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Comment la mutagenèse par PCR ajoute-t-elle un site de restriction à proximité du gène d'intérêt ?

Comment la mutagenèse par PCR ajoute-t-elle un site de restriction à proximité du gène d'intérêt ?


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J'ai appris la mutagenèse par PCR pour ajouter un site de restriction juste à côté du gène d'intérêt à l'aide d'une amorce attachée avec un site de restriction simple brin (première image). J'ai dessiné mon propre schéma (deuxième image) pour mieux comprendre comment cela fonctionne, mais je suis bloqué à la dernière étape en point d'interrogation. Comment l'ADN polymérase « insère » la séquence verte (site de restriction) pour que je me retrouve avec le gène indiqué en bas ?

Merci pour la réponse anticipée.

[![entrez la description de l'image ici][3]][3]


Ce diagramme serait plus facile à conceptualiser si vous utilisiez plutôt les nucléotides réels dans les sites de restriction et la région verte GGAGAA avec votre gène d'intérêt (GOI). Je recommande de travailler avec les séquences d'ADN lors de l'apprentissage de la conception d'amorces pour diverses applications. Je pense que cela vous a amené à être légèrement confus avec ce qu'est le site de restriction et ce qui n'est pas dans ce diagramme, donc je vais le parcourir.

À la première étape illustrée, vous avez votre région d'hybridation des amorces directe et inverse se liant au GOI. La région en surplomb de chaque amorce contient vos sites de restriction, qui sont flanqués de la région GGAGAA pour que ces enzymes de restriction aient une séquence à "saisir" lorsque vous effectuez une digestion par enzyme de restriction. Notez que la région d'hybridation de votre amorce s'hybride au GOI car elle présente une homologie avec la séquence d'ADN. Vos sites de restriction et votre région de « clampage » verte n'ont pas d'homologie avec votre matrice d'ADN, ils sont donc considérés comme les régions en surplomb. Il est important que vos régions d'hybridation des deux amorces aient des températures d'hybridation similaires lors de la conception, sinon vous risquez de ne pas avoir une réaction PCR efficace. J'utilise généralement cet outil de NEB pour concevoir des régions de recuit de mes amorces. https://tmcalculator.neb.com/#!/main

À l'avenir, ces amorces seront toutes deux utilisées dans une réaction PCR, et non séparément. Ainsi, lorsque la réaction commence, la matrice d'ADN double brin se dénature, donnant à vos amorces directes et inverses la possibilité de s'hybrider pendant la phase d'hybridation d'une réaction PCR. Pendant la phase d'élongation, votre ADN polymérase ajoutera des nucléotides complémentaires dans la direction 3' de vos amorces. Maintenant, après le premier cycle, vous avez deux produits différents. Le produit de l'amorce directe a le GOI avec un surplomb BamHI simple brin à l'extrémité 5', tandis que le produit de l'amorce inverse a le GOI avec un surplomb NotI simple brin à l'extrémité 5'.

Au cours du deuxième cycle, après dénaturation, l'amorce inverse avec un surplomb NotI s'hybride au produit précédent de l'amorce directe avec un surplomb BamHI. L'ADN polymérase ajoute ensuite des nucléotides dans la direction 3' de l'amorce, ajoutant éventuellement des bases complémentaires au surplomb BamHI. La même chose est faite vice versa avec l'amorce directe et le produit précédent de l'amorce inverse.

Maintenant, après le deuxième cycle, vous avez les produits souhaités qui seront amplifiés de façon exponentielle. Votre GOI flanqué des sites de restriction NotI et BamHI avec la région GGAGAA des deux côtés. Ce produit est prêt pour une digestion par enzyme de restriction.


J'aime ta silhouette dessinée à la main. Je vais faire une explication en images à partir de ça. Vous avez raison dans la liaison de l'amorce et la première étape de l'étape de PCR. Mais PCR1 et PCR2 et le produit final est faux.

C'est ainsi que vous voyez les choses - A chaque étape, les amorces se lient aux produits étendus dans les étapes précédentes (+ ADN matrice d'origine, qui est minuscule en comparaison après quelques cycles). Les queues des amorces, qui ne se lient pas à l'ADN matrice d'origine, sont incorporées pendant l'extension à partir de l'autre amorce.


Systématique moléculaire végétale

Analyse des sites de restriction (RFLP)

Un site de restriction est une séquence d'environ 6 à 8 paires de bases d'ADN qui se lie à une enzyme de restriction donnée. Ces enzymes de restriction, qui sont nombreuses, ont été isolées à partir de bactéries. Leur fonction naturelle est d'inactiver les virus envahisseurs en clivant l'ADN viral. Les enzymes de restriction connues sous le nom de type II reconnaissent les sites de restriction et clivent l'ADN à des emplacements particuliers à l'intérieur ou à proximité du site de restriction. Un exemple est l'enzyme de restriction ÉcoRI (nommé d'après E. coli, à partir de laquelle il a été isolé pour la première fois), qui reconnaît la séquence d'ADN vue sur la figure 14.8 et clive l'ADN aux sites indiqués par les flèches sur cette figure.

FIGURE 14.8 . Un site de restriction d'ADN, clivé (au niveau des flèches) par l'enzyme du site de restriction ÉcoRI.

Polymorphisme de longueur des fragments de restriction, ou RFLP, fait référence aux différences entre les taxons dans les sites de restriction, et donc les longueurs des fragments d'ADN après clivage avec des enzymes de restriction. Par exemple, la figure 14.9 montre, pour deux espèces hypothétiques, des longueurs d'ADN amplifiées de 10 000 paires de bases qui sont soumises à (« digéré avec ») l'enzyme de restriction ÉcoRI. Remarque, après une réaction avec le Écoenzyme RI, que l'ADN des espèces UNE est clivé en trois fragments, correspondant à deux Écosites de restriction RI, alors que celui des espèces B est clivé en quatre fragments, correspondant à trois ÉcoSites de restriction RI. Les emplacements relatifs de ces sites de restriction sur l'ADN peuvent être cartographiés. Une possibilité est visible au bas de la figure 14.9. (Notez qu'il existe d'autres possibilités pour cette cartographie précise de la carte nécessite un travail supplémentaire.) Des enzymes de restriction supplémentaires peuvent être utilisées. La figure 14.10 illustre comment chacun des fragments d'ADN de la ÉcoLes produits de digestion RI peuvent être digérés avec l'enzyme de restriction BAM HI, donnant des fragments différents pour les deux espèces. Ces données peuvent être ajoutées à l'original lors de la préparation d'une carte (une carte possible est illustrée dans la partie inférieure de la figure 14.10).

FIGURE 14.9 . Exemple d'analyse du site de restriction des espèces A et B, utilisant l'enzyme du site de restriction ÉcoRI. Notez les différences dans la longueur des fragments. Les cartes possibles des sites de restriction des espèces A et B sont présentées dans la partie inférieure de la figure.

FIGURE 14.10 . Exemple d'analyse du site de restriction des espèces A et B, utilisant l'enzyme du site de restriction ÉcoRI, suivi de l'enzyme du site de restriction BAM HI. Les cartes des sites de restriction possibles des espèces A et B sont présentées dans la partie inférieure de la figure.

Les données de fragments de site de restriction peuvent être codées en tant que caractères et états de caractère dans une analyse phylogénétique. Par exemple, étant donné que les cartes des sites de restriction de la figure 14.10 sont correctes, la présence ou l'absence de ces sites peut être codée sous forme de caractères, comme le montre la figure 14.11. L'analyse des sites de restriction contient beaucoup moins de données que le séquençage complet de l'ADN, ne prenant en compte que la présence ou l'absence de sites de 6 à 8 paires de bases de long. Il a cependant l'avantage d'étudier des segments d'ADN considérablement plus grands. Cependant, avec des techniques de séquençage améliorées et moins coûteuses, il est moins précieux et moins souvent utilisé que par le passé.

ILLUSTRATION 14.11. Codage de caractères des données de carte de site de restriction de la figure 14.10 , dérivé par la présence ou l' absence de ÉcoSites RI ou BAM à des emplacements spécifiques le long de l'ADN.


Fond

La manipulation de molécules d'ADN recombinant est une étape indispensable dans les études modernes de cristallisation des protéines à haut débit [1]. Le clonage par enzyme de restriction/ligase, qui repose sur la digestion et la ligature des enzymes de restriction, est un moyen simple et facile de déplacer un fragment d'ADN double brin d'un plasmide à un autre [2]. Cependant, cette technique présente deux limites [3] : elle est inefficace en l'absence de sites de restriction uniques et entraîne parfois l'introduction de séquences supplémentaires indésirables. Pour contourner ces limitations, diverses méthodes de clonage indépendantes du site de clivage des endonucléases de restriction ont récemment été développées [4-21]. Ces méthodes ont rendu le clonage plus accessible dans les cas où le clonage conventionnel des sites de restriction était difficile ou impossible. Alors que des stratégies de clonage alternatives sont toujours nécessaires pour plus de choix.

La stratégie de clonage sans restriction (RF), telle que décrite abondamment dans la littérature, a été développée comme un outil puissant pour reconstituer des gènes dans des vecteurs circulaires [3, 22]. Étant donné que le clonage RF ne nécessite aucune modification du plasmide ou du gène d'intérêt, il est exceptionnellement bien adapté au clonage à haut débit. Le gène d'intérêt est amplifié dans une réaction en chaîne par polymérase (PCR) régulière, qui produit une paire d'amorces qui, une fois hybridée au vecteur d'intérêt, est étendue dans une réaction d'amplification linéaire. Ainsi, cette méthode repose sur des gènes amplifiés fonctionnant comme des amorces. Cependant, cette approche a aussi des limites. Premièrement, le mouvement de gros fragments d'ADN et la formation de structures secondaires affecteront l'efficacité de la PCR. Deuxièmement, cette méthode repose sur la digestion avec DpnI, qui clive l'ADN méthylé, pour éliminer les plasmides parentaux. L'efficacité de DpnLe traitement I est influencé par de nombreux facteurs, et nécessite une propagation vectorielle dans les souches Dam + [23].

Dans cet article, nous décrivons une méthode simple et rapide pour effectuer la reconstitution des gènes par clonage modifié sans restriction (MRF). Dans cette méthode, deux tours de PCR génèrent deux fragments d'ADN avec des extrémités cohésives 5' ou 3' compatibles, qui sont donc capables de se ligaturer l'un à l'autre. Cette nouvelle méthode est indépendante de l'existence de sites de restrictions et DpnJe traitement. En utilisant cette méthode, nous avons réalisé 46 constructions avec des inserts de taille variable, avec une efficacité de clonage moyenne supérieure à 85%. L'efficacité n'a pas été affectée de manière significative par la longueur de l'insert jusqu'à 20 kb.


Mutagenèse dirigée sur site

La mutagenèse dirigée (SDM) est une méthode pour créer des changements spécifiques et ciblés dans l'ADN plasmidique double brin. Il existe de nombreuses raisons d'apporter des modifications spécifiques à l'ADN (insertions, suppressions et substitutions), notamment :

  • Étudier les changements dans l'activité des protéines qui se produisent à la suite de la manipulation de l'ADN.
  • Pour sélectionner ou cribler des mutations (au niveau de l'ADN, de l'ARN ou de la protéine) qui ont une propriété souhaitée
  • Pour introduire ou supprimer des sites ou des marqueurs d'endonucléases de restriction


Présentation de la méthode :

SDM est un in vitro procédure qui utilise des amorces oligonucléotidiques conçues sur mesure pour conférer une mutation souhaitée dans un plasmide d'ADN double brin. Auparavant, une méthode mise au point par Kunkel (Kunkel, 1985) qui tire parti d'une souche déficiente en dUTPase et en uracile déglycosylase afin que le receveur E. coli dégrade l'ADN de type sauvage contenant de l'uracile a été largement utilisé. Actuellement, il existe un certain nombre de kits disponibles dans le commerce qui nécessitent également une modification spécifique et/ou unique E. coli (par exemple, le Phusion Site-Directed Mutagenesis ® de Thermo et le système GeneArt ® de Life). Les méthodes les plus utilisées ne nécessitent aucune modification ni souche unique et incorporent des mutations dans le plasmide par PCR inverse avec des amorces standards. Pour ces méthodes, les amorces peuvent être conçues dans un chevauchement (QuikChange & reg, Agilent) ou une orientation dos à dos (Q5 & reg Kit de mutagenèse dirigée vers le site) (Figure 1). Le chevauchement de la conception des amorces donne un produit qui se recircularise pour former un plasmide à double entaille. Malgré la présence de ces entailles, ce produit circulaire peut être directement transformé en E. coli, bien qu'avec une efficacité inférieure à celle des plasmides non coupés. Les méthodes de conception d'amorces dos à dos ont non seulement l'avantage de transformer des plasmides non coupés, mais permettent également une amplification exponentielle pour générer beaucoup plus du produit souhaité (figure 2). De plus, comme les amorces ne se chevauchent pas, les tailles de délétions ne sont limitées que par le plasmide et les insertions ne sont limitées que par les contraintes de la synthèse d'amorces moderne. Actuellement, en divisant l'insertion entre les deux amorces, des insertions jusqu'à 100 pb peuvent être créées en routine en une seule étape en utilisant cette méthode.

