques à une séquence. Ces dernières années, une variété de méthodes d'amplification par PCR isotherme qui contournent le besoin de cyclage thermique ont été développées, tirant parti des protéines accessoires qui facilitent le processus de réplication de l'ADN. À mesure que le développement de ces méthodes se poursuit et que leur utilisation se généralise dans les laboratoires de recherche, médico-légaux et cliniques, les thermocycleurs peuvent devenir obsolètes.

Figure (PageIndex{8}) : La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est utilisée pour produire de nombreuses copies d'une séquence spécifique d'ADN.

Approfondissez votre compréhension de la réaction en chaîne de la polymérase en visionnant cette animation et en réalisant un exercice interactif.

Variantes PCR

Plusieurs modifications ultérieures de la PCR augmentent encore l'utilité de cette technique. La transcriptase inverse PCR (RT-PCR) est utilisée pour obtenir des copies d'ADN d'une molécule d'ARNm spécifique. La RT-PCR commence par l'utilisation de l'enzyme transcriptase inverse pour convertir les molécules d'ARNm en ADNc. Cet ADNc est ensuite utilisé comme matrice pour l'amplification PCR traditionnelle. La RT-PCR peut détecter si un gène spécifique a été exprimé dans un échantillon. Une autre application récente de la PCR est la PCR en temps réel, également connue sous le nom de PCR quantitative (qPCR). Les protocoles PCR et RT-PCR standard ne sont pas quantitatifs car l'un des réactifs peut devenir limitant avant que tous les cycles du protocole ne soient terminés, et les échantillons ne sont analysés qu'à la fin. Parce qu'il n'est pas possible de déterminer quand dans le protocole PCR ou RT-PCR un réactif donné est devenu limitant, il n'est pas possible de savoir combien de cycles ont été effectués avant ce point, et il n'est donc pas possible de déterminer combien d'origine des molécules matrices étaient présentes dans l'échantillon au début de la PCR. En qPCR, cependant, l'utilisation de la fluorescence permet de surveiller l'augmentation d'une matrice double brin au cours d'une réaction PCR au fur et à mesure qu'elle se produit. Ces données cinétiques peuvent ensuite être utilisées pour quantifier la quantité de la séquence cible d'origine. L'utilisation de la qPCR ces dernières années a encore élargi les capacités de la PCR, permettant aux chercheurs de déterminer le nombre de copies d'ADN, et parfois d'organismes, présents dans un échantillon. En milieu clinique, la qRT-PCR est utilisée pour déterminer la charge virale chez les patients séropositifs afin d'évaluer l'efficacité de leur traitement.

Séquençage ADN

Une technique de séquençage de base est la méthode de terminaison de chaîne, également connue sous le nom de méthode didésoxy ou méthode de séquençage d'ADN de Sanger, développée par Frederick Sanger en 1972. La méthode de terminaison de chaîne implique la réplication d'ADN d'une matrice simple brin avec l'utilisation d'une amorce d'ADN. pour initier la synthèse d'un brin complémentaire, l'ADN polymérase, un mélange des quatre monomères désoxynucléotidiques réguliers (dNTP) et une petite proportion de didésoxynucléotides (ddNTP), chacun marqué avec une balise moléculaire. Les ddNTP sont des monomères auxquels il manque un groupe hydroxyle (-OH) au niveau du site auquel un autre nucléotide se fixe habituellement pour former une chaîne (Figure (PageIndex{9})). Chaque fois qu'un ddNTP est incorporé au hasard dans le brin complémentaire en croissance, il met fin au processus de réplication de l'ADN pour ce brin particulier. Cela se traduit par de multiples brins courts d'ADN répliqué qui se terminent chacun à un point différent au cours de la réplication. Lorsque le mélange réactionnel est soumis à une électrophorèse sur gel, les multiples brins d'ADN nouvellement répliqués forment une échelle de tailles différentes. Parce que les ddNTP sont marqués, chaque bande sur le gel reflète la taille du brin d'ADN lorsque le ddNTP a terminé la réaction.

À l'époque de Sanger, quatre réactions étaient mises en place pour chaque molécule d'ADN séquencée, chaque réaction ne contenant qu'un seul des quatre ddNTP possibles. Chaque ddNTP a été marqué avec une molécule de phosphore radioactif. Les produits des quatre réactions ont ensuite été passés dans des voies séparées côte à côte sur des gels PAGE longs et étroits, et les bandes de longueurs variables ont été détectées par autoradiographie. Aujourd'hui, ce processus a été simplifié grâce à l'utilisation de ddNTP, chacun marqué avec un colorant fluorescent ou un fluorochrome de couleur différente (Figure (PageIndex{10})), dans une réaction de séquençage contenant les quatre ddNTP possibles pour chaque molécule d'ADN étant séquencé (Figure (PageIndex{11})). Ces fluorochromes sont détectés par spectroscopie de fluorescence. La détermination de la couleur de fluorescence de chaque bande lorsqu'elle passe par le détecteur produit la séquence nucléotidique du brin matrice.

Figure (PageIndex{9}) : Un didésoxynucléotide est de structure similaire à un désoxynucléotide, mais il manque le groupe hydroxyle 3' (indiqué par la case ombrée). Lorsqu'un didésoxynucléotide est incorporé dans un brin d'ADN, la synthèse d'ADN s'arrête.

Figure (PageIndex{10}) : La méthode de terminaison de chaîne didésoxy de Frederick Sanger est illustrée, en utilisant des ddNTP marqués avec des fluorochromes. En utilisant les ddNTP, un mélange de fragments d'ADN de toutes les tailles possibles, variant en longueur d'un seul nucléotide, peut être généré. L'ADN est séparé sur la base de la taille et chaque bande peut être détectée avec un détecteur de fluorescence.

Figure (PageIndex{11}) : Ce diagramme résume la méthode de séquençage de Sanger utilisant des ddNTP marqués au fluorochrome et une électrophorèse sur gel capillaire.

