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17.4 : Microscope - Biologie

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Objectifs du laboratoire

À la fin du laboratoire, l'étudiant devrait être capable de :

  • identifier quand un stéréomicroscope (microscope à dissection) par rapport à un microscope optique composé serait utilisé dans le laboratoire
  • décrire les principales différences entre les microscopes optiques et les microscopes électroniques
  • décrire la bonne façon de transporter un microscope
  • identifier les parties d'un microscope optique composé
  • décrire les étapes pour visualiser une lame sur un microscope optique composé
  • déterminer le grossissement total d'un objet observé par un microscope optique composé si on lui donne la lentille oculaire et
  • grossissements de l'objectif
  • expliquer pourquoi le champ de vision du microscope diminue à mesure que vous augmentez le grossissement

Ce que vous devriez pouvoir expliquer à quelqu'un d'autre après cet atelier :

  • Composé
  • Grossissement total
  • Binoculaire
  • Champ de vision
  • Profondeur de mise au point
  • Phénomène d'inversion

Diaporama

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Noter

Les microscopes optiques utilisés dans ce cours sont des instruments sensibles et coûteux qui sont manipulés par de nombreux étudiants tout au long du semestre. Ce laboratoire vous enseignera les informations et les compétences dont vous avez besoin pour utiliser et entretenir correctement les microscopes.

Fond

De nombreux organismes (bactéries) et parties d'organismes (cellules) que les biologistes étudient sont trop petits pour être vus à l'œil nu. Nous utilisons microscopes pour agrandir des spécimens pour notre enquête. Le mot microscope signifie « voir petit » et le premier microscope primitif a été créé en 1595.

Il existe plusieurs types de microscopes mais vous utiliserez principalement un microscope optique composé. Ce type de microscope utilise la lumière visible focalisée à travers deux lentilles, l'oculaire et l'objectif, pour visualiser un petit spécimen. Seules les cellules suffisamment minces pour laisser passer la lumière seront visibles au microscope optique dans une image bidimensionnelle.

Un autre microscope que vous utiliserez en laboratoire est un stéréoscopique ou un microscope à dissection. Ce type de microscope utilise la lumière visible pour voir des spécimens plus épais et plus gros, comme un insecte, en 3D. Étant donné que vous visualisez des échantillons plus volumineux, la plage de grossissement du microscope à dissection est inférieure à celle du microscope optique composé.

Votre instructeur passera en revue les pièces et les fonctions des microscopes optiques composés que nous utiliserons tout au long du semestre. Remplissez le tableau de la page suivante pour vous aider à vous souvenir de cette information importante. Vous vous référerez probablement fréquemment à cette page. Voici une photo d'un microscope optique pour que vous puissiez étiqueter et prendre des notes.

Partie de MicroscopeFonction
Oculaires (oculaires)
Bras
Tour de nez
Organiser
Objectifs
Clips de diapositives
Bouton de commande de scène
Condenseur
diaphragme à iris
Lampe de sous-scène (Illuminateur)
Ajustement grossier
Réglage précis
Base

Règles et instructions d'utilisation des microscopes optiques composés

Votre instructeur discutera de l'utilisation du microscope avec votre classe. Les étapes appropriées à suivre pour une mise au point correcte seront examinées. Vous devez suivre la séquence étape par étape comme l'indique votre instructeur. Même si vous êtes familiarisé avec ce type de microscope, vous devez toujours passer à travers la révision de la mise au point avec le reste de la classe.

  1. Règles générales importantes :
    1. Portez toujours le microscope à 2 mains—placez une main sur le bras du microscope et l'autre sous la base du microscope.
    2. Ne touchez pas les lentilles des objectifs (c'est-à-dire les pointes des objectifs).
    3. Gardez les objectifs en position de numérisation et maintenez la platine basse lors de l'ajout ou du retrait de diapositives.
    4. Regardez toujours le microscope de côté lorsque vous modifiez considérablement la hauteur de la platine.
    5. Les lentilles des objectifs ne doivent être nettoyées qu'avec du papier spécial lentilles et un liquide de nettoyage pour lentilles.
    6. Ne jouez PAS aux bricoleurs, aucun microscope ne doit être démonté. Signalez les dysfonctionnements à votre instructeur.
  2. Pour obtenir un microscope dans une armoire de laboratoire :
    1. Première zone dégagée sur la table pour le microscope - évitez une zone de travail encombrée.
    2. Les microscopes sont numérotés en fonction de l'endroit où vous êtes assis. Trouvez le numéro sous votre paillasse et utilisez le microscope correspondant.
    3. Portez le microscope à DEUX mains.
    4. Fixez le cordon électrique, ne le laissez pas pendre de la table !
  3. Lors du retour du microscope dans l'armoire du laboratoire :
    1. Abaissez la scène.
    2. Faites pivoter l'objectif de numérisation en position sur la scène.
    3. Retirez votre diapositive de la scène.
    4. Nettoyez la lame et l'objectif à l'aide du liquide de nettoyage spécial lentille et du papier fournis.
    5. Centrez la scène afin qu'elle ne dépasse pas trop loin de chaque côté.
    6. Fixez le cordon en l'enroulant sous la platine du microscope.
    7. Replacez le couvercle anti-poussière.
    8. Portez le microscope à DEUX mains.
    9. Remettez le microscope dans le même casier d'où vous l'avez obtenu en veillant à le mettre dans les bras.
  4. Pour mettre le microscope au point :
    Regardez le microscope de côté :
    1. Abaissez la scène aussi loin que possible.
      1. Faites pivoter les objectifs de sorte que l'objectif de numérisation pointe vers la platine.
      2. Ajustez la scène de sorte que l'ouverture (l'ouverture au milieu de la scène) soit centrée.
      3. Placez votre diapositive sur la scène, en utilisant la pince de scène pour la fixer. La pince de scène se déplace uniquement dans le plan horizontal de la scène et sécurise la glissière en touchant à peine le coin inférieur droit de la glissière.
      4. Centrez l'échantillon sur votre lame sous l'objectif en déplaçant la platine.
      5. Déplacez la scène presque aussi loin que possible, en faisant attention à ne pas laisser la glissière toucher l'objectif – regardez de côté pour voir à quelle hauteur élever la scène.
    2. Regardez dans les oculaires :
      1. Utilisez le bouton de réglage grossier pour déplacer la platine vers le bas jusqu'à ce que votre échantillon soit mis au point, puis affinez la mise au point.
      2. Centrez l'échantillon dans le champ du microscope en déplaçant la platine.
    3. Regardez au microscope de côté :
      1. Faites pivoter lentement l'objectif de faible puissance (10X) en position.
    4. Regardez dans les oculaires :
      1. Aiguisez la mise au point, si nécessaire, avec le bouton de réglage grossier. Seul un minimum d'ajustement est généralement nécessaire.
      2. Centrez l'échantillon dans le champ, si nécessaire.
    5. Regardez le microscope de côté :
      1. Faites pivoter l'objectif haute puissance en place très soigneusement!
    6. Regardez dans les oculaires :
      1. A l'aide du bouton de réglage fin uniquement, affinez la mise au point. Recentrer si nécessaire. (Si votre échantillon a « disparu », revenez immédiatement à faible puissance et recentrez l'échantillon.)
      2. Lorsque vous retirez une diapositive, remettez toujours les objectifs en position de numérisation et abaissez la platine avant de soulever la diapositive !