Avant que les amorces ne soient conçues, il est important de déterminer quel flux de mutagenèse doit être utilisé. Nous présentons ici une comparaison de trois kits disponibles dans le commerce (Figure 3) et une brève description des caractéristiques importantes.

Avant de planifier votre prochaine expérience SDM, assurez-vous de lire notre liste de considérations expérimentales importantes.

Figure 1 : La mutagenèse spécifique au site se déroule en moins de 2 heures

L'utilisation d'un mélange maître, d'un mélange d'enzymes KLD multi-enzymes unique et d'une polymérase rapide garantit que, pour la plupart des plasmides, la réaction de mutagenèse est terminée en moins de deux heures.

Figure 2 : Présentation du kit de mutagenèse dirigée Q5

Ce kit est conçu pour une incorporation rapide et efficace d'insertions, de délétions et de substitutions dans l'ADN plasmidique double brin. La première étape est une amplification exponentielle à l'aide d'amorces standard et d'une formulation de master mix d'ADN polymérase haute fidélité Q5 Hot Start. La deuxième étape implique l'incubation avec un mélange d'enzymes unique contenant une kinase, une ligase et DpnI. Ensemble, ces enzymes permettent une circularisation rapide du produit PCR et l'élimination de l'ADN matrice. La dernière étape est une transformation à haute efficacité en cellules chimiquement compétentes (fournies).

Figure 3 : Conception d'amorce pour le kit de mutagenèse dirigée Q5

Les substitutions, délétions et insertions sont incorporées dans l'ADN plasmidique grâce à l'utilisation d'amorces sens (noir) et inverse (rouge) spécialement conçues. Contrairement aux kits qui reposent sur l'amplification linéaire, les amorces conçues pour le kit de mutagenèse dirigée Q5 ne doivent pas se chevaucher pour garantir que les avantages de l'amplification exponentielle sont réalisés. A) Les substitutions sont créées en incorporant le(s) changement(s) nucléotidique(s) souhaité(s) (indiqués par *) au centre de l'amorce directe, y compris au moins 10 nucléotides complémentaires du côté 3´ de la ou des mutations. L'amorce inverse est conçue de sorte que les extrémités 5´ des deux amorces s'hybrident dos à dos. B) Les suppressions sont conçues en concevant des amorces directes et inverses standard non mutagènes qui flanquent la région à supprimer. C) Des insertions inférieures ou égales à 6 nucléotides sont incorporées à l'extrémité 5´ de l'amorce directe tandis que l'amorce inverse s'hybride dos à dos avec l'extrémité 5´ de la région complémentaire de l'amorce directe. D) Des insertions plus grandes peuvent être créées en incorporant la moitié de l'insertion souhaitée dans les extrémités 5´ des deux amorces. La taille maximale de l'insertion est largement dictée par les limitations de la synthèse des oligonucléotides.

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Techniques de laboratoire de biologie moléculaire : cartographie génétique

1. Si j'ai un gène particulier qui m'intéresse et que j'en sais quelque chose, je peux physiquement regarder le génome étalé et identifier le gène d'intérêt à l'aide d'un marqueur fluorescent qui se liera à cette séquence. Cela peut identifier quel chromosome et quelle position (une position approximative) sur un chromosome dans lequel se trouve ce gène. Cela n'arrive pas si souvent pour deux raisons : vous travaillez avec un génome qui a déjà été séquencé ou vous ne génome donc vous ne connaissez pas les marqueurs et ne savez pas quel chromosome est lequel. Cette méthode devient de moins en moins courante à mesure que de plus en plus de génomes sont séquencés. Il est encore utilisé pour des génomes qui commencent tout juste à être travaillés et à peine compris → Marquage génique par F.I.S.H.

2. Autres marqueurs génétiques→ ex : couleur des yeux, présence de taches de rousseur, etc. Nous pouvons utiliser tous les marqueurs génétiques connus et déterminer s'ils sont proches de notre gène d'intérêt en recherchant la co-ségrégation. Les marqueurs génétiques peuvent être visibles mais peuvent aussi être des altérations des génomes → Polymorphismes !

-le marqueur et la mutation étant liés signifie que la plupart du temps, lorsque la descendance porte la mutation, elle possède la version originale du marqueur que possède le parent porteur de la mutation.

-Recherchez la co-ségrégation du marqueur avec le phénotype dans la descendance des croisements → une fois que vous avez trouvé les individus qui ont la co-ségrégation, vous pouvez alors déterminer si le marqueur et la mutation sont liés

-repeats→ il y aura un espace entre deux séquences connues. Le nombre de répétitions entre cette séquence déterminera la longueur du produit lorsque vous effectuez une PCR. Si vous avez 20 contre 25 copies de cette répétition de 3 bases, cela donnera des produits de tailles différentes

-Amorces PCR→ S'il y a une mutation dans une région où vous développerez une amorce PCR, la PCR ne fonctionnera pas ou elle donnera un produit différent

**En fin de compte, en utilisant des polymorphismes pour cartographier les gènes, vous testerez généralement quel marqueur est présent chez un individu en exécutant les produits sur un gel. Les différences dans les sites de restriction, le nombre de répétitions et les amorces PCR produiront des bandes de tailles différentes

-nous examinons beaucoup de descendance et déterminons à quelle fréquence la recombinaison se produit entre le marqueur et la mutation

-moins la recombinaison se produit, plus la distance physique va être proche sur le chromosome.

-si RF est inférieur à 50%, alors les gènes sont liés. Si RF est égal à 50%, alors les gènes ne sont pas liés

Imaginez qu'il y ait deux parents : un parent mutant et le parent de type sauvage. Lorsque ceux-ci sont croisés, ils produisent la génération F1. Si l'accouplement est normal, la génération F1 sera hétérozygote en position marqueur. Le marqueur de chaque parent est un polymorphisme différent. La mutation est le X sur le chromosome.
Permettre à la F1 de s'autoféconder ou de se croiser (prendre deux F1 différentes et les croiser). Cela permettra à la recombinaison de se produire pendant la méiose. Dans le F2, une partie de la descendance aura le phénotype parental. Vous pouvez obtenir une recombinaison qui provoquera un mélange et une correspondance sur les chromosomes.

Vous pouvez obtenir un F2 complètement hétérozygote comme le F1 (avoir les deux marqueurs et un seul chromosome a le phénotype mutant).

Options de recombinaison :
1. Vous pouvez obtenir une recombinaison là où le fabricant du parent de type sauvage a la mutation (maintenant cet individu sera homozygote pour la mutation même si les deux marqueurs différents sont présents). Cet individu est homozygote pour la mutation mais hétérozygote pour le marqueur.
2. La recombinaison peut entraîner une perte totale du gène mutant.Donc ces chromosomes auront des marqueurs différents mais aucun d'eux n'aura la mutation

Le chevauchement des cosmides peut aider à éliminer des morceaux d'ADN. Si le sauvetage se produit dans deux cosmides avec des régions qui se chevauchent, alors nous savons que le gène doit se trouver dans la région qui se chevauche.

-il peut y avoir quelques mutations indépendantes qui causent le même phénotype
-nous pouvons faire de la mutagenèse pour trouver combien de mutations produisent ce phénotype.
-nous pouvons ensuite effectuer un test de complémentation avec ces mutations (croiser les différents mutants) pour déterminer si les mutations sont sur les mêmes loci
-si nous trouvons plusieurs allèles du même locus, alors la bonne copie du gène devrait être capable de sauver n'importe lequel de ces allèles

-première version des marqueurs polymorphes
-il s'agit d'un polymorphisme correspondant à des différences de longueurs de fragments de restriction car l'une des mutations a créé un site de restriction à partir d'un site de non-restriction ou a perdu un site de restriction en raison d'une mutation dans ce site
-L'ADN est restreint, puis un Southern blot détermine quel(s) allèle(s) parental(s) est présent → le Southern blot est effectué pour déterminer quel morceau d'ADN provient de quel parent

-le problème avec les RFLP est que vous devez avoir des mutations dans les sites de restriction qui sont pratiques. Ces sites sont vraiment difficiles à trouver au départ. Les RFLP sont également rares et difficiles à isoler (trouver) de nouveaux

-Au lieu de digérer le génome entier, une région autour du site de restriction polymorphe est d'abord amplifiée, puis clivée → au lieu de découper tout le génome, de faire un Southern blot et de rechercher un fragment particulier de tailles différentes selon la présence de une mutation, vous pouvez faire une PCR (l'amplification indique une PCR) et exécuter un gel. Vous pouvez regarder le gel et voir combien de bandes ont été produites (par exemple, une bande près du haut du gel ou deux bandes plus petites près du bas du gel qui correspondent à une version coupée de ce morceau plus long).

-il y a des amorces autour du site de restriction. Ces amorces amplifieront ces fragments, puis vous les couperez avec une enzyme. Si le site de restriction est présent (ex : la copie maternelle de l'allèle était la copie normale avec le site de restriction intact et le paternel avait la mutation et n'a plus le site), l'enzyme coupera ce fragment amplifié et deux bandes seront visibles sur le gel. Si le site de restriction n'est pas présent (version mutée du père), l'enzyme ne coupera pas, donc le fragment amplifié sera beaucoup plus long. Vous pouvez regarder sur le gel de la descendance et trouver ce marqueur individuel et demander s'il est lié au gène en déterminant de quel parent le marqueur provient (le marqueur vient-il du parent qui avait à l'origine la mutation ou est-il issu d'une recombinaison ?).

-CAPS s'est avéré être un énorme avantage par rapport aux RLFP, mais il y a toujours des problèmes avec CAPS

-le problème est qu'il y a relativement peu de sites de restriction qui seront modifiés de telle sorte qu'ils soient polymorphes entre les deux parents

-Au lieu de dépendre des sites de restriction, utilisez de courtes séquences répétées appelées Microsatellites → ce type de polymorphisme ne dépend pas du type de mutation du site de restriction, mais se concentre sur la différence de séquences répétées (ex : une copie peut avoir 40 copies et une autre a 47). Lorsque l'on regarde la descendance, il est possible de dire, sur la base de la longueur des séquences répétées entre deux amorces PCR, si la taille correspond à l'ADN qui provient du père, de la mère ou des deux (hétérozygote). Donc, en fonction de la taille des produits de la PCR, vous pouvez dire s'il y a eu co-ségrégation

-Les SSLP se trouvent partout dans le génome et sont faciles à identifier car vous pouvez prendre la séquence répétée et créer une bibliothèque génomique. Vous pouvez le sonder avec la séquence du microsatellite (séquence courte répétée) et la sonde se liera aux deux SSLP différents. Ensuite, vous pouvez séquencer la région juste à l'extérieur du microsatellite. Lorsque vous faites cela, vous pouvez identifier ces séquences individuelles. Vous pouvez amplifier les microsatellites maternel et paternel avec la même amorce et déterminer combien de copies de la répétition sont présentes.

-utilisé pour trouver de nombreux marqueurs dans un génome inconnu ou un génome avec peu de marqueurs connus → Dans ce cas, ce que vous faites est de permettre la possibilité de trouver des marqueurs individuels dans tout le génome sans aucune connaissance de la séquence.

Comment cela fonctionne :
Vous prenez un génome et ajoutez des adaptateurs de séquence connue aux sites de restriction. Couper avec des enzymes de restriction (ex : BamHI et EcoRI), produira différents fragments qui se trouvent entre ces sites de restriction (ex : les sites EcoRI et BamHI). Vous ajoutez les adaptateurs, qui ont une séquence connue, et vous pouvez maintenant amplifier ces fragments à l'aide de la PCR. Vous n'amplifiez pas seulement un fragment, vous amplifiez tous les fragments qui ont été créés à partir du condensé de restriction. Vous obtenez donc tous ces différents fragments. Comme les fragments sont séparés sur un gel de séquençage, les AFLP présentent des tailles différentes.

-Des centaines ou des milliers de SNP dispersés dans tout le génome → il existe de nombreuses mutations ponctuelles individuelles (polymorphismes) entre deux individus

Vous basez la position du gène que vous souhaitez trouver en fonction de sa position par rapport aux autres marqueurs du génome sans nécessairement connaître la position exacte dans le génome.

Marqueur physique :
Avec un marqueur physique, la position exacte est connue (ex : ce marqueur se situe à 45 327 bases du télomère court du chromosome 5). Un marqueur physique est une position exacte dans le génome.

Vous pouvez utiliser une combinaison de marqueurs génétiques pour vous rapprocher d'une position, puis des marqueurs physiques où vous pouvez réellement mesurer la distance entre les bases.

Un marqueur physique est beaucoup plus utile qu'un marqueur génétique pour comprendre exactement où se trouve le gène, mais il est très difficile d'utiliser des marqueurs physiques tant que vous n'avez pas utilisé des techniques génétiques pour déterminer approximativement où se trouve le gène.