Depuis 2005, les techniques de séquençage automatisé utilisées par les laboratoires relèvent du séquençage de nouvelle génération, qui est un groupe de techniques automatisées utilisées pour le séquençage rapide de l'ADN. Ces méthodes ont révolutionné le domaine de la génétique moléculaire car les séquenceurs à faible coût peuvent générer des séquences de centaines de milliers ou de millions de fragments courts (25 à 600 paires de bases) en une seule journée. Bien que plusieurs variantes des technologies de séquençage de nouvelle génération soient fabriquées par différentes sociétés (par exemple, le pyroséquençage de 454 Life Sciences et la technologie Solexa d'Illumina), elles permettent toutes de séquencer rapidement des millions de bases, ce qui rend le séquençage de génomes entiers relativement facile, peu coûteux, et banal. Dans le séquençage 454 (pyroséquençage), par exemple, un échantillon d'ADN est fragmenté en fragments simple brin de 400 à 600 pb, modifiés par l'ajout d'adaptateurs d'ADN aux deux extrémités de chaque fragment. Chaque fragment d'ADN est ensuite immobilisé sur une bille et amplifié par PCR, en utilisant des amorces conçues pour s'hybrider aux adaptateurs, créant une bille contenant de nombreuses copies de ce fragment d'ADN. Chaque bille est ensuite placée dans un puits séparé contenant des enzymes de séquençage. Dans le puits, chacun des quatre nucléotides est ajouté l'un après l'autre ; lorsque chacun est incorporé, le pyrophosphate est libéré en tant que sous-produit de la polymérisation, émettant un petit flash de lumière qui est enregistré par un détecteur. Ceci fournit l'ordre des nucléotides incorporés lorsqu'un nouveau brin d'ADN est fabriqué et est un exemple de séquençage de synthèse. Les séquenceurs de nouvelle génération utilisent un logiciel sophistiqué pour passer à travers le processus fastidieux de mise en ordre de tous les fragments. Dans l'ensemble, ces technologies continuent de progresser rapidement, diminuant le coût du séquençage et augmentant rapidement la disponibilité des données de séquence d'une grande variété d'organismes.

Le National Center for Biotechnology Information abrite une base de données de séquences génétiques largement utilisée appelée GenBank, où les chercheurs déposent des informations génétiques pour un usage public. Lors de la publication des données de séquence, les chercheurs les téléchargent sur GenBank, permettant aux autres chercheurs d'accéder aux informations. La collaboration permet aux chercheurs de comparer des informations de séquences d'échantillons nouvellement découvertes ou inconnues avec la vaste gamme de données de séquences qui existent déjà.

Visionnez une animation sur le séquençage 454 pour approfondir votre compréhension de cette méthode.

UTILISER UN TAAN POUR DIAGNOSTIQUER UN C. DIFFICILE INFECTION

Javier, un patient de 80 ans ayant des antécédents de maladie cardiaque, est récemment rentré de l'hôpital après avoir subi une angioplastie pour insérer un stent dans une artère cardiaque. Pour minimiser la possibilité d'infection, Javier a reçu des antibiotiques à large spectre par voie intraveineuse pendant et peu de temps après son intervention. Il a été libéré quatre jours après l'intervention, mais une semaine plus tard, il a commencé à ressentir de légères crampes abdominales et une diarrhée aqueuse plusieurs fois par jour. Il a perdu l'appétit, est devenu gravement déshydraté et a développé de la fièvre. Il a également remarqué du sang dans ses selles. La femme de Javier a appelé le médecin, qui lui a demandé de l'emmener immédiatement aux urgences.

Le personnel de l'hôpital a effectué plusieurs tests et a constaté que les niveaux de créatinine rénale de Javier étaient élevés par rapport aux niveaux dans son sang, indiquant que ses reins ne fonctionnaient pas bien. Les symptômes de Javier suggèrent une possible infection par Clostridium difficile, une bactérie résistante à de nombreux antibiotiques. L'hôpital a collecté et cultivé un échantillon de selles pour rechercher la production de toxines A et B en C. difficile, mais les résultats sont revenus négatifs. Cependant, les résultats négatifs n'ont pas suffi à exclure une C. difficile infection parce que la culture de C. difficile et la détection de ses toxines caractéristiques peut être difficile, en particulier dans certains types d'échantillons. Pour plus de sécurité, ils ont procédé à un test d'amplification des acides nucléiques (NAAT) diagnostique. Actuellement, les TAAN sont l'étalon-or du diagnosticien clinique pour détecter le matériel génétique d'un agent pathogène. Dans le cas de Javier, la qPCR a été utilisée pour rechercher le gène codant C. difficile toxine B (tcdB). Lorsque l'analyse qPCR est revenue positive, le médecin traitant a conclu que Javier souffrait bien d'un C. difficile infection et immédiatement prescrit l'antibiotique vancomycine, à administrer par voie intraveineuse. L'antibiotique a éliminé l'infection et Javier s'est complètement rétabli.

Parce que les infections par C. difficile étaient de plus en plus répandus dans la communauté de Javier, son échantillon a été analysé plus avant pour voir si la souche spécifique de C. difficile pourrait être identifié. L'échantillon de selles de Javier a été soumis à un ribotypage et à une analyse PCR basée sur des séquences répétitives (rep-PCR). Dans le ribotypage, une courte séquence d'ADN entre les gènes de l'ARNr 16S et de l'ARNr 23S est amplifiée et soumise à une digestion de restriction (Figure (PageIndex{12})). Cette séquence varie entre les souches de C. difficile, donc les enzymes de restriction couperont à différents endroits. En rep-PCR, des amorces d'ADN conçues pour se lier à de courtes séquences couramment trouvées répétées dans le C. difficile génome ont été utilisés pour la PCR. Après digestion par restriction, une électrophorèse sur gel d'agarose a été réalisée dans les deux types d'analyse pour examiner les profils de bandes résultant de chaque procédure (Figure (PageIndex{13})). La Rep-PCR peut être utilisée pour sous-typer davantage divers ribotypes, augmentant la résolution pour détecter les différences entre les souches. Le ribotype de la souche infectant Javier s'est avéré être le ribotype 27, une souche connue pour sa virulence accrue, sa résistance aux antibiotiques et sa prévalence accrue aux États-Unis, au Canada, au Japon et en Europe.1

Exercice (PageIndex{5})

  1. Comment les motifs de bandes diffèrent-ils entre les souches de C. difficile?
  2. Pourquoi pensez-vous que les tests de laboratoire n'ont pas permis de détecter directement la production de toxines ?

Figure (PageIndex{12}) : Un gel montrant les produits PCR de diverses souches de Clostridium difficile. L'échantillon de Javier est montré en bas; notez qu'il correspond au ribotype 27 dans l'ensemble de référence. (crédit : modification du travail par l'American Society for Microbiology)

Figure (PageIndex{13}) : Des souches de bactéries infectieuses, telles que C. difficile, peuvent être identifiées par analyse moléculaire. Le ribotypage par PCR est couramment utilisé pour identifier des souches particulières de C. difficile. Rep-PCR est une technique moléculaire alternative qui est également utilisée pour identifier un C. particulier (crédit b : modification des travaux de l'American Society for Microbiology)