Partie 1 : Grossissement total

Grossissement est le rapport entre la taille de l'image au microscope et la taille réelle de l'objet. Lorsque vous dites que le grossissement est de 10, l'image que vous voyez au microscope est dix fois plus grande que celle de l'échantillon à l'œil nu. N'oubliez pas qu'avec un microscope optique composé, vous grossissez avec deux lentilles, donc pour calculer le grossissement total, vous multipliez le grossissement de l'objectif par le grossissement oculaire. Regardez le microscope et utilisez le tableau ci-dessous pour calculer le grossissement total pour chaque objectif :

ObjectifLentille oculaire= Grossissement total
Objectif d'analyse
Objectif bas
Objectif élevé

Partie 2 : Phénomène d'inversion

Procurez-vous une diapositive de lettre « e » disponible dans la classe. Regardez la lame avec vos yeux, puis placez-la sur le microscope. Utilisez la séquence de mise au point pour visualiser la diapositive à faible puissance.

Procédure

  1. Dessinez la lettre « e » telle qu'elle apparaît lorsque vous regardez la lame sans le microscope.
  2. Dessinez la lettre « e » telle qu'elle apparaît lorsque vous regardez la lame sous le microscope.
  3. Déplacez votre diapositive vers la droite à l'aide du levier de scène mécanique tout en regardant à travers les oculaires. Dans quel sens le « e » se déplace-t-il ?
  4. Éloignez votre diapositive de vous à l'aide du levier de scène mécanique tout en regardant à travers les oculaires. Dans quel sens le « e » se déplace-t-il ?

Énoncez le phénomène d'inversion dans vos propres mots.

Partie 3 : Champ de vision

Les champ de vision est la quantité de spécimen que vous voyez lorsque vous regardez à travers les objectifs. Le champ de vision diminue à des grossissements plus élevés.

Procédure

Placez une règle en plastique bleu à travers l'ouverture de la scène de sorte que le bord de la règle soit visible sous la forme d'une ligne verticale le long du diamètre du champ. Estimez la taille du champ en millimètres pour chacun des objectifs.

Balayage __________ Faible (10X) __________ Élevé (40X) __________

Partie 4 : profondeur de champ

Les profondeur de champ est l'épaisseur de l'échantillon qui reste au point à un grossissement donné. La profondeur de champ diminue à des grossissements plus élevés.

Procédure

Obtenez une diapositive de fils de couleur et visualisez-la sous balayage ou à faible puissance. Ensuite, déterminez quelle couleur de fil est :

  • Au sommet
  • Au milieu
  • En bas

Astuce : en utilisant les instructions de mise au point, concentrez-vous sur la zone où les trois fils se croisent. Utilisez la mise au point fine pour discerner l'ordre des fils.

Partie 5 : Faire un support humide

Tout au long du semestre, vous devrez réussir un certain nombre de préparations de diapositives simples appelées « montages humides ». L'échantillon à observer est placé sur une lame propre, une ou deux gouttes d'eau ajoutées et une lamelle soigneusement placée sur l'eau et l'échantillon. Votre instructeur vous montrera cette technique.

Faites un montage humide d'eau de bassin en suivant la procédure ci-dessous :

  1. Placez une goutte d'eau du bassin sur une lame de verre propre à l'aide de la pipette jetable en plastique.
  2. Couvrir l'eau de l'étang sur le toboggan avec une lamelle. Essayez de placer la lamelle en biais pour attirer les bulles d'air.
  3. Essuyez tout excès de liquide sur votre lame.
  4. Placer la lame sur le microscope pour observer l'échantillon.
    1. Démarrer sur l'objectif de numérisation
    2. Basculez soigneusement vers les objectifs bas et haut si nécessaire.

J'espère que vous verrez des organismes vivants dans l'eau de votre étang. Si vous voyez du matériel vert, il s'agit probablement d'une sorte de plante. Regardez pour voir s'il y a quelque chose qui bouge. Dans l'espace ci-dessous, décrivez ce que vous observez au microscope et dessinez une image simple.

Partie 6 : Microscope à dissection stéréoscopique

Votre instructeur démontrera l'utilisation appropriée de la lunette de dissection. Ces microscopes donnent généralement un grossissement inférieur à celui du microscope composé que vous utilisez.

Procédure

Voir les échantillons disponibles à la table de laboratoire à l'aide du microscope à dissection. Notez que le microscope a deux sources lumineuses, une de la base et une d'en haut. Les spécimens ne sont pas toujours montés sur une lame. Notez également que lorsque vous regardez des objets sous le microscope à dissection, ils sont en trois dimensions.

Questions de laboratoire

  1. Énumérez deux façons dont un microscope à dissection stéréoscopique diffère d'un microscope composé.
  2. Quel microscope, la lumière composée ou le microscope à dissection, a un grossissement inférieur ?

Nettoyage et entretien du microscope

  1. Décrivez comment et avec quoi vous devez nettoyer la lentille du microscope.
  2. Énumérez quatre choses que vous devez faire lorsque vous avez fini d'utiliser le microscope à la fin du laboratoire.