Il y a des morceaux d'ADN, un de chaque parent. Un ADN parent a 3 sites de restriction pour une enzyme de restriction (ex: EcoRI) et l'autre parent a une mutation qui fait que l'un des sites (le site du milieu) est différent, donc ce n'est plus un site de restriction. Il manque maintenant un site de restriction à ce parent, il n'a donc que 2 sites de restriction. Vous faites une digestion de restriction et exécutez le produit sur un gel. Vous faites un Southern blot et utilisez une sonde qui couvre toute cette région de l'ADN. Lorsque vous faites le Southern blot, la sonde va récupérer les deux fragments produits par le parent de type sauvage mais ne va pas récupérer le fragment produit par le parent avec la mutation (la mutation est une séquence différente qui a causé la perte du site de restriction. Parce que la séquence est différente, la sonde ne s'y liera pas).
La plus grande bande correspond en taille à l'addition des deux plus petites bandes.

Le polymorphisme entre ces deux parents à ce locus marqueur permet de l'utiliser comme marqueur potentiel de fréquence de recombinaison pour déterminer où se trouve approximativement la mutation d'intérêt. En conséquence, nous pouvons prendre cela et faire des RFLP où nous pouvons identifier différents allèles. Si la mutation co-ségrége systématiquement avec un allèle particulier, nous pouvons dire approximativement que la mutation qui nous intéresse est associée à ce RLFP particulier.

-vous pouvez trouver des différences de paires de bases individuelles entre les individus
-il s'agit de découper l'ADN, mais en utilisant une méthode qui ne va couper que si une séquence particulière est présente
-c'est une méthode chimique par opposition à une méthode d'enzyme de restriction pour couper cet ADN.
-vous avez deux morceaux d'ADN différents (un normal et un mutant). Vous les mélangez, ce qui créera un décalage. Ce décalage va créer une bulle dans l'ADN. Cela permet une modification par l'hydroxylamine ou le tétroxyde d'osmium (traiter avec de l'hydroxylamine ou du tétroxyde d'osmium pour modifier le mésappariement). Cela modifiera tout C ou T qui ne correspond pas au brin opposé. Une fois celui-ci modifié, vous pouvez traiter avec de la pipéridine, un produit chimique qui coupera les C et les T modifiés. Après la pipéridine, vous mettez l'ADN dans un gel dénaturant et l'électrophorèse. L'ADN avec le mésappariement produira au moins 2 bandes et l'ADN normal sans mésappariement produira un seul fragment.

Donc, s'il y a un décalage, vous obtiendrez une bande de taille différente parce que vous auriez coupé l'extrémité de cet ADN. S'il n'y a pas de mésappariement, il n'y aura pas de modification par l'hydroxylamine et alors pas de coupure par la pipéridine et le fragment de taille normale qui est attendu serait produit.
Vous voyez donc une différence selon qu'il y a eu un décalage entre l'ADN normal et l'ADN potentiellement mutant.

Pour la PCR, vous devez avoir une correspondance exacte entre l'amorce et le modèle, en particulier à l'extrémité 3' de l'amorce (car l'extrémité 3' doit être posée sur le modèle pour que la polymérase entre et commence à ajouter des bases ).

La PCR multiplex vous permet de déterminer que vous avez un allèle par rapport à un autre et vous indique s'il y a un hétérozygote.

Imaginez que vous avez un morceau d'ADN qui a deux allèles différents : l'allèle 1 et l'allèle 2. L'allèle 1 a un G à une position et un C en face du G. L'allèle 2 a un A à la même position et un T en face du A Vous mettez donc 2 amorces, appelées amorces externes, une qui correspond à la séquence en amont et une en aval de la mutation. Ensuite, vous ajoutez deux autres amorces. L'une des amorces (amorce A) aura à son extrémité 3' la base qui correspond au G/C et l'autre amorce (amorce B) correspondra si la séquence a un A/T.
Si la séquence a A/T (allèle 2), alors l'amorce B se liera, mais l'amorce A ne pourra pas se lier et ne produira pas de produit. Si la séquence a G/C (allèle 1), alors l'amorce A se liera mais l'amorce B ne produira pas de produit.

Si vous exécutez une PCR avec les 4 amorces, les produits des réactions PCR auront des tailles différentes.

L'allèle 1, l'allèle 2 et les hétérozygotes produiront tous le grand fragment car l'allèle 1 et l'allèle 2 ont les amorces externes liées à la matrice.

Pour l'allèle 1, il existe deux amorces directes qui interagiront toutes deux avec l'amorce inverse pour produire deux produits PCR de tailles différentes. Pour l'allèle 2, il existe deux amorces inverses.

L'allèle 1 (a le G/C) lie l'amorce A. Ainsi, l'allèle 1 produira un produit plus court qui représente le fragment entre l'amorce A et l'amorce externe. Ce fragment de taille sera manquant dans la piste de gel pour l'allèle 2 car l'amorce A ne se lie pas à l'allèle 2.

L'allèle 2 (a l'A/T) ne produira pas la plus petite bande qui est faite dans l'allèle 1 (à partir de l'amorce A et de l'amorce extérieure) car il ne lie pas l'amorce A. L'allèle 2 produira la plus grande bande et une bande de taille moyenne qui représente la distance entre l'amorce B et l'amorce extérieure.

Dans le cas de l'AFLP, vous regardez des fragments qui ont été coupés de l'ADN, mais les fragments proviennent du génome entier. Avec AFLP, vous utilisez un gel de séquençage et essayez de rechercher des endroits où il y a des bandes présentes dans une lignée parentale et pas dans l'autre. Les endroits où il y a une bande présente dans l'une des lignées parentales mais pas dans l'autre indiquent des polymorphismes.

Les bandes ont été créées en découpant le génome avec des enzymes de restriction, en mettant les adaptateurs à la fin qui ont une séquence connue et une région simple brin qui leur permet de se lier à ce avec quoi le génome a été coupé (ex : si le génome a été coupé avec BamHI et EcoRI, vous aurez ces deux adaptateurs - l'un qui correspond à BamHI et l'autre qui correspond à EcoRI), puis vous effectuez une PCR en utilisant la séquence qui se trouve dans ces adaptateurs pour les amorces.

Vous ne savez pas d'où vient l'une des bandes (sur quel chromosome elle se trouve), vous savez seulement si un polymorphisme y est présent ou non.

Vous pouvez regarder la descendance pour déterminer laquelle correspond à la lignée paternelle ou maternelle. Si la descendance montre une liaison à une lignée par rapport à l'autre, alors vous pouvez déterminer s'il y a une liaison entre le marqueur et le gène (ex : si la lignée paternelle a la mutation et que la plupart des descendances avec la mutation ont la lignée paternelle de l'AFLP, alors on peut dire que la mutation et l'AFLP sont liées)

Vous pouvez prendre ces informations, couper les bandes du gel, les cloner et les séquencer pour trouver plusieurs marqueurs dans un gel


Méthylation

La PCR peut être utilisée pour étudier la méthylation spécifique au locus. Dans une méthode appelée PCR spécifique à la méthylation(MSP), deux paires d'amorces sont conçues pour différencier l'état de méthylation du locus d'intérêt [7,8].

Dans le MSP, les échantillons d'ADN sont d'abord traités avec du bisulfite pour convertir la cytosine non méthylée (C) en uracile (U). La cytosine méthylée ( m5 C) n'est pas affectée par le traitement au bisulfite. Pour détecter les sites méthylés, une paire d'amorces est conçue avec de la guanine (G) pour s'apparier avec m5 C dans la séquence cible pour détecter les sites non méthylés, une autre paire d'amorces est conçue avec de l'adénine (A) pour s'apparier avec U dans le bisulfite -molécules converties (puis s'apparier avec la thymine (T) dans les cycles de PCR suivants). Une amplification PCR positive résultant de la liaison à l'amorce est utilisée pour déterminer l'état de méthylation du locus (Figure 7). (En savoir plus sur l'analyse de la méthylation par les enzymes de restriction.)

Figure 7. PCR spécifique à la méthylation. Dans la première étape, les échantillons d'ADN sont traités avec du bisulfite pour convertir la cytosine non méthylée en uracile. Deux ensembles d'amorces PCR (méthylation et non-méthylation) sont conçus pour différencier l'état de méthylation d'un locus en fonction de l'amplification de l'ADN traité au bisulfite. L'ADN non méthylé est présent sous forme de brins simples après traitement au bisulfite en raison de mésappariements G-U, et un seul brin d'ADN est montré ici pour simplifier.

Étant donné que la MSP repose fortement sur la spécificité de l'amorce vis-à-vis de la séquence convertie au bisulfite, la conception de l'amorce joue un rôle essentiel dans le succès expérimental. Premièrement, les sites de liaison aux amorces doivent contenir des résidus sensibles à la méthylation afin que les séquences méthylées par rapport aux séquences non méthylées puissent être détectées. Deuxièmement, les amorces de non-méthylation sont généralement riches en AT et doivent donc être longues (par exemple, >30 nt) avec Tm ≥60°C pour permettre un recuit spécifique. De plus, les séquences à haute AT favorisent souvent la formation d'amorces-dimères, l'hybridation des mésappariements, le glissement de l'ADN polymérase et le biais d'amplification. Par conséquent, l'ADN polymérase sélectionnée doit être capable d'amplifier des matrices avec une large gamme de contenu AT/GC. Troisièmement, la spécificité de l'amorce doit être testée empiriquement avec des ADN de contrôle d'états de méthylation connus et inconnus pour évaluer les résultats faussement positifs. Pour aider à discriminer les états de méthylation par les mésappariements de paires de bases, il est conseillé de concevoir des amorces de méthylation et de non-méthylation avec une paire de G-A ou T-C à leurs extrémités 3' (Figure 7).

En plus d'amplifier les séquences riches en AT, une ADN polymérase doit être capable de lire les résidus U dans l'ADN après traitement au bisulfite. La plupart des ADN polymérases haute fidélité ne conviennent pas à la MSP (à moins qu'elles ne soient spécialement modifiées) en raison de la présence d'une poche de liaison à l'uracile provenant de leurs origines archéennes. De même, la présence de U dans la séquence matrice ne permet pas le traitement UDG pour la prévention de la contamination par transfert PCR.

Au lieu de la PCR en point final, la PCR en temps réel peut être utilisée avec le MSP pour une analyse plus quantitative de la méthylation. Avec la PCR en temps réel, l'analyse de la courbe de fusion des amplicons PCR est une approche alternative basée sur la PCR pour détecter l'état de méthylation du locus d'intérêt.


Processus organellaires et métaboliques

William Zerges , Charles Hauser , dans The Chlamydomonas Sourcebook , 2009

B. Fonctionnalité des séquences de type SD

Des analyses de transformants chloroplastiques exprimant des constructions de gènes avec des séquences de type SD mutées dans leurs UTR 5' suggèrent qu'il n'y a pas d'exigence universelle pour un élément de type SD en traduction. Par exemple, des mutations dirigées vers un site dans les séquences de type SD de plusieurs ARNm ( petD, atpB, atpE, rps4, et rps7) ont eu peu ou pas d'effet sur leur traduction in vivo (Sakamoto et al., 1994 Fargo et al., 1998). Suppression d'une séquence de type SD dans le psbA La 5'UTR a aboli la traduction, mais a également fortement réduit le niveau de l'ARNm (Mayfield et al., 1994). Pour les deux psbD et psbC, la mutagenèse d'une séquence de type SD a réduit l'expression à environ 25 % du niveau de type sauvage, sans affecter l'accumulation d'ARNm ( Nickelsen et al., 1999 Zerges et al., 2003 ). Il existe également des preuves de la fonctionnalité des séquences SD dans les chloroplastes du tabac, à la fois en tant qu'activateurs et dans un cas, en tant que répresseur (Hirose et al., 1998 Plader et Sugiura, 2003 Kuroda et al., 2007).


Comment la mutagenèse par PCR ajoute-t-elle un site de restriction à proximité du gène d'intérêt ? - La biologie

Expérience 1 : Mutagenèse dirigée

Aperçu: Vous utiliserez les réactifs et le protocole QuickChange de Strategene dans cette expérience. Un fichier PDF du manuel se trouve sur le site Web de la classe. Vous allez effectuer une mutagenèse dirigée à médiation oligonucléotidique pour introduire une mutation dans le A. nidulans nimX séquence de gènes. Le changement est une transition de T à C à la position 6232 dans la séquence plasmidique pNIG6. Il en résulte un changement de Tyr (Y) condon #306 en His (H). La base de cette technique est l'utilisation d'oligonucléotides mutagènes comme amorces pour amplifier par PCR l'ensemble du plasmide avec une polymérase thermostable haute fidélité. Les oligonucléotides correspondront parfaitement à la séquence pNIG6 de chaque côté de 6232 (avec une mise en garde) mais coderont une paire de bases CG à 6232 au lieu de TA. La différence de séquence entre les amorces et pNIG6 est appelée « mismatch ». Étant donné que la procédure produit à la fois des plasmides de type mutant et de type sauvage, il faut cribler les résultats de la mutagenèse pour faire la distinction entre le WT et les mutants. Étant donné que la transition T à C à 6232 n'est détectable que par séquençage d'ADN, nous utiliserons une astuce supplémentaire pour identifier les mutants. Les oligonucléotides mutagènes contiendront un deuxième mésappariement, un qui détruit un site Nsil en 6228 (Y306H Nsil) ou ajoute un site SacI en 6246 (Y306H SacI). Cela vous permettra de déterminer si les clones qui résultent de votre mutagenèse sont de type sauvage ou mutant par une simple digestion de restriction (soit gain de site SacI soit perte du site NsiI). La prochaine étape logique serait de tester si votre mutant nimX gène peut fonctionner dans A. nidulans. Vous n'effectuerez pas ce test dans cet exercice, mais vous testerez la fonction de nimX mutations créées dans les exercices de laboratoire ultérieurs.