Concepts clés et résumé

  • Trouver un gène d'intérêt dans un échantillon nécessite l'utilisation d'un sonde ADN marqué avec une balise moléculaire (généralement radioactivité ou fluorescence) qui peut s'hybrider avec un acide nucléique simple brin complémentaire dans l'échantillon.
  • Électrophorèse sur gel d'agarose permet la séparation des molécules d'ADN en fonction de leur taille.
  • Polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) l'analyse permet la visualisation par électrophorèse sur gel d'agarose de variantes distinctes d'une séquence d'ADN causées par des différences dans les sites de restriction.
  • tache sud L'analyse permet aux chercheurs de trouver une séquence d'ADN particulière dans un échantillon alors que tache du nord L'analyse permet aux chercheurs de détecter une séquence d'ARNm particulière exprimée dans un échantillon.
  • Technologie des puces à ADN est une technique d'hybridation d'acide nucléique qui permet l'examen de plusieurs milliers de gènes à la fois pour trouver des différences dans les gènes ou les modèles d'expression génique entre deux échantillons d'ADN génomique ou d'ADNc,
  • Electrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) permet la séparation des protéines par taille, en particulier si les charges de protéines natives sont masquées par un prétraitement avec du SDS.
  • Réaction en chaîne par polymérase permet l'amplification rapide d'une séquence d'ADN spécifique. Des variantes de la PCR peuvent être utilisées pour détecter l'expression de l'ARNm (PCR transcriptase inverse) ou pour quantifier une séquence particulière dans l'échantillon original (Pcr en temps réel).
  • Bien que le développement de Séquençage de l'ADN de Sanger était révolutionnaire, les progrès de séquençage de nouvelle génération permettre le séquençage rapide et peu coûteux des génomes de nombreux organismes, accélérant le volume de nouvelles données de séquence.

Choix multiple

Quelle technique est utilisée pour séparer les fragments de protéines en fonction de leur taille ?

A. électrophorèse sur gel de polyacrylamide
B. Southern blot
C. électrophorèse sur gel d'agarose
D. réaction en chaîne par polymérase

UNE

Quelle technique utilise la digestion par enzyme de restriction suivie d'une électrophorèse sur gel d'agarose pour générer un motif de bandes à comparer à un autre échantillon traité de la même manière ?

A. qPCR
B. RT-PCR
C. RFLP
D. 454 séquençage

C

Toutes les techniques suivantes impliquent l'hybridation entre des molécules d'acide nucléique simple brin sauf:

A. Analyse Southern blot
B. Analyse RFLP
C. analyse Northern blot
D. analyse de puces à ADN

B

Remplir les trous

La technique de transfert __________ est utilisée pour trouver un fragment d'ARN dans un échantillon qui est complémentaire d'une sonde d'ADN.

nord

L'étape de PCR au cours de laquelle la molécule matrice double brin devient simple brin est appelée _____________.

dénaturation

La méthode de séquençage impliquant l'incorporation de ddNTP est appelée __________.

Séquençage de Sanger, méthode didésoxy ou méthode de terminaison de chaîne

Vrai faux

Dans l'électrophorèse sur gel d'agarose, l'ADN sera attiré par l'électrode négative.

faux

Réponse courte

Pourquoi est-il important qu'une sonde ADN soit marquée avec une balise moléculaire ?

Lors de la séparation des protéines strictement par taille, pourquoi l'exposition au SDS est-elle d'abord requise ?

Pourquoi l'ADN polymérase utilisée lors de la PCR doit-elle être thermostable ?

Esprit critique

Supposons que vous travailliez dans un laboratoire de biologie moléculaire et que vous ayez des difficultés à effectuer la PCR avec succès. Vous décidez de revérifier le protocole PCR programmé dans le thermocycleur et découvrez que la température de recuit a été programmée pour être de 65 °C au lieu de 50 °C, comme vous l'aviez prévu. Quels effets cette erreur aurait-elle sur la réaction PCR ? Reportez-vous à la figure.

Quel est l'avantage de l'analyse par microréseau par rapport à l'analyse par Northern Blot dans le suivi des changements dans l'expression des gènes ?

Quelle est la différence entre la PCR reverse transcriptase (RT-PCR) et la PCR quantitative en temps réel (qPCR) ?

Notes de bas de page

  1. 1 Patrizia Spigaglia, Fabrizio Barbanti, Anna Maria Dionisi et Paola Mastrantonio. "Clostridium difficile Isolats résistants aux fluoroquinolones en Italie : émergence du ribotype PCR 018. » Journal de microbiologie clinique 48 non. 8 (2010) : 2892-2896.

Donateur

  • Nina Parker, (Université Shenandoah), Mark Schneegurt (Wichita State University), Anh-Hue Thi Tu (Georgia Southwestern State University), Philip Lister (Central New Mexico Community College) et Brian M. Forster (Université Saint Joseph) avec de nombreux auteurs contributeurs. Contenu original via Openstax (CC BY 4.0 ; accès gratuit sur https://openstax.org/books/microbiology/pages/1-introduction)


10.2 : Visualiser et caractériser l'ADN - Biologie

Des avancées méthodologiques récentes nous permettent d'étudier les structures G-quadruplexes à une résolution et un débit plus élevés.

Des approches pour utiliser les structures G-quadruplex comme outils moléculaires sont mises en évidence.

Les méthodes informatiques et expérimentales pour les études G-quadruplex sont passées en revue.

Les travaux examinés ici fournissent des informations uniques pour explorer les rôles biologiques et les utilisations des G-quadruplexes dans la recherche fondamentale et appliquée.

Les séquences riches en guanine (G) dans les acides nucléiques peuvent s'assembler en structures G-quadruplexes qui impliquent des G-quartets liés par des nucléotides en boucle. La diversité structurelle et topologique des G-quadruplexes a attiré une grande attention pendant des décennies. Des avancées méthodologiques récentes ont fait progresser l'identification et la caractérisation des G-quadruplexes in vivo aussi bien que in vitro, et à une résolution et un débit beaucoup plus élevés, ce qui a considérablement élargi notre compréhension actuelle de la structure et de la fonction du G-quadruplex. L'accumulation de connaissances sur les propriétés structurelles des G-quadruplexes a permis de concevoir et de développer un répertoire d'outils moléculaires et chimiques pour des applications biologiques. Cette revue met en évidence comment ces méthodes et découvertes passionnantes ont ouvert de nouvelles portes pour étudier les fonctions et applications potentielles des G-quadruplexes dans les biosciences fondamentales et appliquées.


Caractérisation des articles les plus cités en cytométrie de masse grâce aux H-Classics

Les auteurs ont ici effectué des analyses bibliométriques sur les publications de cytométrie de masse de 2010 à 2019. La cytométrie de masse est en effet une technologie importante pour le phénotypage en profondeur du système immunitaire et le manuscrit décrit bien cette importance.

Je ne peux pas commenter les méthodes utilisées dans ce manuscrit car je ne connais pas les méthodes d'analyse bibliométrique. Le manuscrit est bien écrit et la justification est claire. Je pense que ce manuscrit intéressera les lecteurs de Biologie.

Nous remercions le relecteur pour les commentaires très positifs et encourageants sur notre travail. Le manuscrit a subi des modifications mineures pour tenir compte des recommandations de l'éditeur et des autres relecteurs.