17.4 : Microscope - Biologie

La résolution ultime d'un appareil à couplage de charge (CCD) ou semi-conducteur à oxyde métallique complémentaire (CMOS) capteur d'image est fonction du nombre de photodiodes et de leur taille par rapport à l'image projetée sur la surface de la matrice d'imagerie par le système optique du microscope. Lorsque vous essayez de faire correspondre la résolution optique du microscope à une combinaison spécifique d'appareil photo numérique et de coupleur vidéo, utilisez cette calculatrice pour déterminer la densité de pixels minimale nécessaire pour capturer correctement toutes les données optiques du microscope.

Le didacticiel s'initialise avec un spécimen choisi au hasard apparaissant dans le Image du spécimen fenêtre (boîte noire) et délimité par l'ouverture de l'oculaire ou le diaphragme de champ de l'objectif de projection. Un rectangle de couleur désignant les dimensions du CCD (2/3 pouces par défaut) est superposé à l'image pour révéler la zone réelle de l'échantillon qui est capturée par le capteur. Dans les cases grises, jaunes et rouges sous les curseurs, le microscope Résolution optique (gris), CCD Taille de pixel requise (jaune), Taille optimale de la matrice CCD (jaune), Agrandissement du moniteur (rouge) et Grossissement total (rouge) de l'image sont présentés en micromètres ou en produit. Ces valeurs sont continuellement mises à jour au fur et à mesure que les curseurs sont traduits. Un nouveau Format CCD (taille) peut être sélectionné à l'aide des boutons radio apparaissant à gauche de la Image du spécimen la fenêtre. Le physique Dimensions CCD du capteur sélectionné (en millimètres) sont affichés sur le côté droit de la fenêtre d'image le long d'un rectangle ayant le même rapport hauteur/largeur que la puce d'imagerie.

Pour exécuter le didacticiel, déplacez le Ouverture numérique et Grossissement de l'objectif curseurs (les valeurs apparaissent au-dessus des barres de curseur) pour définir les valeurs appropriées pour la configuration optique du microscope à considérer. Ensuite, choisissez un oculaire ou une lentille de projection Numéro de champ (valeurs comprises entre 18 et 26 millimètres) et Coupleur vidéo grossissement (entre 0,5x et 1,0x). Au fur et à mesure que le curseur du coupleur est déplacé, la taille du rectangle superposé à l'image de l'échantillon est modifiée par le didacticiel pour correspondre à la zone de l'échantillon capturée par le capteur CCD. Un nouveau spécimen peut être sélectionné à tout moment en utilisant le Choisissez un spécimen menu déroulant.

L'efficacité de la capture d'images générées par un microscope optique sur la matrice de photodiodes d'un capteur d'image CCD ou CMOS dépend de plusieurs facteurs, allant du grossissement de l'objectif, de l'ouverture numérique et de la résolution à la taille de la matrice de photodiodes du capteur d'image électronique, le rapport hauteur/largeur , le grossissement du coupleur vidéo et les dimensions des éléments photosensibles individuels dans le réseau. De plus, les paramètres spécifiques à l'échantillon à imager, tels que le contraste, le rapport signal/bruit, la plage dynamique intrascène et le temps d'intégration, doivent également être pris en compte.

La résolution optique ultime d'un CCD est fonction du nombre de photodiodes et de leur taille par rapport à l'image projetée sur la surface du réseau par le système de lentilles du microscope. Les matrices CCD actuellement disponibles varient en taille de plusieurs centaines à plusieurs milliers de pixels. Les tailles de matrices modernes utilisées dans les appareils destinés aux enquêtes scientifiques vont de 1000 × 1000 à 5000 × 5000 éléments de capteur. La tendance dans la fabrication de CCD grand public et de qualité scientifique est que la taille du capteur diminue continuellement, et des appareils photo numériques avec des photodiodes aussi petites que 4 × 4 micromètres sont actuellement disponibles.

Une résolution adéquate d'un échantillon imagé avec les éléments optiques d'un microscope ne peut être obtenue que si au moins deux échantillons sont prélevés pour chaque unité résoluble, bien que de nombreux chercheurs préfèrent trois échantillons par unité résoluble pour assurer un échantillonnage suffisant. Dans les instruments optiques à diffraction limitée, tels que le microscope, la limite d'Abbe de la résolution optique à une longueur d'onde moyenne de la lumière visible (550 nanomètres) est de 0,20 micromètre lors de l'utilisation d'un objectif ayant une ouverture numérique de 1,4. Dans ce cas, une taille de capteur de 10 micromètres carrés serait juste assez grande pour permettre de faire correspondre la résolution optique et électronique, avec une taille de capteur de 7 × 7 micromètres préférée. Bien que des photodiodes plus petites dans un capteur d'image CCD améliorent la résolution spatiale, elles limitent également la plage dynamique de l'appareil.

Tableau 1 - Exigences de taille de pixel pour faire correspondre la résolution optique du microscope

Objectif
(Ouverture numérique)
Résolution
Limite
(Micromètres)
Projeté
Taille
(Micromètres)
Pixel requis
Taille
(Micromètres)
1x (0,04) 6.9 6.9 3.5
2x (0,06) 4.6 9.2 4.6
2x (0,10) 2.8 5.6 2.8
4x (0,10) 2.8 11.2 5.6
4x (0,12) 2.3 9.2 4.6
4x (0,20) 1.4 5.6 2.8
10x (0,25) 1.1 11.0 5.5
10x (0,30) 0.92 9.2 4.6
10x (0,45) 0.61 6.1 3.0
20x (0,40) 0.69 13.8 6.9
20x (0,50) 0.55 11.0 5.5
20x (0,75) 0.37 7.4 3.7
40x (0,65) 0.42 16.8 8.4
40x (0,75) 0.37 14.8 7.4
40x (0,95) 0.29 11.6 5.8
40x (1.00) 0.28 11.2 5.6
40x (1,30) 0.21 8.4 4.2
60x (0,80) 0.34 20.4 10.2
60x (0,85) 0.32 19.2 9.6
60x (0,95) 0.29 17.4 8.7
60x (1,40) 0.20 12.0 6.0
100x (0,90) 0.31 31.0 15.5
100x (1,25) 0.22 22.0 11.0
100x (1,30) 0.21 21.0 10.5
100x (1,40) 0.20 20.0 10.0