Protocole chronologique:

1. Chaque groupe effectue une réaction PCR QuickChange :

Tous les groupes mutent le plasmide pNIG6

Les groupes 1 à 4 utilisent la combinaison d'oligos Y306H NsiI et Y306H NsiI Comp = Perte de NsiI Réaction

Les groupes 5 à 8 utilisent la combinaison d'oligos Y306H SacI et Y306H SacI Comp = Gain de SacI Réaction

Les AT prépareront un master mix contenant tout sauf les oligonucléotides, l'ADN pNIG6 et l'enzyme. Chaque groupe recevra 44,5 ul de master mix.

Le mélange maître, tous les réactifs et la réaction sont conservés sur de la glace.

Tous les groupes ajoutent 1,25 ul chacun de chaque oligonucléotide (concentration 100 ng/ul )

Les groupes 1 et 5 ajoutent 2 ul de 2,5 ng/ul de pNIG6

Les groupes 2 et 6 ajoutent 2 ul de 5 ng/ul de pNIG6

Les groupes 3 et 7 ajoutent 2 ul de 10 ng/ul de pNIG6

Les groupes 4 et 8 ajoutent 2 ul de 25 ng/ul de pNIG6

Les TA ajouteront 1 ul d'enzyme à chaque réaction et démarreront la PCR. Aucune huile ne sera ajoutée aux réactions. Les conditions de réaction PCR seront telles que décrites dans votre manuel QuickChange, l'étape 3 du cycle 2 étant de 7,5 minutes (>1 min/kb plasmide).

[Note aux TA : fabriquez des plaques L-AMP et des plaques L-AMP+XGAL+IPTG. Effectuer la réaction de contrôle selon le manuel, tout au long de la transformation des cellules XL1-Blue sur des plaques L-AMP Xgal + IPTG]

2. Chaque groupe prélève 20 ul de sa réaction PCR dans un tube de 1,5 ml, ajoute 1 ul de DpnI et incube à 37 degrés pendant 1 heure.

3. Chaque groupe transforme 2 ul de leurs réactions de digestion DpnI en cellules XL1-Blue

a) Les TA vous fourniront 50 ul de cellules XL1-Blue dans des tubes sur glace, du milieu NZY+ dans des tubes dans les bains-marie à 42 degrés

b) Ajouter 2 ul d'ADN digéré par DpnI aux cellules sur glace, incuber sur glace 10 minutes

c) Cellules de choc thermique en déplaçant le tube de la glace au bain-marie à 42 degrés pendant 45 secondes, puis en remettant le tube dans la glace pendant 2 minutes

d) Ajouter 0,5 ml de milieu NZY+ préchauffé et incuber les tubes en agitant à 37 degrés pendant 1 heure.

e) Pendant l'incubation, pipeter 0,45 ml de milieu NZY+ dans un tube 1,5 et conserver à température ambiante. Vous l'utiliserez pour diluer le mélange de transformation avant le placage.

f) Après l'heure d'incubation, vortexer les cellules, pipeter 50 ul de cellules dans le tube contenant 0,45 ml de NZY+ pour faire une dilution 1:10 du mélange de transformation.

g) Plaque 250 ul de la dilution 1:10 du mélange de transformation sur une plaque L-AMP.

h) Plaquer 250 ul du mélange de transformation dilué sur une plaque L-AMP.

i ) Incuber les plaques à 37 degrés. Les TA stockeront les plaques à 4 degrés une fois que les colonies auront atteint une taille appropriée. Les plaques seront prêtes pour vous au début de la prochaine période de laboratoire. [Remarque à l'attention des AT : prélever 6 colonies dans les plaques de chaque groupe et inoculer 2 ml de L-AMP dans des tubes de culture et incuber les tubes en secouant toute la nuit à 37 degrés la nuit avant la prochaine période de laboratoire. Apportez les tubes de culture et les plaques au laboratoire]

4. Chaque groupe effectuera 6 isolements d'ADN miniprep sur des clones de leur réaction QuickChange en utilisant les réactifs du kit Qiagen (protocole du manuel Qiagen inséré ci-dessous).

1,5 ml de chaque culture cellulaire dans des tubes à centrifuger étiquetés de 1,5 ml.

b) Récolter les cellules bactériennes par centrifugation dans une microcentrifugeuse à pleine vitesse pendant 1 min à température ambiante (15,25 °C).

c) 1. Remettre en suspension les cellules bactériennes en culot dans 250 pi de tampon P1 contenant de la RNase.

d) Ajouter 250 μl de tampon P2 et bien mélanger en retournant le tube 4,6 fois. Mélanger doucement en retournant le tube. Ne pas vortexer, car cela entraînerait un cisaillement de l'ADN génomique. Si nécessaire, continuer à retourner le tube jusqu'à ce que la solution devienne visqueuse et légèrement limpide. Ne pas laisser la réaction de lyse se dérouler pendant plus de 5 min.

e) Ajouter 350 μl de tampon N3 et mélanger immédiatement et soigneusement en retournant le tube 4,6 fois. Pour éviter une précipitation localisée, bien mélanger la solution, immédiatement après l'ajout de Tampon N3. De grands volumes de culture (par exemple 𕟷 ml) peuvent nécessiter une inversion jusqu'à 10 fois et une agitation vigoureuse. La solution doit devenir trouble.

f) Centrifuger pendant 10 min à pleine vitesse dans une microcentrifugeuse de table. Une pastille blanche compacte se formera.

g) Appliquer les surnageants de l'étape 4 à la colonne de centrifugation QIAprep par pipetage . Étiquetez les sommets des colonnes de rotation.

h) Centrifuger pendant 30,60 s à pleine vitesse. Jeter l'écoulement.

i ) Laver la colonne de centrifugation QIAprep en ajoutant 0,75 ml de tampon PE et en centrifugant pendant 30,60 s à haute vitesse.

j) Jeter l'écoulement et centrifuger pendant 1 min supplémentaire pour éliminer le tampon de lavage résiduel. Important : le tampon de lavage résiduel ne sera pas complètement éliminé à moins que l'écoulement ne soit jeté avant cette centrifugation supplémentaire. Éthanol résiduel

du tampon PE peut inhiber les réactions enzymatiques ultérieures.

h) Placer la colonne QIAprep dans un microtube de 1,5 ml propre dont le couvercle est coupé (utiliser des ciseaux). Pour éluer l'ADN, ajoutez 50 &# de tampon EB (10 mM Tris Cl, pH 8,5) au centre de chaque colonne de centrifugation QIAprep, laissez reposer pendant 1 min et centrifugez pendant 1 min à grande vitesse.

j) Transférer la solution d'ADN dans un tube de microcentrifugation propre et étiqueté de 1,5 ml et conserver sur de la glace. REMARQUE : il n'y a pas d'EDTA dans l'EB, alors gardez l'ADN au froid pour minimiser les effets de toute nucléase contaminante.

REMARQUE AUX ÉTUDIANTS SUR LE NOM DES PLASMIDES : Vos plasmides seront nommés comme suit :

Numéro de groupe Numéro d'expérience Numéro de mini-écran

Exemple : Le plasmide isolé dans le quatrième miniscreen DNA à l'étape ci-dessus par le groupe 3 s'appellerait : 3-1-4 (groupe 3 Expérience 1 plasmide 4 ). C'est tout ce qu'il faut mettre sur le tube. Tous les plasmides doivent être conservés dans votre boîte à -20 degrés (congélateur). Votre cahier devrait avoir une liste de tous les plasmides créés et leur position dans votre boîte. Je devrais alors pouvoir consulter votre carnet à TOUT MOMENT, rechercher un ADN, trouver le tube dans votre boîte, trouver les données dans votre carnet. Le fait de ne pas avoir ces informations dans votre cahier au début de la période de laboratoire suivante, d'une manière que je peux comprendre sans beaucoup d'aide de votre part, entraînera un point de participation de classe négatif. Cela inclut tous les ADN (plasmides et produits PCR) créés pendant ma moitié de BIO 510.

5. Chaque groupe digère chaque clone mutant et effectue également une digestion témoin pNIG6. Les TA vous fourniront de l'ADN pNIG6 à 0,2 ug/ul et un tube contenant un Master Mix contenant un tampon et une enzyme pour votre digestion.

Les groupes 1 à 4 effectuent des doubles digestions NsiI plus PstI en utilisant le tampon NEB 3 plus BSA

Les groupes 5 à 8 font des digestions simples SacI en utilisant le tampon NEB 1 plus BSA

a) Distribuer 35 ul de master mix dans chacun des 7 tubes de microcentrifugation de 1,5 ml.

b) Ajouter 5 ul de chaque miniprep DNA dans un tube.

c) Réaction de contrôle : ajouter 4 ul ddH20 au dernier tube et 1 ul de pNIG6.

d) Incuber les réactions à 37 degrés pendant 1 heure.

6. Chaque groupe exécute les sept (7) réactions avec des marqueurs sur un gel à 1% et obtient une photo du résultat. Enregistrez et analysez vos résultats dans votre cahier de laboratoire. [Note aux AT : préparez les gels, préparez des tampons 10X et des aliquotes 10X de BSA au début de cette période de laboratoire.]

a) Ajouter 4 ul de tampon de chargement 10X à chaque digestion.

b) Charger 15 ul de la réaction sur un gel.

c) Charger 5 ul de marqueurs ADN MW dans une voie.

d) Exécutez jusqu'à ce que le colorant bleu soit près du fond du gel ! 45 minutes.

7. Enregistrer et discuter des résultats

Calcul de l'amorce mutagène TM : Chaque étudiant doit calculer la MT de l'amorce PCR que son groupe utilisera dans la réaction PCR Quick Change et consigner cette valeur dans son cahier de laboratoire. Les séquences d'amorces et les mésappariements entre les amorces et la matrice pNIG6 peuvent être déterminées à l'aide du vecteur NTI (vous l'avez déjà fait). L'équation de calcul de la TM des amorces avec discordances se trouve dans le manuel d'utilisation de QuickChange.

Transformation XL1-Bleu : Chaque élève doit calculer l'efficacité de transformation de son groupe (= nombre de transformants par ug d'ADN pNIG6 ajouté aux cellules) et noter cette information dans le cahier. Pour effectuer ce calcul, vous devrez calculer la quantité d'ADN pNIG6 présente dans les 2 ul du produit de digestion DpnI que vous avez transformé en cellules XL1-Blue. Enregistrez les résultats de votre groupe au tableau et recopiez les résultats de tous les groupes, y compris la transformation de contrôle effectuée par les TA. Comment vos résultats se comparent-ils à l'efficacité de transformation annoncée par Stratagene ? Comment se comparent-ils aux autres groupes? Quels sont les facteurs qui pourraient contribuer aux différences entre votre efficacité calculée par rapport à l'efficacité annoncée de Stratagene ? Entre votre efficacité et celle des autres groupes ?

Efficacité de la mutagenèse : Chaque étudiant doit également enregistrer l'efficacité de la mutagenèse de la réaction de contrôle exécutée par les AT (efficacité = pourcentage de transformants E. coli qui contiennent un plasmide mutant). Pour ce faire, vous devrez consulter le manuel QuickChange et apprendre quelle était la réaction de contrôle et comment vous utiliseriez le test de couleur des colonies bleu/blanc pour déterminer quelles colonies portent un plasmide mutant et lesquelles portent un plasmide de type sauvage. Notez également l'efficacité de mutation obtenue par votre groupe et tous les autres groupes (notez les informations du tableau). Pour le déterminer, vous devez utiliser Vector NTI pour prédire les résultats des digestions de restriction pour pNIG6 et la forme mutée de pNIG6 que vous avez essayé de créer.

Plasmides : pNIG6 à 0,2 ug/ul 25 ng/ul 10 ng/ul 5 ng/ul 2,5 ng/ul

Oligonucléotides (tous à 100 ng/ul) : Y306H NsiI Y306H NsiI Comp Y306H SacI Y306H SacI Comp.