Les données du WOS ont été chargées et traitées dans R. Les données et le code R développé pour cette analyse doivent être mis à disposition avec un lien vers un référentiel persistant (i.e. DOI fourni par l'institution, Zenodo, etc.). Cela profitera grandement à l'article et à la communauté scientifique.

Figure 1, les auteurs devraient envisager d'augmenter la taille de la police pour rendre le texte facilement lisible.

Le texte de la description de la figure 2 &ldquoLa figure 2 montre les citations moyennes par an des HCP dans le domaine de la cytométrie de masse, indiquant que le pic le plus élevé a été atteint en 2019 avec 208 citations, suivant une tendance à la hausse&rdquo peut être mieux lu &ldquoLa figure 2 montre les citations moyennes par an de HCP dans le domaine de la cytométrie de masse, restant assez constant entre 2010 et 2018, avant de connaître une forte augmentation à 208 en 2019.&rdquo

Si l'index H est utilisé pour classer les auteurs dans le tableau 3, l'auteur avec 5 articles et l'index H devrait se classer n°8. En outre, les données du tableau 3 doivent également être classées à l'aide des TC (par exemple, de haut en bas pour les auteurs ayant le même indice H).

Les auteurs devraient envisager d'ajouter une légende à la figure 3 pour la taille et le codage couleur des cercles.

Le texte &ldquoPour analyser la fréquence des mots-clés associés&rdquo doit se lire &ldquoPour analyser la fréquence des mots-clés associés&rdquo

Le texte de la figure 4 et de la figure 5 se chevauchent. Les auteurs doivent également indiquer comment ces figures ont été créées. Une méthode alternative pour créer de telles figures est avec Gephi (open source) compatible avec l'exportation de données à partir de R.

Nous remercions le relecteur d'avoir examiné notre manuscrit et d'avoir fourni des commentaires constructifs. Nous avons traité point par point tous les commentaires soulevés et généré une version révisée de notre manuscrit intitulée "Caracterizing Highly Cited Papers in Mass Cytometry through H-Classics", mettant en évidence les sections modifiées en utilisant la fonction &ldquoTrack Changes" dans Microsoft Word. Nous pensons que le commentaires ont contribué à améliorer la qualité de notre manuscrit.

  1. Les données du WOS ont été chargées et traitées dans R. Les données et le code R développé pour cette analyse doivent être mis à disposition avec un lien vers un référentiel persistant (i.e. DOI fourni par l'institution, Zenodo, etc.). Cela profitera grandement à l'article et à la communauté scientifique.

Réponse: Merci pour votre commentaire. Le code R n'a pas été inclus car aucun code spécifique n'a été développé ou consulté manuellement pour ce travail. Les auteurs ont utilisé l'interface graphique Biblioshiny pour représenter les informations obtenues avec bibliometrix. Cette information a été clarifiée dans la section Matériel et méthodes (2.3. Bibliometrix. Science Mapping Analysis, page 4). Nous avons également inclus la description des paramètres du réseau et des paramètres graphiques représentés dans les figures 4 et 5 (pages 13-16) des structures de connaissances (intellectuelles et conceptuelles), afin qu'elle puisse être facilement reproduite par d'autres chercheurs.

Suite à votre recommandation, nous avons inclus l'ensemble de données obtenu à partir de WoS, l'ensemble de données contenant les H-classics et le rapport de citation dans un référentiel Zenodo, au cas où il serait nécessaire que d'autres auteurs reproduisent ou étendent l'analyse. Le référentiel Zenodo a été référencé, y compris son DOI dans le &ldquo2.1. Base de données bibliographique et section Query Design&rdquo (page 3).

  1. Figure 1, les auteurs devraient envisager d'augmenter la taille de la police pour rendre le texte facilement lisible.

Réponse: Merci pour votre commentaire. La figure 1 a été modifiée en fonction des suggestions proposées par l'examinateur. La taille du corps du texte des axes, de la légende et des étiquettes a été agrandie. Afin d'améliorer la visualisation des données, les couleurs de police ainsi que l'espacement et l'épaisseur de chaque colonne ont également été modifiés.

  1. Le texte de la description de la figure 2 &ldquoLa figure 2 montre les citations moyennes par an des HCP dans le domaine de la cytométrie de masse, indiquant que le pic le plus élevé a été atteint en 2019 avec 208 citations, suivant une tendance à la hausse&rdquo peut être mieux lu &ldquoLa figure 2 montre les citations moyennes par an de HCP dans le domaine de la cytométrie de masse, restant assez constant entre 2010 et 2018, avant de connaître une forte augmentation à 208 en 2019.&rdquo

Réponse: Merci pour votre commentaire. Le texte de description de la figure 2 a été modifié en fonction des suggestions proposées par l'examinateur.

  1. Si l'index H est utilisé pour classer les auteurs dans le tableau 3, l'auteur avec 5 articles et l'index H devrait se classer n°8. De plus, les données du tableau 3 doivent également être classées à l'aide des TC(par exemple, élevé à faible pour les auteurs ayant le même indice H).

Réponse: Merci pour votre commentaire. Nous avons corrigé la position de l'auteur qui occupe désormais la position #8 dans le tableau 3, et en plus, nous avons classé les auteurs qui avaient le même H-index selon les TC, comme suggéré.

  1. Les auteurs devraient envisager d'ajouter une légende à la figure 3 pour la taille et le codage couleur des cercles.

Réponse: Merci pour ce commentaire. Les auteurs ont réécrit la légende de la figure 3, clarifiant les codes de couleur des cercles et des lignes.

  1. Le texte &ldquoPour analyser la fréquence des mots-clés associés&rdquo doit se lire &ldquoPour analyser la fréquence des mots-clés associés&rdquo

Réponse: Merci pour ce commentaire. Le texte indiqué par l'examinateur a été remplacé par la proposition.

  1. Le texte de la figure 4 et de la figure 5 se chevauchent. Les auteurs doivent également indiquer comment ces figures ont été créées. Une méthode alternative pour créer de telles figures est avec Gephi (open source) compatible avec l'exportation de données à partir de R.

Réponse: Merci pour ce commentaire. Nous avons refait les figures 4 et 5 en utilisant l'interface web Biblioshiny pour corriger le chevauchement des termes et des noms.

Je félicite les auteurs de l'article, je le trouve très intéressant. La cytométrie de masse est une nouvelle technique et un tel article, pour les lecteurs qui souhaitent se familiariser avec les articles du domaine les plus cités. Je recommande vraiment que le papier soit imprimé dans sa version actuelle.

Les auteurs remercient le relecteur pour les commentaires positifs et encourageants sur notre manuscrit. Le manuscrit a subi des modifications mineures pour tenir compte des recommandations des autres relecteurs.