En microscopie, l'image est généralement projetée par le système optique sur la surface d'un détecteur, qui peut être la rétine d'un œil humain, un capteur d'image électrique ou l'émulsion chimique sensible sur un film traditionnel. Afin d'optimiser le contenu informationnel de l'image résultante, la résolution du détecteur doit correspondre étroitement à celle du microscope. Le spectre de longueur d'onde de la lumière visible utilisé pour créer l'image d'un échantillon est l'un des facteurs déterminants dans les performances du microscope en ce qui concerne la résolution optique. Les longueurs d'onde plus courtes (375-500 nanomètres) sont capables de résoudre les détails à un degré plus élevé que les longueurs d'onde plus longues (supérieures à 500 nanomètres). Les limites de la résolution spatiale sont également dictées par la diffraction de la lumière à travers le système optique, un terme généralement appelé diffraction limitée résolution. Les chercheurs ont dérivé plusieurs équations qui ont été utilisées pour exprimer la relation entre l'ouverture numérique, la longueur d'onde et la résolution optique :

Formule 1 - Ouverture numérique, longueur d'onde et résolution optique

Formule 2 - Ouverture numérique, longueur d'onde et résolution optique

Formule 3 - Ouverture numérique, longueur d'onde et résolution optique

r est la résolution (la plus petite distance pouvant être résolue entre deux points de l'échantillon), N / A est égal à l'ouverture numérique de l'objectif, est égal à la longueur d'onde, NA(Obj) est égal à l'ouverture numérique de l'objectif, et NA (Cond) est l'ouverture numérique du condensateur. Notez que l'équation (1) et (2) diffèrent par le facteur de multiplication, qui est de 0,5 pour l'équation (1) et 0,61 pour l'équation (2). Ces équations sont basées sur un certain nombre de facteurs, y compris une variété de calculs théoriques effectués par des physiciens optiques pour expliquer le comportement des objectifs et des condensateurs, et ne doivent pas être considérées comme une valeur absolue d'une loi physique générale. L'hypothèse est que deux sources lumineuses ponctuelles peuvent être résolues (imagées séparément) lorsque le centre du disque d'Airy généré par l'une des sources chevauche la réflexion du premier ordre dans le diagramme de diffraction du deuxième disque d'Airy, une condition connue sous le nom de Critère de Rayleigh. Dans certains cas, tels que la microscopie à fluorescence confocale et multiphotonique, la résolution peut en fait dépasser les limites imposées par l'une de ces trois équations. D'autres facteurs, tels qu'un faible contraste de l'échantillon et un éclairage inapproprié, peuvent réduire la résolution et, le plus souvent, la valeur maximale réelle de r (environ 0,20 micron en utilisant une longueur d'onde à mi-spectre de 550 nanomètres) et une ouverture numérique de 1,35 à 1,40 ne sont pas réalisées en pratique.

Lorsque le microscope est parfaitement aligné et que les objectifs sont correctement adaptés au condenseur de la sous-étage, la valeur d'ouverture numérique de l'objectif peut être remplacée par des équations (1) et (2), avec le résultat supplémentaire que l'équation (3) réduit à l'équation (2). Un concept important à noter est que le grossissement n'apparaît comme un facteur dans aucune de ces équations, car seules l'ouverture numérique et la longueur d'onde de l'éclairage déterminent la résolution de l'échantillon. Comme mentionné ci-dessus (et peut être observé dans les équations), la longueur d'onde de la lumière est un facteur important dans la résolution d'un microscope. Des longueurs d'onde plus courtes donnent une résolution plus élevée (valeurs plus faibles pour r) et vice versa. Le plus grand pouvoir de résolution en microscopie optique est obtenu avec la lumière ultraviolette proche, la longueur d'onde d'imagerie efficace la plus courte. La lumière proche de l'ultraviolet est suivie par la lumière bleue, puis verte et enfin rouge dans la capacité de résoudre les détails de l'échantillon. Dans la plupart des cas, les microscopistes utilisent une lumière blanche à large spectre générée par une ampoule tungstène-halogène pour éclairer l'échantillon. Le spectre de la lumière visible est centré à environ 550 nanomètres, la longueur d'onde dominante pour la lumière verte (nos yeux sont les plus sensibles à la lumière verte). C'est cette longueur d'onde qui a été utilisée pour calculer les valeurs de résolution pour le didacticiel et présentée dans le tableau 1. La valeur d'ouverture numérique est également importante dans ces équations et des ouvertures numériques plus élevées produiront également une résolution plus élevée (voir tableau 1).

Auteurs contributeurs

Matthew J. Parry-Hill, Kimberly M. Vogt, John D. Griffin, et Michael W. Davidson - National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Floride, 32310.

Produits Nikon connexes

Optique

Les objectifs Nikon de classe mondiale, y compris l'optique à l'infini CFI60 renommée, offrent des images brillantes d'une netteté et d'une clarté époustouflantes, du grossissement ultra-faible au grossissement le plus élevé.

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Découverte et détection

Les virus ont été découverts pour la première fois après le développement d'un filtre en porcelaine, le filtre Chamberland-Pasteur, capable d'éliminer toutes les bactéries visibles au microscope de tout échantillon liquide. En 1886, Adolph Meyer a démontré qu'une maladie des plants de tabac, la maladie de la mosaïque du tabac, pouvait être transférée d'une plante malade à une plante saine via des extraits de plantes liquides. En 1892, Dmitri Ivanowski montra que cette maladie pouvait être transmise de cette manière même après que le filtre Chamberland-Pasteur eut éliminé toutes les bactéries viables de l'extrait. Pourtant, il a fallu de nombreuses années avant qu'il ne soit prouvé que ces agents infectieux «filtrables» n'étaient pas simplement de très petites bactéries, mais étaient un nouveau type de très petites particules causant des maladies.

Plus virions , ou particules virales uniques, sont très petites, d'environ 20 à 250 nanomètres de diamètre. Cependant, certains virus récemment découverts provenant d'amibes ont un diamètre allant jusqu'à 1000 nm. À l'exception des grands virions, comme le poxvirus et d'autres grands virus à ADN, les virus ne peuvent pas être vus au microscope optique. Ce n'est qu'avec le développement du microscope électronique à la fin des années 1930 que les scientifiques ont eu leur première bonne vision de la structure du virus de la mosaïque du tabac (TMV) (Figure 1), discuté ci-dessus, et d'autres virus (Figure 2). La structure de surface des virions peut être observée à la fois par microscopie électronique à balayage et à transmission, tandis que les structures internes du virus ne peuvent être observées que sur des images d'un microscope électronique à transmission. L'utilisation de la microscopie électronique et d'autres technologies a permis la découverte de nombreux virus de tous les types d'organismes vivants.