Mutagenèse PCR, clonage, expression, protocoles de purification rapide des protéines et cristallisation des formes sauvages et mutantes de la tryptophane synthase

Études structurales avec le complexe bienzymatique tryptophane synthase (TS) (α2β2 TS) de Salmonelle typhimurium ont été réalisées pour mieux comprendre son mécanisme catalytique, son comportement allostérique et les détails de la transformation enzymatique du substrat en produit dans les enzymes dépendantes du PLP. Dans ce travail, un nouveau système d'expression pour produire le α- isolé et isolé β-sous-unité a permis la purification de grandes quantités de sous-unités pures et α2β2 StComplexe TS des sous-unités isolées dans les 2 jours. La purification a été effectuée par chromatographie d'affinité suivie d'un clivage de l'étiquette d'affinité, d'une précipitation au sulfate d'ammonium et d'une chromatographie d'exclusion stérique (SEC). Pour mieux comprendre le rôle des résidus clés sur le site de l'enzyme, une mutagenèse directe sur site a été réalisée dans des études structurelles antérieures. Un autre protocole a été créé pour purifier le type sauvage et le mutant α2β2 Stcomplexes TS. Un protocole simple, rapide et efficace utilisant le fractionnement au sulfate d'ammonium et la SEC a permis la purification de α2β2 StComplexe TS en une seule journée. Les deux protocoles de purification décrits dans ce travail présentent des avantages considérables par rapport aux protocoles précédents pour purifier le même complexe en utilisant du PEG 8000 et de la spermine pour cristalliser le α2β2 StComplexe TS le long du protocole de purification. La cristallisation du type sauvage et de certaines formes mutantes se produit dans des conditions légèrement différentes, ce qui nuit à la purification de certains mutants à l'aide de PEG 8000 et de spermine. Pour préparer des cristaux adaptés aux études cristallographiques aux rayons X, plusieurs efforts ont été déployés pour optimiser la cristallisation, la qualité des cristaux et la cryoprotection.. Les méthodes présentées ici devraient être généralement applicables pour la purification des sous-unités de tryptophane synthase et de type sauvage et mutant α2β2 Stcomplexes TS.

Introduction

Le complexe bienzymatique tryptophane synthase (TS) (α2β2) est une enzyme allostérique, catalysant les deux dernières étapes de la biosynthèse de l'acide aminé L-tryptophane dans les bactéries, les plantes et les champignons 1 , 2 , 3 . Bactérie Salmonella enterica sérovar typhimurium (St) provoque une infection gastro-intestinale grave chez l'homme et d'autres animaux. Étant donné que les humains et les animaux supérieurs n'ont pas de ST (EC 4.2.1.20), l'inhibition de S. typhimurium α2β2 Complexe TS (α2β2 StTS) a été explorée comme cible potentielle de médicaments pour le traitement de la cryptosporidiose et de la tuberculose 4 , des infections génitales et oculaires 5 , et pour l'utilisation potentielle d'herbicides en agriculture 6 . La sous-unité α catalyse le clivage aldolytique de l'indole-3-glycérol-phosphate (IGP) en glycéraldéhyde-3-phosphate (GAP) et en indole, par la formation d'un intermédiaire tautomère d'indolénine et par la suite le clivage de la liaison carbone-carbone pour produire GAP et indole 3 , 6 . Le site catalytique β contient une molécule de cofacteur pyridoxal 5′-phosphate (PLP) liée à β-Lys87 via une base de Schiff, qui fonctionne comme un puits d'électrons au cours des réactions au niveau de l'enzyme β -sous-unité 3 , 7 . Le site β catalyse le remplacement de l'hydroxyle de la chaîne latérale de la L-sérine par l'indole pour donner du L-tryptophane et une molécule d'eau dans une réaction dépendante du PLP. StTS sert de modèle de longue date pour l'étude de la canalisation des substrats et de la communication allostérique au sein de complexes multi-enzymatiques 2 , 3 . La communication allostérique bidirectionnelle entre les sous-unités α et β de la TS est nécessaire pour synchroniser les étapes catalytiques et empêcher la libération d'indole pendant la synthèse du L-tryptophane 3 . Pour étendre cet effort, nous avons préparé plusieurs mutants (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr et β-Ser377Ala) par mutation ponctuelle à utiliser dans d'autres explorations de la relation entre la structure, le mécanisme et la fonction de l'enzyme. sur le site catalytique de la StSous-unité TS β.

Recherche détaillée sur le mécanisme catalytique de α2β2StTS a été initié par le groupe de recherche d'Edith W. Miles. Premières études avec natif Escherichia coli α2β2 Le complexe TS se sont concentrés sur la purification et la caractérisation de la sous-unité α 8, 9 isolée, de la sous-unité β isolée 10, 11 et la reconstitution de la α2β2 Complexe TS des sous - unités isolées 12 . La purification a été effectuée par précipitation au sulfate d'ammonium, dialyse de l'échantillon, Chromatographie DEAE-Sephadex, dialyse et un deuxième tour de Chromatographie sur une colonne DEAE-Sephadex 12 . Dans un autre protocole, la purification du même complexe a été améliorée en chargeant le lysat cellulaire clarifié sur colonne DEAE-Sephadex suivi d'une étape chromatographique sur colonne Sepharose 4B, précipitation au sulfate d'ammonium et dialyse 13 . Les deux protocoles de purification durent 4 à 5 jours. Escherichia coli α2β2 Le complexe TS s'est cristallisé mais les cristaux n'étaient pas adaptés à la diffraction des rayons X à cette époque.

Dans une nouvelle étude, des formes recombinantes et de type sauvage de S. typhimurium α2β2 Les complexes TS ont été purifiés et cristallisés 14 , 15 . Le recombinant α2β2 StLe complexe TS était surexprimé dans E. coli souche CB149 portant le vecteur d'expression pEBA-10. Collecte et analyse des données de cristallisation initiale et de diffraction des rayons X du α2β2 Stcomplexe TS ont été signalés 14 . Cependant, une aiguille longue et fine comme α2β2 StLes cristaux de TS ont altéré les études structurales. Dans le but de collecter de meilleures données de diffraction des rayons X, un autre protocole de purification a été décrit pour purifier les formes de type sauvage et mutantes du α2β2 StComplexe TS 15 . La purification a été effectuée avec une précipitation initiale en utilisant de la spermine et du PEG 8000 dans le lysat cellulaire clarifié et un grand précipité volumineux a été éliminé par centrifugation. La fraction surnageante contenant de grandes quantités de α2β2 StLe complexe TS a été stocké pendant 16 à 48 h à 4 °C jusqu'à ce que des cristaux jaunes précipitent. Les cristaux ont été lavés et largement dialysés contre différents tampons. Le complexe protéique a été recristallisé dans un tampon contenant du sulfate d'ammonium et dialysé 15 um. Bien que la cristallisation des protéines dépende des concentrations de protéines et de précipitants en solution, il est difficile de surveiller, de prévoir et de reproduire la purification pour d'autres formes mutantes de α2β2 StComplexe TS en solution. Ce protocole a l'avantage de n'utiliser aucune méthode chromatographique, cependant, les inconvénients sont le long temps de purification nécessaire pour cristalliser, dialyser et recristalliser, nécessitant généralement 5 à 7 jours. Pour obtenir des cristaux adaptés à la collecte de données par rayons X, plus de 600 conditions de cristallisation ont été évaluées en utilisant une combinaison et une variation de concentration de protéines, de température, de précipitants (PEG 4 000, 6 000 et 8 000) et d'additifs (CaCl2, MnCl2, ZnCl2, cadavérine, putrescine, spermine ou spermidine) 15 . Les cristaux avaient une meilleure forme cristalline et se sont développés plus rapidement dans des conditions contenant 12 % de PEG 8 000 et 2 mM de spermine. La cristallisation était plus favorable à 25 °C plutôt qu'à 4, 30 ou 42 °C et a atteint ses dimensions maximales en 3 jours 15 . Plusieurs α2β2 StLes structures cristallines TS ont été signalées à cette époque (1996-1999) 16, 17, 18, 19, 20, 21 et de nombreuses autres structures ont été publiées à ce jour.

Ici, l'objectif principal est de présenter des protocoles alternatifs pour purifier la tryptophane synthase et optimiser la cristallisation des protéines. Le présent travail montre des améliorations significatives pour purifier la sous-unité α isolée de type sauvage (αStTS), sous-unité β isolée (βStTS), reconstitué α2β2 StComplexe TS des sous-unités isolées et des formes de type sauvage et mutantes du α2β2 Stcomplexe TS. Les avantages par rapport aux protocoles antérieurs sont considérables puisque le temps de purification a été considérablement réduit et que la cristallisation et la cryoprotection ont été optimisées. Formes mutantes de α2β2 StLe complexe TS mis au point dans ce travail s'est cristallisé dans les mêmes conditions que celles utilisées pour la forme de type sauvage. Cependant, une optimisation fine de la cristallisation était nécessaire pour obtenir de gros monocristaux de qualité suffisante pour la détermination de la structure à une résolution proche de l'atome. À ce jour, il existe 134 structures cristallines de tryptophane synthase déposées dans la Protein Data Bank (PDB), représentant respectivement 101, 31 et 2 structures cristallines pour les bactéries, les archées et les eucaryotes. Joliment, 73 structures appartiennent à S. enterica sérovar typhimurium et 5 structures cristallines du α2β2 StLes complexes TS ont des limites de résolution supérieures à 1,50 angström. Sans surprise, 4 sur 5 ont été préparés dans notre groupe de recherche (ID PDB : 5CGQ à 1,18 Å, 4HT3 à 1,30 Å, 4HPJ à 1,45 Å, 6DZ4 à 1,45 Å résolution). Les structures cristallines raffinées de la forme mutante de α2β2 StLe complexe TS devrait fournir de nouvelles informations sur le mécanisme et les rôles joués par les résidus d'acides aminés essentiels impliqués dans la synthèse du L-tryptophane.