Caractérisation de l'interaction entre l'ADN et le colorant fluorescent GelRed

Nous avons réalisé des expériences d'étirement d'une molécule unique et de diffusion dynamique de la lumière (DLS) pour caractériser l'interaction entre la molécule d'ADN et le colorant fluorescent GelRed. Les résultats de l'étirement d'une seule molécule montrent que la longueur de persistance des complexes ADN-GelRed augmente à mesure que la concentration de ligand augmente jusqu'à une concentration critique, puis diminue pour des concentrations plus élevées. La longueur du contour des complexes, d'autre part, augmente de façon monotone en fonction de la concentration de GelRed, suggérant que l'intercalation est le principal mécanisme de liaison. Pour caractériser la chimie physique de l'interaction, nous avons utilisé l'isotherme de liaison McGhee-von Hippel pour extraire les données physico-chimiques de l'interaction à partir des données de longueur de contour. Une telle analyse nous a permis de conclure que la coloration GelRed est, en fait, un bis-intercalateur. De plus, des expériences DLS ont été réalisées pour étudier les changements de la taille effective des complexes ADN-GelRed, mesurée en rayon hydrodynamique, en fonction de la concentration en ligand. Nous avons observé un accord qualitatif entre les résultats obtenus à partir des deux techniques en comparant le comportement du rayon hydrodynamique et du rayon de giration, car cette dernière quantité peut être exprimée en fonction des propriétés mécaniques déterminées à partir des expériences d'étirement.

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10.2 : Visualiser et caractériser l'ADN - Biologie

Tous les articles publiés par MDPI sont rendus immédiatement disponibles dans le monde entier sous une licence en libre accès. Aucune autorisation particulière n'est requise pour réutiliser tout ou partie de l'article publié par MDPI, y compris les figures et les tableaux. Pour les articles publiés sous licence Creative Common CC BY en accès libre, toute partie de l'article peut être réutilisée sans autorisation à condition que l'article original soit clairement cité.

Les articles de fond représentent la recherche la plus avancée avec un potentiel important d'impact élevé dans le domaine. Les articles de fond sont soumis sur invitation individuelle ou sur recommandation des éditeurs scientifiques et font l'objet d'un examen par les pairs avant leur publication.

L'article de fond peut être soit un article de recherche original, soit une nouvelle étude de recherche substantielle qui implique souvent plusieurs techniques ou approches, ou un article de synthèse complet avec des mises à jour concises et précises sur les derniers progrès dans le domaine qui passe systématiquement en revue les avancées les plus passionnantes dans le domaine scientifique. Littérature. Ce type d'article donne un aperçu des orientations futures de la recherche ou des applications possibles.

Les articles du Choix de l'éditeur sont basés sur les recommandations des éditeurs scientifiques des revues MDPI du monde entier. Les rédacteurs en chef sélectionnent un petit nombre d'articles récemment publiés dans la revue qui, selon eux, seront particulièrement intéressants pour les auteurs ou importants dans ce domaine. L'objectif est de fournir un aperçu de certains des travaux les plus passionnants publiés dans les différents domaines de recherche de la revue.


Données étendues Fig. 1 Schéma de synthèse et caractérisations des RSDTP.

une, Les structures et séquences oligonucléotidiques des RSDTP 17-pN, 45-pN et 56-pN. b, Schémas chimiques détaillés pour la synthèse des RSDTP. c, Traces HPLC représentatives du brin d'ADN I' modifié avec un colorant Cy3B (indiqué par un cadre rectangle en pointillés.) () Analyse des produits du dosage par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant à 10 %, piste 1 : brin I'-Cy3B piste 2 : brin I'-Cy3B-c(RGDfK) piste 3 : ADN simple brin extra-long (elssDNA, mis en évidence par un flèche noire). Notez que la bande la plus faible ci-dessus est un complexe formé d'une petite quantité d'elssDNA et du brin matrice. L'image est le représentant d'au moins trois répliques biologiques indépendantes. e, Spectres de masse d'ionisation électrospray représentatifs d'elssDNA.

Données étendues Fig. 2 Diagrammes schématiques de la composition des sondes de tension en épingle à cheveux pour l'étalonnage et la méthode expérimentale des expériences de pince magnétique à molécule unique.

une, Les géométries et compositions des sondes de force utilisées pour l'étalonnage. Toutes les sondes, combinées avec un brin complémentaire (bleu) à leur extrémité 3', ont été ligaturées à la poignée d'ADNdb modifiée par la biotine. Pour la sonde 56-pN, la séquence mise en évidence par un rectangle n'est utilisée que pour étendre toute la longueur de la sonde sans affecter de manière significative les propriétés mécaniques. b, Représentation schématique des expériences de pince à épiler magnétique à molécule unique. Les sondes sont immobilisées sur la surface de verre recouverte de streptavidine par leurs poignées d'ADN. Pour déplier la sonde, des forces de traction ont été appliquées à une bille magnétique revêtue de streptavidine par des aimants permanents. c, Mesures de stabilité mécanique pour sonde d'ADN à cisaillement réversible 56-pN. Les résultats montrent que la sonde de 56 pN ne se déplie pas même si la sonde a été exposée à un niveau de forces inférieur (30 à 44 pN) pendant plus de 10 minutes, et l'événement de dépliement n'est observé que lorsque la force appliquée dépasse 50 pN et a duré plus de dix secondes.

Données étendues Fig. 3 Caractérisation des AuNPs et RSDTPs préparation de surfaces fonctionnalisées.

un B, Images TEM représentatives des AuNPs (une) et les profils de distribution de taille correspondants (b). c, spectres UV-VIS de 5 nm AuNPs. , Procédures pas à pas pour la préparation de surfaces fonctionnalisées RSDTP (voir méthodes en ligne). e, L'image AFM représentative montrant la distribution spatiale des AuNPs immobilisées sur une lamelle de verre.

Données étendues Fig. 4 Détermination de la densité de la sonde ADN sur la surface des nanoparticules d'Au.

Pour calibrer la densité de surface du capteur de tension d'ADN, nous avons utilisé la méthode décrite par Wang et Ha et al. 23 pour tracer la relation entre les unités d'échelle de gris de fluorescence de l'échantillon (intensité moyenne) et la densité de la sonde ADN. Tout d'abord, nous avons incubé des solutions aqueuses contenant 25 nM, 12,5 nM et 6,25 nM de sonde d'ADN dépliée Cy3B (une sonde en épingle à cheveux d'ADN brouillée s'hybridant avec un brin complémentaire, la structure a été montrée dans une) sur les lamelles modifiées AuNPs pendant 30 minutes, puis lavé les sondes de déliaison et mesuré l'intensité moyenne de fluorescence du verre en fonction de la concertation d'incubation de la sonde d'ADN dépliée Cy3B (b). Il existe une relation linéaire entre l'intensité moyenne de fluorescence de la surface et la concentration d'incubation d'ADN dans cette plage de concentration (c). Par extrapolation, l'incubation de 0,05 nM de sonde d'ADN dépliée Cy3B sur la surface doit correspondre à une intensité de fluorescence moyenne de 14,4. nous avons également trouvé une densité moléculaire de 0,149 molécules/μm 2 sur la surface (0,05 nM) en utilisant une image TIRF à molécule unique (b). Pris ensemble, 96,6 unités d'intensité de fluorescence moyenne sur la surface de la sonde d'ADN dépliée Cy3B équivaut à 1 molécule/μm 2 . Étant donné que le QE moyen de la sonde d'ADN repliée Cy3B est de 98,3 % (Fig. 1 dans le texte principal), l'intensité de fluorescence moyenne de 1,6 unité sur la surface revêtue de RSDTP-Cy3B devrait être équivalente à 1 molécule/μm 2 . Nous pourrions également tracer une courbe d'étalonnage entre l'intensité et la densité moléculaire pour la surface revêtue de RSDTP (Cy3B), comme indiqué dans . Cette courbe d'étalonnage nous permet de déterminer la densité de surface RSDTP (Cy3B) en mesurant l'intensité moyenne d'une lamelle. Par exemple, la densité moléculaire de la surface revêtue de 45 pN RSDTP a été estimée à 671 molécules/μm 2 (e).