Figure 2. Dans ces micrographies électroniques à transmission, (a) un virus est éclipsé par la cellule bactérienne qu'il infecte, tandis que (b) ces cellules d'E. coli sont éclipsées par les cellules du côlon en culture. (crédit a : modification du travail par le U.S. Dept. of Energy, Office of Science, LBL, PBD crédit b : modification du travail par J.P. Nataro et S. Sears, données inédites, données de la barre d'échelle CDC de Matt Russell)


Top 10 des expériences sur les plantes (avec diagramme)

Vous êtes à la recherche d'expériences sur les Plantes ? Vous êtes au bon endroit. L'article mentionné ci-dessous comprend une collection de dix expériences sur les plantes : 1. Distribution des pigments végétaux 2. Ascension de la sève chez les plantes 3. Guttation chez les plantes 4. Transpiration chez les plantes 5. Nutrition minérale chez les plantes 6. Photosynthèse 7. Respiration chez les plantes 8 Taux de croissance des plantes 9. Croissance des plantes par la promotion de substances 10. Biotechnologie.

  1. Expériences sur la distribution des pigments végétaux
  2. Expériences sur la remontée de la sève chez les plantes
  3. Expériences sur la guttation chez les plantes
  4. Expériences sur la transpiration chez les plantes
  5. Expériences sur la nutrition minérale des plantes
  6. Expériences sur la photosynthèse
  7. Expériences sur la respiration chez les plantes
  8. Expériences sur le taux de croissance des plantes
  9. Expériences sur la croissance des plantes par la promotion de substances
  10. Expériences sur la biotechnologie

1. Expériences sur la distribution des pigments végétaux :

But de l'expérience :

Pour détecter la présence d'anthoxanthine dans les tissus végétaux.

Fleurs blanches de toute plante, ammoniac concentré, bain-marie, alcool, alcali, HCl, acétate de plomb basique, chlorure ferrique.

1. Des fleurs blanches ou des pétales de fleurs blanches de la plante donnée (par exemple, Phlox ou Chrysanthème) sont mis en contact avec quelques gouttes d'ammoniac concentré. Une couleur jaune est obtenue.

2. Extraire les fleurs blanches au bain-marie avec de l'alcool aqueux.

3. Décantez l'extrait et divisez-le en trois portions :

(i) À une portion, ajoutez un alcali. La couleur passe au jaune. Acidifier cela en ajoutant quelques gouttes d'HCl. La couleur disparaît.

(ii) À la deuxième portion, ajouter une solution basique d'acétate de plomb. Un précipité jaune ou orange se forme.

(iii) À la troisième portion de l'extrait, ajoutez une solution de chlorure ferrique. Une couleur verte ou brune apparaît.

Tous ces trois tests indiquent la présence d'anthoxanthines dans le matériau.

2. Expériences sur l'ascension de la sève chez les plantes :

But de l'expérience :

Démontrer que l'eau monte à travers le xylème de la plante.

Une usine de baume, un grand tube à essai, un support pour tube à essai, de l'eau, du coton, une tache d'éosine, un rasoir, des lames, de la glycérine, un microscope, une lamelle.

1. Prenez une plante de baume complète avec des racines, une tige, des feuilles et des fleurs.

2. Conservez la plante dans un grand tube à essai contenant une solution d'éosine.

3. Fixez un tampon de coton à l'embouchure du tube à essai et laissez l'expérience au repos pendant 2-3 heures (Fig. 14).

4. Coupez la section transversale de la tige avec un rasoir, placez-la sur lame et étudiez au microscope.

On observe que les bases des pétioles et les pétales sont devenus roses. Dans la section transversale de la tige, seul le xylème a pris la tache.

La coloration rose des bases des pétioles et des pétales indique que la coloration à l'éosine a atteint les bases des pétioles et les fleurs à travers la tige des racines et les feuilles. L'étude de la coupe transversale au microscope révèle que seules les cellules du xylème sont colorées, indiquant ainsi que la solution s'est déplacée à travers le xylème.

3. Expériences sur la guttation chez les plantes :

But de l'expérience :

Démontrer le processus de guttation avec une plante entière en pot.

Une plante en pot de capucine de jardin, de l'eau, une cloche (Au lieu de capucine de jardin d'autres plantes comme des plants d'avoine, des plants de blé, de tomate, de Colocasia, etc. peuvent également être prises).

1. Prenez une plante en pot de capucine de jardin et arrosez-la copieusement.

2. Couvrez le pot le long de la plante avec une cloche et placez-le dans un endroit frais et sombre.

3. Connecter l'appareil à un aspirateur et le rendre étanche à l'air (Fig. 17).

4. Gardez l'expérience pendant quelques heures et observez les changements.

Une lente exsudation d'eau commence à l'extrémité de chaque feuille. Ces gouttes d'eau grossissent progressivement et peuvent tomber ou couler sur le côté de la feuille.

Cette exsudation d'eau est due au phénomène de guttation. Lorsque la plante est abondamment arrosée, l'eau est forcée des vaisseaux du xylème à travers les espaces intercellulaires et hors de la plante à partir de structures ressemblant à des pores (appelées hydathodes, pores d'eau ou stomates d'eau, Fig. 19) présentes sur les marges des feuilles.

L'eau exsude par les hydathodes à l'aide d'une pression développée dans la sève des éléments du xylème. On pense qu'il s'agit d'une pression identique à la pression radiculaire. L'eau exsudée contient également des acides aminés, des sels minéraux, des sucres et des traces d'autres solutés.

La guttation se produit en abondance lorsque les conditions sont telles que l'absorption d'eau par les racines est très élevée et que le taux de transpiration est très lent. La guttation peut également être démontrée avec une seule feuille de capucine fraîchement coupée lorsqu'elle est fixée à une extrémité d'un tube en U muni d'un bouchon en liège et rempli d'eau. De l'autre extrémité du tube en U, ajoutez une petite quantité de mercure qui aide à forcer l'eau dans le pétiole.

4. Expériences sur la transpiration chez les plantes :

But de l'expérience :

Comparer la transpiration stomatique et cuticulaire des feuilles de différentes plantes par la méthode au chlorure de cobalt.