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Protocole

1. Protocole rapide pour purifier les sous-unités α- et β et le α recombiné2β2 Stcomplexe TS

  1. Sous-clonage d'ADN dans le vecteur d'expression pETSUMO
    1. Obtenir le gène de couplage traductionnel (trpA et trpB) codant pour le α- et β-sous-unités de la tryptophane synthase de bactérie Salmonella enterica sérovar typhimurium cloné dans le vecteur d'expression pEBA-10 22 . Utilisez le vecteur pEBA-10 comme matrice d'ADN.
      REMARQUE : Alternativement, les amorces énumérées ci-dessous peuvent être utilisées pour amplifier les deux gènes du Salmonella enterica sérovar typhimurium génome. Toutes les étapes de biologie moléculaire ont été suivies comme décrit dans Molecular Cloning: A Laboratory Manual 23 .
    2. Utiliser la réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour amplifier individuellement la séquence polynucléotidique complète du α-sous-unité (αStTS) avec des amorces αStTS-FW-Bam et αStTS-Rev-Eco et la séquence complète de β-sous-unité (βStTS) avec des amorces βStTS-FW-Bam et βStTS-Rev-Hind. Utiliser une température de fusion d'environ 55 °C et un temps d'extension de la polymérase de 2 min.
      1. Utilisez l'ADN polymérase haute fidélité (par exemple, Phusion) et le protocole du fabricant pour amplifier les séquences d'ADN. Pour une réaction PCR de 50 µL, ajoutez 34 µL d'eau sans nucléase, 10 µL de tampon de réaction 5x, 1 µL de dNTP 10 mM, 1 µL de 10 µM d'amorce directe, 1 µL de 10 µM d'amorce inverse, 1 µL d'ADN matrice (200 ng), 1,5 µL de DMSO, 0,5 µL d'ADN polymérase Phusion.
      2. Pour le programme PCR, utilisez un démarrage à chaud (180 secondes à 98 °C) suivi de 30 cycles d'amplification (30 secondes à 98 °C, 30 secondes à 55 °C et 120 secondes à 72 °C), et une dernière prolongation (300 secondes à 72 °C).
        REMARQUE : Les séquences en italique correspondent aux BamSALUT, ÉcoRI, BamBonjour et De derrièreIII sites de restriction, respectivement. L'efficacité du clivage enzymatique près des extrémités des fragments PCR a été améliorée en ajoutant des bases supplémentaires (séquences en minuscules).
        αStTS-FW-Bam : 5′-cgcGGATCCATGGAACGCTACGAAAA-3′
        αStTS-Rev-Eco : 5′-ccgCAATTTTATGCGCGGCTGGC-3′
        βStTS-FW-Bam : 5′-cgcGGATCCATGACAACACTTCTCAAC-3′
        βStTS-Rev-Hind: 5′-cccAAGCTTTCAGATTTCCCCCTC-3′
      1. Digérer au moins 200 ng de chaque fragment d'ADN avec les enzymes de restriction appropriées et les conditions recommandées par le fabricant pendant 2 heures à 37 °C.
      2. Pour mettre en place une réaction de digestion de restriction de 50 μL, ajoutez 34 µL d'eau sans nucléase, 10 µL d'ADN (200 ng), 5 μL de tampon de réaction 10x, 0,5 µL d'enzyme de restriction 1 , et 0,5 µL d'enzyme de restriction 2.
      3. Chargez le produit de digestion sur un gel d'agarose à 0,8 % sur 1x TAE à 6 V/cm, extrait de gel et purifiez le fragment digéré sur gel à l'aide d'un kit commercial.
      1. Inoculer frais E. coli souche Rosetta (DE3) pLyS cellules abritant SUMO-αStTS ou SUMO-βStTS construit ou gratte une partie du stock de glycérol congelé dans une culture de 50 ml de LB contenant 35 μg/mL de kanamycine et de chloramphénicol. Cultivez les cellules pendant la nuit en agitant à 200 tr/min à 37 °C.
      2. Le lendemain matin, inoculer 5 ml de la culture cellulaire pendant la nuit dans un 2x 1000 ml de LB frais et stérile contenant 2% de glycérol plus kanamycine et chloramphénicol (fiole de Fernbach de 2,8 L). Cultiver la culture cellulaire en secouant à 200 tr/min à 37 °C.
        REMARQUE : L'expression de SUMO-αStTS ou SUMO-βStLe TS dans le bouillon LB donne 125-150 mg de protéine marquée par litre. Envisagez d'augmenter ou de réduire le protocole pour répondre à des demandes spécifiques.
      3. Induire l'expression de protéines recombinantes lorsque la DO600 atteint 0,6-0,8 par addition d'isopropyl β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale de 0,4 mM suivie d'une incubation à 30 °C pendant une nuit sous agitation à 200 tr/min.
      4. Récolter les cellules par centrifugation à 4 000 x g à 4 °C pendant 20 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension les culots cellulaires avec du tampon de lyse froid 1 (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, contenant 500 mM de NaCl, 5 % de glycérol, 10 mM de 2-mercaptoéthanol et 40 mM d'imidazole-Cl) jusqu'à une finale volume de 60 ml.
        REMARQUE : Les cellules peuvent être stockées à long terme à -80 °C ou utilisées immédiatement pour la purification des protéines. Pour stocker les cellules, divisez la suspension cellulaire en 2 tubes coniques à centrifuger jetables de 50 ml et conservez les culots cellulaires à -80 °C jusqu'à l'étape de purification des protéines.
      1. Perturber le culot cellulaire par sonication à l'aide d'un sonificateur numérique avec sonde 1/2 & 34 Horn (ou un équipement similaire). Effectuer 20 cycles à un cycle de service d'amplitude de 80 % sur un bain d'eau glacée en utilisant une impulsion de 10 s et un repos de 20 s ou jusqu'à la rupture complète de la cellule.
      2. Centrifuger le lysat cellulaire à 30 000 x g pendant 30 minutes. Aspirer le surnageant, en veillant à ce que le culot ne se déloge pas du tube. Filtrez le surnageant avec une unité de filtration de 0,45 μm sur de la glace et faites-le passer à travers une colonne d'affinité chargée de nickel Ni-NTA agarose de 15 ml pré-équilibrée dans le tampon de lyse 1.
        REMARQUE : Chaque colonne d'agarose Ni-NTA sera utilisée pour purifier soit SUMO-αStTS ou SUMO-βStprotéine recombinante TS. La purification peut être effectuée dans une colonne Ni-NiTA de 2 x 5 ml attachée à un système de chromatographie liquide rapide des protéines. Purifiez une protéine à la fois.
      3. Laver la colonne d'agarose Ni-NTA dans 100 ml de tampon de lyse 1.
      4. Procéder à une élution en une étape de 80 ml avec le tampon E1 (tampon Tris-Cl 25 mM, pH 7,8, contenant 200 mM de NaCl, 5 % de glycérol et 400 mM d'imidazole-Cl).
        REMARQUE : la SUMO-protéase tolère jusqu'à 300 mM d'imidazole et la membrane des dispositifs de filtrage centrifuge tolère jusqu'à 100 mM d'imidazole. Nous recommandons d'effectuer une précipitation au sulfate d'ammonium pour éliminer de grandes quantités d'imidazole et réduire le temps de purification au lieu de diluer l'échantillon de protéines et de perdre du temps avec la concentration en protéines.
      5. Évaluer le volume initial de la fraction surnageante. Ajouter lentement de petites quantités de sulfate d'ammonium à la fois, jusqu'à ce qu'une saturation de 60 % (39,48 g/100 ml) à 25 °C soit atteinte. Remuez doucement la solution pendant 30 min et évitez les bulles. Centrifuger à 10 000 x g pendant 15 minutes.
      6. Aspirer et jeter soigneusement la fraction surnageante. Remettre en suspension la fraction de culot dans 20 ml de tampon d'échantillon (20 mM de Tris-Cl, pH 8,0, 300 mM de NaCl et 5 % de glycérol).
      7. Pour le clivage His-SUMO-tag avec la SUMO-protéase, ajoutez le fragment recombinant de la protéase 1 spécifique à Ubl de Saccharomyces cerevisiae dans un rapport 1:1000 et incuber le mélange pendant 2 heures à 4 °C.
      8. Centrifuger le produit de digestion à 10 000 x g dans 25 °C pendant 20 min pour éliminer les agrégats de protéines avant de charger l'échantillon à travers une colonne de chromatographie d'affinité.
      9. Supprimer les traces de balise His6-SUMO en passant l'échantillon remis en suspension de 20 ml sur une colonne d'agarose Ni-NTA de 15 ml, préalablement équilibrée dans le tampon de lyse 1.
      10. Recueillez l'échantillon de passage contenant le non étiqueté αStTS ou βStTS.
      11. Laver la colonne Ni-NTA dans 20 mL de tampon 1 pour récupérer les restes de non-marqué αStTS ou βStTS.
      12. Concentrez chaque sous-unité séparément avec une unité de filtre centrifuge de coupure de 15 ml de 10 kDa en tournant à 3 000 x g à 4 °C. Transférer la protéine concentrée dans un tube frais de 2,0 ml et une microcentrifugeuse (10 000 x g, 10 min, 4 °C) pour éliminer les agrégats. Déterminer la concentration en protéines 24, préparer des aliquotes de 1 ml à 20-25 mg ml -1, étiqueter, congeler rapidement dans de l'azote liquide et les stocker à -80 °C.
        REMARQUE : Les échantillons de protéines pré-purifiées peuvent être stockés à long terme à -80 °C ou utilisés immédiatement pour la purification des protéines sur une colonne de chromatographie d'exclusion stérique (SEC).
      13. Prendre une aliquote de protéines (20 mg) et microcentrifuger à 10 000 x g pendant 10 min pour éliminer les agrégats avant SEC.
      14. Charger l'échantillon sur une colonne de chromatographie d'exclusion stérique (par exemple, HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR) attachée à une protéine rapide chromatographie liquide à un débit de 0,5 mL min -1 , préalablement équilibré en tampon SEC (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5% glycérol, 0,1 mM phosphate de pyridoxal).
        REMARQUE : Pour purifier des quantités plus élevées de α isoléStTS ou βStSous-unité TS et diminuer le nombre de tours SEC, charger un échantillon de 5 ml à 20-25 mg ml -1 sur une colonne de chromatographie d'exclusion stérique à un débit de 1,5 ml min -1.
      15. Évaluer la qualité de αStTS ou βStTS dans la fraction de pic en utilisant respectivement une électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium à 12 % ou à 15 % (SDS-PAGE), colorée au bleu brillant de Coomassie 25 .
      16. Concentrez les protéines avec des unités de filtre centrifuges de coupure fraîche de 15 ml de 10 kDa, déterminez la concentration de protéines 24, préparez des aliquotes de 0,5 ml à 20-25 mg ml -1, étiquetez, congelez-les dans de l'azote liquide et stockez-les à -80 &# 176C.
      1. Pour purifier le sauvage α2β2Stcomplexe TS du α- et β-sous-unités, décongeler des échantillons de concentré de αStTS et βStSous-unités TS à 4 °C.
      2. Combiner les aliquotes (1,2 αStTS : 1.0 βStrapport molaire TS) et incubé à 4 °C pendant 1 h.
        REMARQUE : Un excès de αStTS est nécessaire pour garantir que la plupart des βStTS sera incorporé dans le α2β2StComplexe TS.
      3. Retirer les agrégats de protéines par microcentrifugation (10 000 x g, 10 min, 4 °C).
      4. Chargez le surnageant clarifié sur la colonne d'exclusion de taille.
      5. Évaluer la qualité de αStTS ou βStTS dans la fraction de pic en utilisant respectivement une électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium à 12 % ou à 15 % (SDS-PAGE), colorée au bleu brillant de Coomassie 25 .
      6. Déterminer la concentration en protéines 24, préparer des aliquotes de 250 à 1000 μL à 15-20 mg ml -1, congeler rapidement dans de l'azote liquide et conserver à -80 °C.

      2. Purification du type sauvage ou de la forme mutante du α2β2 Stcomplexe TS

      1. Mutagenèse dirigée pour préparer le mutant βStST
        1. Utilisez le vecteur d'expression pEBA-10 de construction 22 comme matrice d'ADN pendant les deux étapes de la réaction en chaîne par polymérase pour introduire des mutations ponctuelles spécifiques dans le β-chaîne séquence polynucléotidique TS.
          REMARQUE : Ce protocole peut être utilisé pour introduire une seule mutation ponctuelle dans l'un ou l'autre α-ou β-sous-unité de Salmonelle typhimurium tryptophane synthase. Pour d'autres, de nouvelles amorces oligonucléotidiques contenant la mutation souhaitée doivent être conçues de manière appropriée. Dans ce travail, les mutations βQ114A, βK167T, βS377A sont répertoriés.
        2. Effectuer des réactions PCR en utilisant des paires d'amorces nucléotidiques TS-FW-NcoI/Q114A-Rev, TS-FW-NcoI/K167T-Rev et TS-FW-NcoI/S377A-Rev pour générer les fragments A1, B1 et C1, respectivement.
          REMARQUE : les oligonucléotides TS-NcoI-FW et TS-SacI-Rev, respectivement, s'hybrident en amont et en aval du αβ StSéquence polynucléotidique TS clonée dans le vecteur pEBA-10.
          1. Utilisez l'ADN polymérase haute fidélité (par exemple, Phusion) et le protocole du fabricant pour amplifier les séquences d'ADN. Pour une réaction PCR de 50 µL, ajoutez 34 µL d'eau sans nucléase, 10 µL de tampon de réaction 5x, 1 µL de dNTP 10 mM, 1 µL de 10 µM d'amorce directe, 1 µL de 10 µM d'amorce inverse, 1 µL d'ADN matrice (200 ng), 1,5 µL de DMSO, 0,5 µL d'ADN polymérase.
          2. Pour le programme PCR, utilisez un démarrage à chaud (180 secondes à 98 °C) suivi de 30 cycles d'amplification (30 secondes à 98 °C, 30 secondes à 55 °C et 120 secondes à 72 °C), et une dernière extension (300 secondes à 72°C).
            REMARQUE : Toutes les étapes de biologie moléculaire ont été suivies comme décrit dans Molecular Cloning: A Laboratory Manual 23 . Alors qu'une séquence en minuscule correspond à un site de restriction, une séquence en gras et en italique correspond à une mutation.
            TS-FW-NcoI : 5’-CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGA cca tgg-3’
            Q114A-Rev : 5’-C AGA GGC GAC GCC GTG CCG ACC GGC GCC GGT TTC-3’
            K167T-Rev: 5’-CTC GTT ACA GGC ATC TGT TAG CGT AGC GGA GCC-3’
            S377A-Rev: 5’-C TTT ATC TCC GCG GCC AGC GAG AT GAC CAC CAG-3’
          1. Mélanger les fragments A1/A2, B1/B2 et C1/C2 séparément en quantités équimolaires, dénaturer à la chaleur le mélange pendant 10 min à 96 °C et recuire à 25 °C. Prolongez les brins recombinants avec une polymérase haute fidélité et des désoxyribonucléotides selon le protocole du fabricant.
          1. Digérer au moins 200 ng de chaque fragment d'ADN avec les enzymes de restriction appropriées et les conditions recommandées par le fabricant pendant 2 heures à 37 °C. Pour mettre en place une réaction de digestion de restriction de 50 μL, ajoutez 34 µL d'eau sans nucléase, 10 µL d'ADN (200 ng), 5 μL de tampon de réaction 10x, 0,5 µL d'enzyme de restriction 1 , et 0,5 µL d'enzyme de restriction 2. Chargez le produit de digestion sur 0,8% d'agarose dans 1x tampon TAE à 6 V/cm et purifiez le fragment PCR digéré.
          1. Grandir E. coli souche d'expression abritant la construction souhaitable dans un 50 ml de milieu LB frais et stérile contenant 50 μg/mL d'ampicilline. Cultivez les cellules pendant la nuit en agitant à 200 tr/min à 37 °C.
          2. Ajouter 5 ml de la culture cellulaire pendant la nuit dans un 2x 1000 ml de LB frais et stérile contenant 2% de glycérol plus ampicilline (flacon de Fernbach de 2,8 L). Cultiver la culture cellulaire en secouant à 200 tr/min à 37 °C.
          3. Induire l'expression de protéines recombinantes lorsque la DO600 atteint 0,6-0,8 par addition d'IPTG à une concentration finale de 0,4 mM suivie d'une incubation à 30 °C pendant la nuit avec agitation à 200 tr/min.
          4. Récolter les cellules par centrifugation à 4 000 x g en 4 °C pendant 20 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension les culots cellulaires avec du tampon de lyse froid 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7,80, contenant 100 mM de NaCl, 5 mM de dithiothréitol, 1 mM d'EDTA et 1 mM de PMSF) jusqu'à un volume final de 50 ml amortir.
            REMARQUE : Les cellules peuvent être stockées à long terme à -80 °C ou utilisées immédiatement pour la purification des protéines. Pour stocker les cellules, divisez la suspension cellulaire en 2 tubes coniques à centrifuger jetables de 50 ml et conservez les culots cellulaires à -80 °C jusqu'à l'étape de purification des protéines. L'expression de la forme mutante et sauvage de α2β2StLe complexe TS dans le bouillon LB donne 125-150 mg de protéine par litre. Envisagez d'augmenter ou de réduire le protocole pour répondre à des demandes spécifiques.
          1. Perturber le culot cellulaire par sonication à l'aide d'un sonificateur numérique avec sonde 1/2 & 34 Horn (ou un équipement similaire). Effectuer 20 cycles à un cycle de service d'amplitude de 80 % sur un bain d'eau glacée en utilisant une impulsion de 10 s et un repos de 20 s ou jusqu'à la rupture complète de la cellule.
          2. Centrifuger le lysat cellulaire à 30 000 x g pendant 30 min à 25 °C. Aspirer le surnageant, en veillant à ce que le culot ne se déloge pas du tube. Filtrer la fraction surnageante clarifiée avec un filtre 0,45 μm à température ambiante.
          3. Évaluer le volume initial de la fraction surnageante clarifiée. Ajouter lentement de petites quantités de sulfate d'ammonium à la fois, jusqu'à ce qu'une saturation de 20 % soit atteinte (11,51 g/100 ml). Réaliser un fractionnement au sulfate d'ammonium à 25 °C. Remuez doucement la solution pendant 10 min et évitez les bulles.
          4. Centrifuger à 30 000 x g pendant 10 min à 25 °C. Transférer la fraction surnageante à 20 % dans un flacon propre. Remettre doucement en suspension 20 % de la fraction de culot dans 20 ml de tampon d'échantillon 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7,80, contenant 100 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA et 2 mM de dithiothréitol) et préparer un échantillon pour exécuter le gel SDS-PAGE. Jeter la fraction de culot de 20 %.
          5. Évaluer le volume initial de la fraction surnageante à 20 %. Ajouter du sulfate d'ammonium jusqu'à 30 % de saturation (5,94 g/100 ml), agiter la solution, éviter les bulles et centrifuger comme précédemment. Transférer la fraction surnageante à 30 % dans un flacon propre. Remettre doucement en suspension 30% de la fraction de culot dans 20 ml de tampon d'échantillon 2 et préparer un échantillon pour exécuter le gel SDS-PAGE. Jeter la fraction de 30 % de pastilles.
          6. Évaluer le volume initial de la fraction surnageante à 30 %. Ajouter du sulfate d'ammonium à une saturation de 40 % atteinte (6,14 g/100 ml), agiter la solution, éviter les bulles et centrifuger comme précédemment. Transférer la fraction surnageante à 40 % dans un flacon propre. Remettre doucement en suspension 40% de la fraction de culot dans 10 ml de tampon d'échantillon 2 et préparer un échantillon pour exécuter le gel SDS-PAGE. Jeter la fraction surnageante à 40 %.
            REMARQUE : Évaluez la qualité de αβStComplexe TS utilisant des échantillons des fractions de surnageant et de culot à 30 % et 40 % dans un gel SDS-PAGE à 12 %. Si vous vérifiez qu'un autre mutant αβStLe complexe TS se trouve dans la fraction surnageante à 40 %, procédez avec une saturation de 60 % de sulfate d'ammonium (13,0 g/100 ml). Aliquotes de protéines pré-purifiées du α pré-purifié2β2StLe complexe TS peut être stocké à long terme à -80 °C ou utilisé immédiatement pour la purification des protéines sur une colonne de chromatographie d'exclusion stérique (SEC).
          7. Microcentrifuger l'échantillon de protéine à 10 000 x g, 20 min, 4 °C et charger la fraction surnageante sur une colonne HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR attachée à une protéine rapide chromatographie liquide à un débit de 0,5 mL min -1 , préalablement équilibré en tampon SEC (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5% glycérol, 0,1 mM phosphate de pyridoxal).
            REMARQUE : Pour purifier de grandes quantités de complexe, chargez un échantillon de 5 ml à 20-25 mg ml -1 sur une colonne HiLoad 26/600 Superdex 200 pg à un débit de 1,5 ml min -1.
          8. Évaluer les échantillons recueillis le long du fractionnement du sulfate d'ammonium et des fractions maximales de la colonne SEC sur un gel SDS-PAGE à 12% coloré au bleu brillant de Coomassie 25.
          9. Concentrez le type sauvage ou mutant α2β2StComplexe TS avec une unité de filtration centrifuge de coupure de 15 mL 100 kDa par filage à 3 000 x g à 4 °C. Transférer la protéine concentrée dans un tube frais de 2,0 ml et une microcentrifugeuse (10 000 x g, 10 min, 4 °C) pour éliminer les agrégats.
          10. Déterminer la concentration en protéines 24, préparer des aliquotes de 0,5 ml à 20-25 mg ml -1, étiqueter, congeler rapidement dans de l'azote liquide et les stocker à -80 °C.