Données étendues Fig. 5 Détermination de l'efficacité d'extinction de la fluorescence (QE) des RSDTP sur une lamelle.

une, Estimer la distance entre la surface AuNP et les fluorophores sur les RSDTP à déploiement mécanique avec différentes forces de rupture en supposant une longueur de contour de 0,44 nm par nt. b, Graphiques de l'efficacité d'extinction en fonction de la distance entre le fluorophore et les AuNPs avec des diamètres de 5 nm et 10 nm sur la base du modèle NSET (note complémentaire 2). Les résultats de la simulation de l'efficacité d'extinction (QE)-distance ont suggéré que l'effet de 5 nm AuNP sur le fluorophore Cy3B au-delà d'une distance de 20 nm est négligeable. c, Diagramme schématique de la mesure de l'efficacité d'extinction de la fluorescence des RSDTP sur une surface solide. Pour imiter les états repliés et dépliés de différents RSDTP, nous hybridons des brins d'ADN complémentaires (préchauffés à 95 ° C) avec une longueur différente à une sonde en épingle à cheveux brouillée (séquences montrées dans e). Les valeurs QE sont calculées en mesurant les intensités de fluorescence avant et après l'ajout de brins complémentaires. , Un exemple de mesure QE. La valeur QE de 17-pN RSDTP a été calculée à 97,3 % en mesurant le bruit de lecture de l'EMCCD, les intensités de fluorescence de surface avant et après l'ajout de brins complémentaires. e, Tableau répertoriant les séquences de l'ADN utilisé dans ce dosage.

Données étendues Fig. 6 Des expériences de contrôle ont confirmé la fiabilité et la réversibilité des sondes de tension.

une, Comparaison des images DIC pour les cellules plaquées sur des capteurs avec et sans peptide RGD. Aucune fixation cellulaire n'a été trouvée sur la surface recouverte de capteurs dépourvus de peptide RGD, ce qui suggère que le signal de tension est spécialement généré par les interactions RGD-intégrine. b, Images DIC représentatives de cellules NIH 3T3 ensemencées sur des sondes de tension et des lamelles recouvertes de fibronectine à différents moments. c, Un RSDTP de 45 pN dépourvu de l'oligonucléotide extincteur a été utilisé pour valider davantage la stabilité et la réversibilité des sondes de tension. Les images montrent que le fond fluorescent de la surface dépourvue de l'oligonucléotide quencher est trois fois plus élevé qu'une surface avec le brin d'ADN quencher. Malgré le fond de fluorescence élevé de ces surfaces, nous pouvons toujours détecter un signal de tension lors de l'étalement cellulaire sur ces surfaces, car Au NP joue ici un deuxième quencher. Après avoir traité les cellules avec Cyto D, nous avons constaté que les signaux de tension disparaissaient immédiatement et ne laissaient aucune caractéristique sombre, qui sont souvent utilisées pour déterminer la stabilité des sondes de tension sur la surface 18 . Les profils de fluorescence le long des lignes jaunes dans les images sont également affichés dans le panneau de droite.

Données étendues Fig. 7 Confirmation supplémentaire du gradient de force au sein de l'AF et de la relation entre la longévité de l'AF et les points chauds mécaniques.

une, Représentant 17-pN (Atto647N), 56-pN (Cy3B) et les images de tension de superposition pour une seule cellule NIH/3T3 choisie parmi 2 réplicats indépendants s'étalant sur une lamelle codée avec des RSDTP multiplexés. b, Image de tension 56-pN représentative avec GFP-paxilline d'une cellule 3T3 choisie parmi 4 réplicats indépendants. Le contour de la GFP-paxilline a été recouvert d'un signal de tension. c, Images accélérées agrandies de la région encadrée en jaune dans b montrant que les structures d'adhérence supportant des forces faibles subissent un processus de démontage rapide. , Longévité des adhérences faibles et fortes. La case représente les 25e et 75e centiles, la médiane est indiquée par la ligne horizontale médiane avec la valeur moyenne est étiquetée au-dessus de chaque case et les moustaches représentent 1,5 fois l'intervalle interquartile. n = 49 pour les adhérences faibles (structures sans signal 56-pN) et n = 34 pour les adhérences fortes (structures contenant un signal 56-pN) dans la cellule de b. Bilatéral, étudiant t-test a été utilisé pour mesurer la signification statistique, et P-les valeurs sont indiquées sur le graphique.

Données étendues Fig. 8 Test de la fiabilité des RSDTP photoclivables.

une, Images représentatives du RICM et de la tension avant et après l'éclairage UV (temps = 30 s, la lumière UV fonctionne avec un éclairage périodique, densité de puissance = 1,3 × 10 -4 W/μm 2 ) pour l'ensemencement des cellules sur différentes surfaces revêtues de RSDTP photoclivables. Après clivage de la boucle des sondes, la cellule a présenté une contraction rapide sur le RSDTP photoclivable 17-pN et une contraction lente sur le RSDTP photoclivable 56-pN, suggérant que le RSDTP a été basculé vers une sonde de type TGT. Les images étaient représentatives d'au moins 2 répétitions indépendantes. b, dynamique FA de GFP-Paxillin exprimant des cellules 3T3 ensemencées sur une surface revêtue de 56-pN RSDTP, 56-pN TGT et 56-pN RSDTP photoclivable en réponse à un éclairage UV. Même condition d'éclairage que dans une ont été utilisés ici. Aucun effet significatif sur les cellules ensemencées sur les surfaces revêtues de RSDTP 56-pN et de sonde TGT 56-pN n'a été observé. Les images étaient représentatives d'au moins 3 répétitions indépendantes.