Feuilles des plantes à comparer pour la transpiration (de préférence elles doivent être élaborées dans l'état ci-joint), solution à 3% de chlorure de cobalt, papier filtre, lames, pinces, pinces, chronomètre, dessiccateur, chlorure de calcium anhydre et vaseline.

(a) Préparation des disques de chlorure de cobalt :

1. Préparez une solution à 3 % de chlorure de cobalt et trempez-y les papiers filtres.

2. Retirez l'excès de solution de chlorure de cobalt des papiers filtres en les pressant avec un rouleau en caoutchouc et laissez-les sécher.

3. Couper le papier filtre en petits disques de diamètre défini, les faire sécher absolument dans une étuve à 30°-40°C et les conserver dans un dessiccateur. Les disques secs sont de couleur bleue.

(b) Comparaison de la perte d'eau des deux surfaces foliaires :

4. Prenez une feuille de la plante et placez un disque de papier de chlorure de cobalt sur sa surface supérieure et un sur sa surface inférieure. Pressez-les avec des lames de verre propres.

5. Clipsez les deux glissières ensemble avec deux clips séparés, étanchéisez-les avec de la vaseline et démarrez le chronomètre (Fig. 24).

6. Notez le temps pendant lequel la couleur bleue du disque devient rose.

7. Répétez la même expérience avec les feuilles des autres plantes à comparer pour le taux de transpiration.

Les observations mentionnées ci-dessus indiquent que le temps nécessaire pour passer du bleu au rose sur la face inférieure des feuilles est inférieur à celui de la face supérieure.

Parce que la couleur change rapidement sur la surface inférieure que sur la surface supérieure dans toutes les feuilles élaborées, on peut donc conclure que plus d'eau a transpiré de la surface inférieure, et donc plus de stomates sont présents sur cette surface que la surface supérieure.

5. Expériences sur la nutrition minérale des plantes :

But de l'expérience :

Démontrer une expérience de culture de l'eau pour montrer la nutrition minérale des plantes.

Sept grands bocaux en verre, liège fendu, plants de presque même taille (soit de maïs, d'avoine, de tomate ou de tabac), solution nutritive de Sach (solution normale ainsi que des solutions avec carence en calcium, carence en azote, carence en potassium, carence en phosphore, carence en fer et carence en magnésium), papier noir.

(A) Préparation de la solution nutritive normale Sach’s :

La composition suivante fait la solution nutritive normale de Sach’s :

(B) Préparation de la solution nutritive Sach’s avec différentes carences :

(a) Solution pour carence en calcium :

Au lieu du sulfate de calcium et du phosphate de calcium, utilisez du sulfate de potassium et du phosphate de sodium.

(b) Solution pour la carence en azote :

Au lieu du nitrate de potassium, utilisez du chlorure de potassium.

(c) Solution pour carence en phosphore :

Au lieu du phosphate de calcium, utilisez du nitrate de calcium.

(d) Solution pour carence en potassium :

Au lieu du nitrate de potassium, utilisez du nitrate de sodium.

(e) Solution pour la carence en fer :

Ne pas utiliser de sulfate ferreux.

(f) Solution pour carence en magnésium :

A la place du sulfate de magnésium, utilisez du sulfate de potassium.

1. Prenez sept grands bocaux en verre et nettoyez-les soigneusement à l'eau chaude et enfin à l'eau distillée.

2. Dans un pot, remplissez la solution nutritive normale de Sach’s et dans les six pots restants, remplissez les solutions présentant une carence en calcium, azote, phosphore, potassium, fer et magnésium, respectivement. Marquez tous ces pots comme Normal, Ca, N, P, K, Fe et Mg avec un crayon à verre (Fig. 33).

3. Prenez de jeunes plants de taille presque égale aux plantes (soit d'avoine, de maïs, de tomate ou de tabac), placez-les dans sept bouchons fendus différents et fixez un bouchon fendu dans chacun des pots de manière à ce que les racines des plantules sont plongés dans les solutions.

4. Enveloppez les pots de papier noir pour vérifier la croissance des algues et maintenez-les dans des conditions lumineuses et chaudes.

5. Changez le liquide presque tous les jours avec un nouveau et notez les changements pendant environ un mois.

La croissance et la santé générale des plantules sont tout à fait normales dans la solution normale alors qu'elles sont différentes, rabougries ou vérifiées de plusieurs manières dans les solutions présentant une carence en tel ou tel élément.

Les effets de la carence en différents minéraux sont différents selon les plantes.

6. Expériences sur la photosynthèse :

But de l'expérience :

Montrer que le dioxyde de carbone est nécessaire à la photosynthèse.

Deux cloches, plante en pot, aspirateur, béchers, chaux sodée, potasse caustique, plaque de verre (2), un peu de matière inerte, deux tubes larges terminés en tube fin, graisse, iode.

1. Prenez deux plantes en pot et placez-les dans l'obscurité pendant deux jours pour les désamidonner.

2. Placez les pots sur une plaque de verre et couvrez-les d'une cloche.

3. L'embouchure des deux cloches est munie d'un bouchon à deux trous. A travers un trou est inséré un tube à large ouverture se terminant par un tube fin et à travers l'autre trou un tube coudé est installé qui reste connecté à un aspirateur (Fig. 35).

4. Le tube à large ouverture d'une cloche est rempli de chaux sodée. Dans la cloche, placez deux béchers contenant de la potasse caustique.

5. Le tube à large ouverture d'une autre cloche est rempli d'un matériau inerte comme des cailloux, et dans cette cloche, placez deux béchers contenant de l'eau à la place de la potasse caustique. Cela fonctionne comme un contrôle.

6. Appliquez de la graisse à la base de la cloche pour empêcher l'air de passer, et maintenez les deux appareils au soleil pendant quelques heures, et observez.

Testez les feuilles des deux plantes pour l'amidon séparément. Les feuilles de la plante, placées sous une cloche contenant de la potasse caustique dans un bécher et de la chaux sodée dans le tube montrent un test négatif pour l'amidon tandis que les feuilles de l'autre cloche (dans laquelle les béchers contiennent de l'eau et le tube est rempli de cailloux) montrent des résultats positifs tester l'amidon.

Un test négatif pour l'amidon dans les feuilles d'une plante indique qu'il n'y a pas de formation d'amidon dans ses feuilles en raison de l'absence de CO2. Toutes les autres conditions pour la photosynthèse (c'est-à-dire la lumière, la chlorophylle, l'eau et la température) sont normales.