          3. Cristallisation optimisée pour le type sauvage et la forme mutante du α2β2 Stcomplexe TS

          REMARQUE : la condition de cristallisation initiale pour le α2β2 StLe complexe TS a déjà été signalé dans des conditions contenant 12 % de PEG 8 000 et 2 mM de spermine 22 .

          1. Préparer des solutions mères avant les tests de cristallisation pour obtenir une meilleure reproductibilité de cristallisation. Pour effectuer des études structurelles avec TS, cristallisez la protéine avec des ions Na + ou Cs + au site de coordination métallique du complexe bienzymatique.
            1. Préparer 5 ml de solution mère de 200 mM de spermine dans de l'eau et conserver des aliquotes de 500 µL à -20 °C.
            2. Préparer 50 ml de solution mère de PEG 8000 à 30 % (p/v) dans de l'eau et conserver des aliquotes de 25 ml dans des fioles coniques à centrifuger jetables de 50 ml à 25 °C.
            3. Préparer une solution mère de 25 ml de CsCl 1 M dans de l'eau et conserver à 25 °C.
            4. Préparer 25 ml de solution mère de 1 M NaCl dans de l'eau et conserver à 25 °C.
            5. Préparer 3x 50 ml de solution mère de bicine 1 M et titrer avec CsOH ou NaOH pour obtenir des solutions tamponnées à pH 7,6, 7,8 et 8,0. Conserver des aliquotes de 25 ml à 4 °C.

            4. Collecte de données de diffraction des rayons X et α2β2 StSolution de structure complexe TS

            REMARQUE : Avant la collecte de données de diffraction des rayons X, préparez à l'avance une solution cryoprotectrice pour chaque cristal. Utilisez la solution réservoir spécifique pour préparer 3 aliquotes contenant des concentrations croissantes de dsulfoxyde d'iméthyle en solution (10, 20 et 30 % v/v) et ligand(s) spécifique(s). Le diméthylsulfoxyde s'est avéré être un meilleur cryoprotecteur que le glycérol, l'éthylène glycol et le PEG 200-300.

            1. Récoltez un grand monocristal à l'aide d'un cryoloop sous le microscope stéréoscopique.
            2. Pipeter 2 μL de chaque solution cryoprotectrice contenant la solution de précipitation plus des concentrations plus élevées de dsulfoxyde d'iméthyle et ligand(s) sur une nouvelle lamelle.
            3. Séquentiellement, tremper ccristal dans chaque goutte et laisser le cristal s'équilibrer pendant 30 s dans la solution cryoprotectrice.
            4. Refroidissement instantané du cristal cryoprotégé à l'aide d'un flux d'azote gazeux à -173 °C (100 K) ou immersion dans de l'azote liquide pour un stockage à long terme dans des rondelles.
              REMARQUE : Remplissez un Dewar en mousse avec de l'azote liquide, pré-refroidissez une rondelle de cristal, stockez les cristaux dans le Dewar de stockage cryogénique et expédiez les cristaux au synchrotron à l'aide d'un expéditeur sec.
            5. Procéder à la collecte des données de diffraction des rayons X à -173 °C. Enregistrer les données de diffraction des rayons X en utilisant un temps d'exposition de 0,5 à 4,0 s et des oscillations de 0,5 à 176. Faites pivoter le cristal de 180-360°.
            6. Traitez les images de diffraction des rayons X avec iMosflm 27 pour générer un fichier de réflexion dans le groupe d'espace approprié. Généralement, α2β2StLes cristaux TS appartiennent au groupe spatial C 121 (C2).
            7. Mettez à l'échelle plusieurs observations de réflexions avec Scala 28 , implémenté dans le package CCP4 29 .
            8. Résoudre la structure de la haute résolution α2β2StComplexe TS par remplacement moléculaire en utilisant MolRep 30 et un modèle de recherche approprié. Inspectez le modèle et la carte de densité électronique dans Coot 31 après une solution de structure réussie.
              REMARQUE : Il existe de nombreuses structures de cristaux TS déposées dans la banque de données sur les protéines avec différents ligands. Pour une meilleure étape de remplacement moléculaire et une réduction du temps d'ajustement de la nouvelle structure cristalline, utilisez le meilleur modèle de recherche contenant le ou les ligands d'intérêt. Procédez au raffinement de la structure cristalline dans CCP4 29 , 30 ou Phenix 31 .
            9. Effectuez des ajustements manuels au modèle à l'aide de Coot 32 , suivi d'un raffinement automatique avec Refmac 29 , 33 ou phenix.refine 31, 34 . Construisez et affinez le modèle final en exécutant des cycles itératifs de création de modèles dans Coot 32 et un raffinement automatisé.
            10. Procéder au dépôt des facteurs de coordonnées et de structure sur le site Web de la banque de données sur les protéines.

            Abonnement requis. Veuillez recommander JoVE à votre bibliothécaire.

            Résultats représentatifs

            Purification de la α- et β-sous-unités de la tryptophane synthase
            Les α-sous-unité (αStTS) et la sous-unité β (βStTS) de la Salmonelle typhimurium tryptophane synthase ont été sous-clonés dans le vecteur pET SUMO modifié. Figure 1A montre des résultats SDS-PAGE représentatifs de deux bandes fortes correspondant au His6-SUMO-αStTS (voie αON) et His6-SUMO-βStProtéine de fusion TS (voie βON). Le protocole de purification décrit dans ce travail a permis la purification des deux sous-unités individuellement en 2 jours. Le premier jour a été utilisé pour purifier chaque protéine par chromatographie d'affinité Ni-NTA, précipitation au sulfate d'ammonium suivie d'un clivage His-SUMO-tag, élimination des traces His-SUMO-tag et concentration en protéines. Figure 1B et 1C afficher les résultats SDS-PAGE représentatifs de la α-sous-unité et le Purification des sous-unités β, respectivement. Le deuxième jour, le concentré α-sous-unité, β-sous-unité, et la α2β2 Stcomplexe TS du α- et les sous-unités β ont été chargées sur une colonne de chromatographie d'exclusion stérique. Figure 1D montre un profil d'élution typique de αStTS, βStTS, et α2β2StComplexes TS sur une colonne d'exclusion stérique S-200 HR. Figure 1E montre un résultat SDS-PAGE représentatif des fractions de pic collectées. Les fractions de pic les plus pures ont été regroupées, concentrées et le α2β2 StLe complexe TS a été utilisé pour les études de cristallisation des protéines.

            Purification du type sauvage et mutant α2β2 Stcomplexe TS
            Un autre protocole rapide et efficace pour purifier le type sauvage et la forme mutante du α2β2 S. typhimurium Le complexe tryptophane synthase est décrit dans ce travail. Figure 2 montre une représentation de la construction pEBA-10 contenant le gène de couplage traductionnel de type sauvage (trpA et trpB) codant pour le α- et β-sous-unités 22 . Le protocole de mutagenèse par PCR en deux étapes pour générer des formes mutantes du α2β2 StLe complexe TS est représenté dans figure 3.

            Les régions codantes du mutant α2β2 StLe complexe TS dans pEBA10 a été confirmé par séquençage d'ADN et utilisé pour transformer E. coli cellules de la souche CB149 26 . Le type sauvage et la forme mutante du α2β2 StLe complexe TS a été surexprimé et les protéines recombinantes ont été purifiées avec succès en 1 à 2 jours. Sulfate d'ammonium fractionnement à température ambiante facilement éliminé la plupart des protéines contaminantes du système d'expression hétérologue (Figure 4A, voies 20P, 30P et 40S). Un profil d'élution représentatif avec une position d'élution relative de α2β2 StLe complexe TS (143,06 kDa) sur une colonne de chromatographie d'exclusion stérique HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR est montré dans Figure 4B. La pureté des exclus fractions de pic la SDS-PAGE a-t-elle été analysée avant le regroupement (Figure 4C).

            Optimisation de type sauvage et mutant α2β2 cristallisation du complexe tryptophane synthase
            Aliquotes de type sauvage et mutant α2β2 StDes complexes TS à 15 mg ml -1 ont été utilisés pour mettre en place des plaques de gouttes assises à 24 puits. En règle générale, les gouttelettes constituées de 5 181 L de solution de protéines et du volume équivalent de solution réservoir ont été équilibrées contre 500 &# 181 L de solution réservoir (Figure 5). La spermine est nécessaire pour cristalliser le type sauvage et le mutant α2β2 StComplexe TS 22 . Alors que la concentration finale de spermine pour cristalliser le type sauvage est de 2 mM, la concentration de spermine pour cristalliser le complexe mutant dans ce travail s'est avérée légèrement plus élevée (4-8 mM).