Données étendues Fig. 9 Images de la force d'intégrine indépendante de la myosine.

une, Images de tension de cellules prétraitées à la blebbistatin adhérant aux RSDTP avec différentes forces de rupture. Les cellules NIH 3T3 ont été prétraitées avec 10 M de blebbistatine pendant 30 minutes puis ensemencées sur les lamelles. Les images étaient représentatives de 3 répétitions indépendantes. b, Images de tension représentatives de 45 pN d'une cellule NIH 3T3 prétraitée Y-27632 choisie parmi 2 réplicats indépendants avant et après l'ajout de la cytochalasine D. c, Co-localisation du signal de tension d'intégrine avec GFP-Paxillin et GFP-Actin dans des cellules 3T3 traitées avec Y27632 sur une surface revêtue de 45 pN RSDTP. Des images de RICM (gris), de GFP (vert), de tension (rouge) et de canaux superposés ont été affichées. Le tracé d'analyse par balayage linéaire de la région mise en évidence par des flèches blanches en pointillés dans les images superposées montre la co-localisation de la tension avec la GFP-paxilline et la GFP-actine. Les images étaient représentatives de 3 répétitions indépendantes. , Images de tension 33-pN représentatives d'une cellule NIH 3T3 prétraitée Y-27632 choisie parmi 3 réplicats biologiques indépendants avant et après l'ajout de 100 mM de saccharose. Le panneau de droite montre le changement du signal de tension de bord mince avant et après le traitement hypertonique, n = 9 cellules.

Données étendues Fig. 10 Comptage de sous-unités d'une molécule unique des intégrines porteuses de force sur les bords minces des cellules NIH 3T3 prétraitées au Y27632.

une, Gauche, une image de tension représentative (45-pN RSDTP) d'une seule cellule vivante traitée avec Y27632 montrant des points fluorescents ponctués. A droite, des traces d'intensité représentatives, sous une excitation continue suffisante pour provoquer le blanchiment des fluorophores, à partir de quatre groupes indiqués par des flèches jaunes dans l'image de tension. Ci-dessous, histogramme et ajustement gaussien des intensités de fluorescence pour les étapes de blanchiment dans les traces (n = 39 étapes à partir de la cellule 1). b, Des données supplémentaires ont été effectuées sur deux cellules fixes et des résultats similaires ont été obtenus. (n = 38 étapes pour la cellule 2 n = 36 étapes pour la cellule 3).


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10.2 : Visualiser et caractériser l'ADN - Biologie

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Les articles du Choix de l'éditeur sont basés sur les recommandations des éditeurs scientifiques des revues MDPI du monde entier. Les rédacteurs en chef sélectionnent un petit nombre d'articles récemment publiés dans la revue qui, selon eux, seront particulièrement intéressants pour les auteurs ou importants dans ce domaine. L'objectif est de fournir un aperçu de certains des travaux les plus passionnants publiés dans les différents domaines de recherche de la revue.


Jacqueline Barlow

Une division cellulaire précise nécessite une duplication complète de l'ADN nucléaire, fournissant à la cellule fille une copie précise des informations génomiques codées. Pour une réplication fidèle, les phases d'initiation, d'élongation et de terminaison de la réplication doivent être coordonnées pour copier l'ADN nucléaire une et une seule fois par cycle cellulaire. Une réplication fidèle doit également conserver les composants épigénétiques d'ordre supérieur de la chromatine qui confèrent une régulation transcriptionnelle, une organisation tridimensionnelle et une identité cellulaire.

Des dommages à l'ADN peuvent survenir à la suite d'un stress réplicatif, un phénomène qui englobe un large éventail de conditions conduisant au blocage ou à l'effondrement de la fourche de réplication. Des défauts de réplication peuvent entraîner des dommages à l'ADN et une réparation inappropriée peut entraîner des mutations héréditaires, notamment des mutations ponctuelles, des événements de délétion ou de duplication ou des translocations chromosomiques, qui sont toutes des caractéristiques du cancer. La réplication de l'ADN commence par l'association coordonnée de plus de 100 protéines sur l'ADN à des points de départ - appelés origines - à des dizaines de milliers de sites génomiques distincts chez les mammifères. L'effondrement de la fourche de réplication entraîne une rupture double brin (DSB) dans l'ADN, ce qui nécessite des protéines impliquées dans la recombinaison homologue (HR) pour la réparation de la lésion et le redémarrage ultérieur de la fourche. En examinant le recrutement des protéines HR à l'aide de l'immunoprécipitation de la chromatine suivie d'un séquençage à haut débit (ChIP-Seq), nous avons identifié des loci génomiques associés à de multiples facteurs de réplication et de réparation de l'ADN en réponse à l'hydroxyurée toxique de réplication (HU), et avons appelé ces régions à réplication précoce. sites fragiles ou ERFS.

Le laboratoire Barlow utilise une combinaison de techniques de biologie moléculaire, de microscopie et de séquençage à l'échelle du génome pour étudier les facteurs moléculaires et génétiques qui prédisposent les cellules répliquées aux dommages à l'ADN et à l'instabilité du génome en utilisant le système immunitaire de la souris comme modèle. Les lymphocytes B activés peuvent avoir un temps de doublement aussi court que 8 heures, ce qui suggère que ces cellules à prolifération rapide sont particulièrement vulnérables au stress réplicatif et peuvent contribuer à la lymphomagenèse.

Affiliations de groupes de diplômés

  • Biochimie, biologie moléculaire, cellulaire et du développement
  • Génétique intégrative et génomique

Spécialités / Focus

  • Biologie du cancer
  • Biologie des chromosomes
  • Dynamique des chromosomes et fonction nucléaire
  • Biologie computationnelle
  • Réparation de l'ADN
  • Épigénomique
  • Génétique des organismes modèles
  • Génétique moléculaire

Cours

Honneurs et récompenses

  • 2008 Samuel W. Rover et Lewis Rover Award pour la génétique et le développement, Columbia University
  • 2013 NIH Fellows Award pour l'excellence en recherche
  • 2014 National Institutes of Health Career Development Award

Degrés

  • 2000 BA Biologie Université du riz
  • 2008 PhD Génétique et développement Columbia University

Publications

Waisertreiger I, Popovich K, Block M, Anderson KR et Barlow JH. La visualisation de l'échange de chromatides sœurs spécifiques au locus révèle des schémas différentiels de rupture de site fragile induite par le stress de réplication. Oncogène. 39(6):1260-1272. 2020.

Lopes-Contreras, AJ, Specks, J., Barlow, JH, Ambrogio, C., Desler, C., Vikinsson, S., Rodrigo-Perez, S., Green, H., Rasmussen, LJ, Murga, M. , Nussenzweig, A. et Fernandez-Capetillo, O. Une dose accrue de Rrm2 réduit la rupture du site fragile et prolonge la survie des souris mutantes ATR. Gènes Dev. 29(7):690-5. 2015.