CO seulement2 n'est pas présent dans l'environnement de l'usine car le CO2 de l'air entrant par le tube à large ouverture est absorbé par la chaux sodée et l'air entrant est exempt de CO2. D'autre part, le CO2, qui sort dans le processus de respiration de la plante, est absorbé par la potasse caustique placée dans les béchers.

Les feuilles de l'autre plante présentent un test positif pour l'amidon car toutes les exigences essentielles à la photosynthèse, c'est-à-dire la lumière, la chlorophylle, l'eau, la température et aussi le CO2, sont présents dans son environnement.

Alors, CO2 est nécessaire à la photosynthèse.

7. Expériences sur la respiration chez les plantes :

But de l'expérience :

Mesurer et comparer le taux de respiration de diverses parties de la plante par méthode volumétrique à l'aide de tubes Pettinkoffer’s.

Bocaux, substrat respiratoire, appareil Pettinkoffer’s, solution d'hydroxyde de baryum, support en bois, régulateur de pression (pompe aspirante), graisse, chaux sodée, acide oxalique, phénolphtaléine, carbonate de baryum, potasse caustique, burette, béchers, éprouvette de mesure, balance avec pesée boîte.

1. Remplissez les pots de chaux sodée et placez-en environ 100 g. matériaux respiratoires dans la chambre du tube en U.

2. Maintenant, remplissez les tubes longs et étroits de Pettinkoffer avec une solution d'hydroxyde de baryum de concentration connue (N/10). Placez les tubes Pettinkoffer’s de manière à ce qu'ils soient orientés obliquement sur un support en bois.

3. Connecter les tubes avec une pompe d'aspiration ou un régulateur de pression.

4. Rendre l'ensemble de l'appareil étanche à l'air en appliquant de la graisse.

5. Laissez maintenant le régulateur de pression fonctionner. De ce fait, le courant d'air s'engouffre dans les bocaux remplis de chaux sodée qui absorbe le dioxyde de carbone de l'air. L'air traverse maintenant le matériel végétal placé dans la chambre respiratoire en forme de U (Fig. 53).

6. À partir des chambres en forme de U, l'air est maintenant barboté à travers les tubes Pettinkoffer® remplis d'une solution d'hydroxyde de baryum.

7. Pour réguler un mouvement lent d'air et de bulles à travers la chaux sodée, le substrat respiratoire et la solution d'hydroxyde de baryum, le régulateur de pression est autorisé à fonctionner. L'air passe d'abord à travers l'un des tubes Pettinkoeffer’s, puis il est autorisé à s'écouler à travers le deuxième tube.

8. Retirez maintenant le premier tube et titrez son contenu. En raison de la présence de carbonate de baryum précipité (BaCO3) le contenu devient trouble.

9. Mesurez environ 25 ml. du contenu du tube de Pettinkoffer, c'est-à-dire du carbonate de baryum et titrez-le contre une solution N/10 d'acide oxalique.

10. Des gouttes de phénolphtaléine sont utilisées comme indicateur dans le bécher contenant du carbonate de baryum et notent le point final.

Observations et résultats :

Les observations et les résultats peuvent être notés sous la forme du tableau suivant :

(un1 = Normalité connue de l'acide oxalique.

Il est calculé comme suit :

Poids moléculaire de l'acide oxalique = 126

Poids équivalent 126/2 = 63

N/10 = 6,3 g. d'acide oxalique dissous dans 1000 cc d'eau

(b) V1 = Volume connu d'acide oxalique utilisé = 10 cc

(c) N2 = Normalité de la solution d'hydroxyde de baryum, à déterminer.

(d) V2 = Volume de carbonate de baryum = 25 cc

De cette façon N1V1 = N2V2 peut être calculé comme suit :

Par conséquent, N2 = 6.3 × 10 / 25= 2.52

La quantité de CO2 produit par 100 g. de matériel végétal donné (substrat respiratoire) est de 2,5 mg/litre en une heure. De la même manière, le taux de respiration de différents substrats respiratoires ou de différentes parties de la plante peut être déterminé.

8. Expériences sur le taux de croissance des plantes :

But de l'expérience : Mesurer le taux de croissance d'une plante au microscope horizontal.

Microscope horizontal avec support vertical équipé d'une échelle linéaire coulissante, stylo, plante ou brindille de la plante à mesurer.

Au microscope horizontal (Fig. 57), les optiques restent en position horizontale. Il est maintenu par un pied vertical équipé d'une échelle linéaire coulissante. Son tube optique peut être déplacé vers le haut et vers le bas à l'aide d'une vis. A l'aide d'une échelle linéaire, le mouvement vertical peut être mesuré.

La croissance de ce microscope est mesurée de la manière suivante :

1. Faites un petit point sur le sommet de la pousse à l'aide d'un stylo.

2. Mettez ce point d'encre au point du microscope en l'observant à travers son oculaire.

3. Après 24 heures, observez à nouveau le même point d'encre qui a maintenant augmenté en raison de la croissance de la plante. Déplacez le microscope vers le haut, concentrez-le et notez la distance entre les lectures initiales et finales.

4. Notez les lectures quotidiennement pendant 10 jours après un intervalle défini de 24 heures.

Une augmentation des lectures est observée quotidiennement. Cela indique que la plante pousse quotidiennement.

9. Expériences sur la croissance des plantes en favorisant les substances :

Dosage biologique de l'auxine, de la gibbérelline, de la cytokinine, de l'acide abscissique (ABA) et de l'éthylène à l'aide de matériel végétal approprié.

Essai biologique désigne la détermination quantitative d'une substance en mesurant ses effets biologiques sur, par exemple, la croissance, c'est-à-dire l'utilisation d'un organisme pour tester l'environnement, Ou, c'est la détermination de la puissance d'un produit biologique en testant son effet sur un organisme .

Matériel végétal approprié ou matériel d'essai biologique mentionné dans le tableau suivant.

Méthode, observations et résultats :

Voir le tableau suivant :

10. Expériences sur la biotechnologie :

But de l'expérience:

Élaborer les étapes généralisées utilisées dans la méthodologie de la culture tissulaire dans un matériel végétal.

Matériel végétal (p. ex. plant de carotte mature), eau, scalpel ou rasoir, pyrale du liège, boîtes de Pétri stériles, milieu d'initiation du cal (p. ex. milieu Murashige-Skoog’s) avec 2, 4-D, milieu de développement des pousses, pot avec terre.