            De gros monocristaux ont été obtenus grâce à une optimisation de cristallisation fine, en variant le pH du PEG 8000 (6-11 %) et du tampon bicine. Des cristaux de morphologies différentes sont apparus en 2 à 5 jours et les cristaux ont atteint leur taille maximale en deux semaines (Figure 6). Avant la collecte des données de diffraction des rayons X, les cristaux ont été trempés dans une solution cryoprotectrice (tampon de réservoir contenant jusqu'à 30% de diméthylsulfoxyde). Le processus optimisé a permis d'obtenir des cristaux de qualité adaptés aux mesures de diffraction des rayons X à une résolution proche de l'atome.

            Analyse des données de diffraction des rayons X
            Une structure cristalline de type sauvage α2β2 StLe complexe TS a été préparé avec les méthodes décrites dans cet article et les données de diffraction des rayons X ont été recueillies à une résolution proche de l'atome. Le cristal a été trempé dans une solution cryoprotectrice contenant un inhibiteur de F9 (2-(<[4-(trifluorométhoxy)phényl]sulfonyl>amino)éthyldihydrogénophosphate) et du L-tryptophane.

            Un ensemble complet de données de diffraction des rayons X a été collecté sur la ligne de faisceau synchrotron SIBYLS 12.3.1 à la source lumineuse avancée (Berkeley-CA) en faisant tourner le cristal de 360 ​​° par incréments de 0,5 ° 176. Les intensités de diffraction des rayons X ont été traitées et les statistiques de collecte de données sont résumées dans Tableau 1. L'analyse de symétrie indique que le cristal appartenait au groupe spatial monoclinique C2. Les paramètres de la cellule unitaire sont une = 182.55, b = 59.30, c = 67,37Å, α = 90,00, β = 94,82, γ = 90,00°. La valeur calculée du coefficient de Matthews (Vm = 2,57 Å 3 Da -1 ) suggère la présence d'une molécule d'hétérodimère TS (αβ StTS) dans l'unité asymétrique du cristal avec une teneur en solvant de 52,08 % 35 , 36 . Toutes les données de rayons X ont été recueillies à basse température (100 K) pour améliorer la qualité de la diffraction et diminuer la décroissance du rayonnement. Le α2β2 StLa structure cristalline TS dans le complexe a été résolue par la méthode de remplacement moléculaire en utilisant le type sauvage αβ StModèle TS en complexe avec l'inhibiteur F9 au site α et l'ion césium au site de coordination métallique (code ID PDB : 4HT3). Le fichier de coordonnées définitif et les facteurs de structure ont été déposés dans l'APB avec le code d'accession 5CGQ (Figure 7A). La structure cristalline du type sauvage α2β2 StComplexe TS avec inhibiteur F9 au site de l'enzyme α (Figure 7B), l'ion césium au site de coordination métallique (Figure 7C), le cofacteur pyridoxal 5'-phosphate lié de manière covalente à βLys87 (Figure 7D), et le produit L-tryptophane au site de l'enzyme β (Figure 7E) a été résolu à une résolution de 1,18 Angstrom. Le modèle 5CGQ est la résolution la plus élevée α2β2 StStructure cristalline TS déposée dans le PDB à ce jour.


            Figure 1 : Purification des sous-unités α et β et de la α2β2StComplexe TS. (A) Protéine recombinante expression. 12% de gel SDS-PAGE du profil d'expression nocturne de SUMO-αStTS (αON) et SUMO-βStTS (βON) après induction IPTG à 30 °C (α/⓴ avant induction IPTG). (B, C) Chromatographie d'affinité Ni-NTA suivie d'une précipitation au sulfate d'ammonium (saturation 60 %), (S) extrait brut clarifié (FT1) Passage de colonne Ni-NTA à travers l'échantillon (W) échantillon de lavage de colonne (E) échantillon d'éluat (60S) et (60P) ) les fractions de surnageant et de précipité après centrifugation à grande vitesse, respectivement (D) Le produit de digestion SUMO-protéase (FT2) Ni-NTA colonne traverse l'échantillon contenant le tag-less αStTS ou βStsous-unité TS. () profil d'élution de αStSous-unité TS (28,67 kDa), βStsous-unité TS (42,86 kDa) et α2β2 StComplexe TS (143,06 kDa) avec une colonne de chromatographie d'exclusion stérique HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR. Chaque course a été effectuée séparément. (E) Gels SDS-PAGE des exclus fractions de pic de chaque chromatographie individuelle. Alors que 15% Des gels SDS-PAGE ont été préparés pour analyser α2β2 StComplexe TS et αStSous-unité TS, un gel SDS-PAGE à 12% a été préparé pour analyser le βStsous-unité TS. Lane MW, marqueurs de poids moléculaire en kDa. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


            Figure 2 : Représentation de la construction pEBA-10. (UNE) Représentation du gène de couplage traductionnel de type sauvage (trpA et trpB) codant pour le α- et β-sous-unités de la tryptophane synthase de bactérie Salmonella enterica sérovar typhimurium (Yang, Ahmed et al. 1996). (B) Le vecteur contient un gène de résistance à l'ampicilline (amp), une origine de réplication (ori), un gène lacI q pour mieux arrêter un promoteur lac en l'absence d'inducteur IPTG et le promoteur réprimé LacI. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


            Figure 3 : Représentation globale du protocole de mutagenèse par PCR en deux étapes. Le vecteur pEBA-10 a été utilisé comme matrice d'ADN. Le premier cycle de PCR a été préparé avec les amorces TS-FW-NcoI et MUT-REV (une amorce inverse contenant une mutation) pour générer le premier fragment et les amorces TS-Rev-SacI et MUT-FW (une amorce directe contenant une mutation) pour générer le deuxième fragment). Les fragments ont été purifiés sur gel et combinés de manière équimolaire, dénaturés à la chaleur et recuits. Les brins recombinants ont été étendus avec de la polymérase et des désoxyribonucléotides. Le deuxième cycle de PCR a été préparé avec les amorces TS-FW-NcoI et TS-Rev-SacI. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


            Figure 4 : Purification du type sauvage et de la forme mutante de α2β2 StComplexe TS. (UNE) Gel SDS-PAGE à 12 % d'échantillons prélevés le long de la précipitation au sulfate d'ammonium en utilisant 20, 30, 40 et 50 % de saturation en sulfate d'ammonium à température ambiante : (CE) extrait brut (S) et (P) surnageant et fractions de précipité après haute- centrifugation rapide. (B) Profil d'élution de α2β2 StComplexe TS (143,06 kDa) avec une colonne de chromatographie d'exclusion stérique HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR. (C) 12% photo gel SDS-PAGE des exclus fractions de pic. Lane MW, marqueurs de poids moléculaire en kDa (Precision Plus Protein Unstained Standards, Bio-Rad). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


            Figure 5 : Optimisation de la cristallisation pour le type sauvage et la forme mutante de α2β2 StComplexe TS. Les cristaux ont été cultivés dans un tampon Bicine-CsOH 50 mM contenant 50 mM de CsCl2. Les concentrations de polyéthylène glycol 8000 (6-11 %) et de spermine (2-8 mM) ont été modifiées pour obtenir des formes de gros cristaux uniques pour effectuer des études structurelles par cristallographie des protéines aux rayons X. (UNE) Bicine-CsOH, pH 7,6. (B) Bicine-CsOH, pH 7,8. (C) Bicine-CsOH, pH 8,0. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


            Figure 6 : Photomicrographie de cristaux de type sauvage et de forme mutante de α2β2 StComplexe TS. Les cristaux diffèrent par leur morphologie, mais ils appartiennent au groupe spatial C2. Les cristaux ont atteint leur pleine dimension dans les conditions finales après deux semaines. Cristaux d'environ 0,20 x 0,15 x 0,10 mm. (A-D) Holo-cristaux PLP en complexe avec l'ion césium au site de coordination métallique de la forme de type sauvage (colonne A), forme mutante α2β2 βQ114A (colonne B), α2β2 βK167T (colonne C) et α2β2 βS377A (colonne D). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


            Figure 7 : Visualisation globale de la structure cristalline et validation des cartes de densité électronique obtenues après affinement de la structure cristalline. (UNE) structure cristalline du type sauvage α2β2 StComplexe TS avec l'inhibiteur F9 sur le site de l'enzyme (couleur jaune), l'ion césium sur le site de coordination du métal (couleur bleue), le cofacteur pyridoxal 5'-phosphate lié de manière covalente à βLys87 (couleur verte) et le produit L-tryptophane au site de l'enzyme β (couleur cyan) à une résolution de 1,18 Angstrom. Alors que la sous-unité α est colorée en bleu clair, la sous-unité β est colorée en saumon. (ÊTRE) Cartes de densité électronique contournées à 1,0 r.m.s. niveau autour (B) inhibiteur F9 (C) l'ion césium () pyridoxal-5′-phosphate, et (E) L-tryptophane. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

            Collecte et traitement des données
            Source de rayons X / Ligne de faisceau Ligne de lumière ALS 12.3.1
            Longueur d'onde (Å) 10,000
            Résolution (Å) 40.00 - 1.18 (1.24 - 1.18)
            Nombre total de réflexions 2151280 (252941)
            Nombre total de réflexions uniques 231646 (32187)
            Groupe d'espace pour l'indexation, la mise à l'échelle et la fusion C 1 2 1
            Dimensions de la cellule
            a, b, c (Å) 182.55, 59.30, 67.37
            α, β, γ (°) 90.00, 94.82, 90.00
            Mosaïque 0.61
            Matthews volume VM (Å 3 Da -1 ) 2.57
            Rmes (%) 8.6 (93.0)
            <I/σ(I)> 14.7 (3.0)
            CC1/2 (%) 0.999 (0.778)
            Complétude (%) 98.6 (94.2)
            Multiplicité 9.3 (7.9)
            Statistiques de raffinement
            Rtravail/Rlibre (%) 14.04 / 16.05
            Longueur de liaison RMSD (Å) 0.0120
            Angle de liaison RMSD (°) 14,059
            Ramachandran favorisé 515 (96.44%)
            Ramachandran autorisé 16 (3.00%)
            Ramachandran refusé 3 (0.56%)

            Tableau 1 : Collecte et traitement des données. Les valeurs entre parenthèses concernent l'enveloppe extérieure.

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            Discussion

            Nous avons conçu avec succès la forme mutante α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T et α2β2 βS377A StComplexes TS pour les études de corrélation structure-fonction. Dans un premier temps, nous avons essayé de purifier les mutants en utilisant un protocole de purification précédent 22 , ce qui nécessite α2β2 StCristallisation du complexe TS avec du PEG 8000 et de la spermine pendant la purification. Bien que le taux de cristallisation dépende de la forme mutante et de la concentration du complexe en solution, il est difficile de prédire lorsque des cristaux apparaissent dans un grand volume de solution. La cristallisation peut être réalisée soit après de longues périodes (48-96 h) soit en ajoutant des quantités supplémentaires de PEG 8000 après le début de la cristallisation 15 .

            Malheureusement, les formes mutantes de α2β2 StLes complexes TS présentés dans ce travail n'ont pas été purifiés avec succès à l'aide de ce protocole car ils n'ont pas réussi à cristalliser au cours des étapes initiales du protocole, ce qui nuit aux études cristallographiques. Par conséquent, nous avons créé un protocole de purification simple et efficace comprenant le fractionnement du sulfate d'ammonium et la chromatographie d'exclusion stérique, qui donnent des rendements élevés de type sauvage et de forme mutante de α2β2 StComplexe TS. Ce protocole est plus rapide (1-2 jours) et reproductible par rapport au protocole précédent (5-7 jours) 15, 22, car il n'y a pas d'exigences de cristallisation et de dépannage de protocole le long de la purification. De plus, nous avons créé de nouvelles constructions d'expression et un nouveau protocole pour purifier de grandes quantités de sous-unité α, de sous-unité β et de reconstituer α2β2 Stcomplexe TS des isolats.

            L'application future comprend la recombinaison de sous-unités de type sauvage et mutantes pour effectuer des études fonctionnelles et structurelles. Mutant α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T et α2β2 Complexe βS377A cristallisé dans des conditions contenant des concentrations plus élevées de spermine (4-8 mM) par rapport à la forme de type sauvage (2 mM). Par conséquent, il vaut la peine de consacrer du temps à améliorer la qualité des cristaux de protéines en faisant varier la concentration des précipitants et le pH du tampon. Des formes monocristallines de grande taille se sont développées de manière aléatoire dans une solution tamponnée de bicine (pH 7,6-8,0) contenant 6 à 11 % de PEG 8 000. Les méthodes décrites dans ce travail seront utilisées pour préparer des structures cristallines du type sauvage et des formes mutantes du α2β2 complexe avec différents ligands dans les sites actifs α et β, imitant différents intermédiaires et états de transition impliqués dans la conversion de l'indole et de la sérine en tryptophane. Les structures cristallines de ces mutants devraient fournir de nouvelles informations sur le mécanisme et les rôles joués par les résidus clés dans la synthèse du L-tryptophane.

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            Divulgations

            Les auteurs n'ont rien à divulguer et ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

            Remerciements

            Ce travail a été soutenu par le National Institute of Health des États-Unis (GM097569).


            Voir la vidéo: PCR and site directed mutagenesis (Juin 2022).


Commentaires:

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