Barlow, J. H. et Nussenzweig, A. initiation de la réplication et instabilité du génome : un carrefour pour la synthèse d'ADN et d'ARN. Cell Mol Life Sci. 71(23): 4545-59. 2014.


Adductomique : caractérisation des expositions aux électrophiles réactifs

Pour comprendre les causes environnementales des maladies, des méthodes impartiales sont nécessaires pour caractériser l'exposome humain, qui représente tous les toxiques auxquels les gens sont exposés à partir de sources exogènes et endogènes. Parce qu'ils modifient directement l'ADN et des protéines importantes, les électrophiles réactifs sont probablement les constituants les plus importants de l'exposome. Les expositions aux électrophiles réactifs peuvent être caractérisées en mesurant les adduits des réactions entre les électrophiles circulants et les nucléophiles sanguins. Nous définissons un 'adductome' comme la totalité de ces adduits avec une cible nucléophile donnée. En raison de leur plus grande abondance et temps de séjour dans le sang humain, les adduits de l'hémoglobine (Hb) et de la sérumalbumine humaine (HSA) sont préférables à ceux de l'ADN et du glutathion pour caractériser les adductomes. En effet, le hotspot nucléophile représenté par le seul groupe sulfhydryle libre dans la HSA (HSA-Cys(34)) offre des avantages particuliers pour les expériences adductomiques. Bien que les adduits ciblés de HSA-Cys(34) aient été surveillés pendant des décennies, une méthode impartiale n'a été signalée que récemment pour visualiser le «sous-adductome» de HSA-Cys(34). La méthode repose sur une nouvelle application de spectrométrie de masse, appelée surveillance de réaction sélectionnée à étape fixe (FS-SRM), pour profiler les adduits Cys(34) dans les digestions trypsiques de HSA. Ici, nous passons en revue sélectivement la littérature concernant le potentiel de l'adductomique pour élucider partiellement l'exposome humain, avec une attention particulière au sous-adductome HSA-Cys(34).

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Les figures

Niveaux d'adduits HSA d'oxyde de benzène (BO-Alb) et de 1,4-benzoquinone (1,4-BQ-Alb) par rapport à l'exposition…

Les humains sont exposés à des réactifs…

Les humains sont exposés à des électrophiles réactifs et potentiellement toxiques à la fois exogènes et…

Schéma de profilage HSA-Cys 34…

Schéma de profilage des adduits HSA-Cys 34 (Li et al., 2011). Les résines à affinité thiol sont…

Adduits HSA-Cys 34 détectés dans…

Adduits HSA-Cys 34 détectés dans les HSA archivées de sujets stratifiés par race, sexe…


10.2 : Visualiser et caractériser l'ADN - Biologie

Le cycle cellulaire est le processus par lequel nos cellules se développent et se divisent d'une manière soigneusement orchestrée et contrôlée. Un cycle cellulaire incontrôlé est une caractéristique fondamentale du cancer, dans lequel une croissance cellulaire excessive entraîne des effets indésirables au niveau des tissus et des organes. Le système Ubiquitin Proteasome (UPS) est responsable de la destruction des protéines indésirables dans la cellule, mais il a en outre été identifié comme jouant un rôle régulateur dans une myriade de processus cellulaires. Cette thèse visait à étudier le cycle cellulaire et le système ubiquitine protéasome en utilisant des approches à haut débit et à haut contenu.

La première approche visait à observer les fluctuations endogènes de l'ARNm, des protéines, des phosphorylations et de la compartimentation intracellulaire au cours du cycle cellulaire, et comment ces systèmes sont régulés et coordonnés tout au long du cycle cellulaire, décrits dans les études I et II. Outre la caractérisation des modèles d'oscillation du cycle cellulaire des transcrits, des protéines, des événements de phosphorylation et des changements de localisation subcellulaire, la dynamique entre la régulation transcriptionnelle et protéomique a été étudiée plus avant en comparant les modèles d'oscillation des paires d'ARNm et de protéines correspondantes.

La deuxième approche visait à étudier comment l'une des plus grandes familles d'enzymes du protéome humain, l'UPS, affecte le cycle cellulaire et les réponses aux dommages externes et intrinsèques de l'ADN. Cela a été fait grâce à une caractérisation phénotypique après avoir fait taire les gènes composant la famille dans une étude d'imagerie à haut contenu, l'étude III. Les résultats ont révélé que de nombreux nouveaux gènes de l'UPS sont essentiels à une progression appropriée dans le cycle cellulaire et au maintien de l'intégrité de l'ADN. En combinant plusieurs systèmes de rapporteurs dans une étude à haut contenu, des corrélations entre le cycle cellulaire, la viabilité et les phénotypes de réponse aux dommages de l'ADN pourraient être réalisées. Cela a révélé une tendance accrue aux arrêts du cycle cellulaire en phase G1/S après des signes de dommages spontanés à l'ADN, et un enrichissement pour les arrêts du cycle cellulaire G2 après l'échec du recrutement de 53 pb1 aux cassures double brin.

En plus de fournir des ressources de données et des résultats de biologie du système concernant l'interaction entre différents processus cellulaires, les études ont également identifié des gènes et des protéines spécifiques dans de nouveaux rôles concernant ces processus cellulaires de base. Dans l'étude II, il a été découvert que la protéine méthyl-transférase MAT2A modifiait la localisation subcellulaire en synchronisation avec le cycle cellulaire, ce qui permettait de fournir la source la plus élevée de groupes méthyle nécessaire pendant les phases S et G2. Dans l'étude IV, les ligases ubiquitine E3 ARIH1 et ARIH2 ont été étudiées pour leurs effets sur la prolifération et la croissance du glioblastome multiforme. L'étude III à haut contenu a identifié de nombreux nouveaux gènes UPS avec une myriade de phénotypes de cycle cellulaire et de dommages à l'ADN, parmi lesquels l'adaptateur d'ubiquitine E3 BTBD1. L'extinction de BTBD1 a entraîné des phénotypes dramatiques sur le cycle cellulaire et les réponses aux dommages à l'ADN, et BTBD1 a été davantage caractérisé et identifié comme essentiel au bon fonctionnement de l'ADN topoisomérase TOP1.

Tout au long de ces projets, afin de valider de nouvelles découvertes, des méthodes de contrôle des niveaux d'expression de gènes spécifiques ont été développées, en utilisant shRNA et le silençage médié par CRISPR/Cas9 ainsi qu'une méthode flexible de surexpression. Ces systèmes sont décrits dans l'étude IV.

Les études présentées combinent des approches à haut contenu et à haut débit avec de nouvelles méthodes de visualisation et d'analyse pour distiller des informations à partir de données complexes, à la fois pour résumer les interactions entre l'ARNm, les protéines et la fonction, mais aussi pour identifier de nouveaux régulateurs des processus cellulaires basaux.


Voir la vidéo: Biologie - Quest-ce que lADN DNA in English (Juin 2022).


Commentaires:

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