1. Prenez un plant de carotte mature (Fig. 2A) avec sa racine pivotante intacte, retirez ses feuilles et lavez soigneusement sa racine pivotante (Fig. 2B).

2. Coupez la racine pivotante en 3 ou 4 morceaux (Fig. 2C) avec un scalpel ou un rasoir tranchant.

3. Insérez le foreur de liège dans un morceau de racine pivotante (Fig. 2D) et retirez les régions désirées de la racine.

4. Mettez un tel morceau de racine pivotante retiré dans une boîte de Pétri stérile et coupez-le transversalement en petits morceaux comme indiqué dans (Fig. 2E).

5. Prenez du milieu d'initiation du cal (par exemple, milieu Murashige-Skoog ou milieu MS) avec du 2, 4-D dans une boîte de Pétri stérile, placez-y des disques ou coupez des morceaux de racine pivotante et incubez pendant 6 à 8 semaines. La formation de cals commence dans les 4 à 6 semaines (Fig. 2 F).

6. Transférer les cals dans une autre boîte de Pétri contenant un milieu de développement des pousses. Les jeunes plants avec des racines et des pousses (Fig. 2G) commencent à se développer en 4 à 8 semaines.

7. Ces jeunes plants sont transférés dans des pots contenant de la terre (Fig. 2 H) où ils se développent en plants matures (Fig. 2A).


Formation en microscopie et imagerie numérique

La microscopie à fluorescence à grand champ et confocale est capable d'agrandir et d'imager des fluorophores électroluminescents avec une résolution qui approche un quart de micromètre, permettant ainsi l'étude des événements dynamiques et des détails structurels fins de l'architecture cellulaire. Grâce à ces techniques, des informations clés sur de nombreux événements se produisant dans les cellules, les tissus et les organismes entiers ont été obtenues, notamment le transport intracytoplasmique des vésicules, la structure du cytosquelette, les mécanismes de remodelage tissulaire et la migration des cellules cancéreuses dans un organisme malade. Au cœur de l'augmentation spectaculaire récente de l'utilisation de la microscopie à fluorescence en biologie cellulaire a été le développement de protéines fluorescentes génétiquement codées qui agissent comme des marqueurs endogènes pour permettre à pratiquement n'importe quelle protéine ou peptide de devenir une balise fluorescente pour l'imagerie et l'analyse. La disponibilité généralisée de nouvelles instruments de pointe et de systèmes de détection hautement sensibles a en outre permis l'acquisition d'images supérieures avec des caractéristiques spatio-temporelles appropriées pour répondre à un large éventail de questions biologiques.

Malgré son impact révolutionnaire sur la biologie, toutes les formes traditionnelles de microscopie à fluorescence (y compris à grand champ, confocale et multiphotonique) sont confrontées à une limite de résolution imposée par la diffraction de la lumière à travers des lentilles et des ouvertures circulaires. Le caractère ondulatoire de la lumière diffractée empêche les objets inférieurs à environ 200 nanomètres dans les dimensions latérales (x, y) et à environ 500 nanomètres dans la dimension axiale (z) d'être visualisés comme autre chose qu'un flou. En raison du fait que la plupart des structures subcellulaires (telles que les fibres d'actine, les filaments intermédiaires, les microtubules, les ribosomes et les vésicules de transport) présentent des caractéristiques beaucoup plus petites que cette taille, un mécanisme permettant de franchir la barrière de diffraction et d'imagerie sous la limitation de taille qu'il définit, a été le Saint Graal de la microscopie optique pendant des siècles.

Au cours de la dernière décennie, plusieurs stratégies conceptuelles distinctes ont été introduites pour surmonter la barrière de diffraction et permettre l'analyse des structures biologiques au niveau de la superrésolution. Une stratégie hautement développée, souvent appelée ingénierie de la fonction de propagation ponctuelle ou superrésolution basée sur l'éclairage, utilise des approches optiques non linéaires pour réduire la taille du point focal. Des exemples de ce type d'imagerie à superrésolution sont l'appauvrissement par émission stimulée ( STED ), l'appauvrissement de l'état fondamental ( GSD ) et la microscopie à illumination structurée saturée ( SSIM ). En modifiant le modèle de lumière d'excitation grâce à une ingénierie contrôlée de la fonction d'étalement des points pour produire une taille de point focal beaucoup plus petite, ces techniques avancées sont capables de résoudre des détails structurels fins dans des spécimens biologiques. Des résolutions approchant 20 et 50 nanomètres dans les dimensions latérales ont été atteintes avec STED et SSIM, respectivement.

Une deuxième stratégie (et de plus en plus populaire) pour surmonter la barrière de diffraction utilise des sondes fluorescentes photocommutables pour résoudre les différences spatiales dans les populations denses de molécules avec une superrésolution. Cette approche repose sur l'activation stochastique de la fluorescence pour passer par intermittence des molécules photoactivables individuelles à un état brillant, qui sont ensuite imagées et photoblanchies. Ainsi, des molécules très rapprochées qui résident dans le même volume limité par la diffraction (et seraient autrement indiscernables spatialement, voir la figure 1 (a)), sont séparées dans le temps. La fusion de toutes les positions de molécule unique obtenues par des cycles répétés de photoactivation suivis d'imagerie et de blanchiment produit l'image de superrésolution finale (figure 1 (b)). Les techniques basées sur cette stratégie sont souvent appelées superrésolution à base de sondes et sont communément appelées microscopie de localisation photoactivée ( PALM ), microscopie de localisation par photoactivation par fluorescence ( FPALM ) et microscopie de reconstruction optique stochastique ( STORM ). Les trois méthodes sont basées sur les mêmes principes, mais ont été initialement publiées en utilisant différentes sondes photocommutables. La figure 1 présente un exemple d'imagerie à superrésolution utilisant la microscopie par fluorescence à réflexion interne totale ( TIRF ). La figure 1 (a) est l'image pixélisée de molécules uniques de protéines fluorescentes attachées à une lamelle. Les positions des molécules individuelles ne peuvent pas être déterminées avec précision en raison de leurs fonctions de propagation ponctuelle qui se chevauchent, mais le centre des molécules de protéines peut être résolu dans le temps avec une grande précision (figure 1 (b)) à l'aide de PALM ou de techniques similaires.

PALM et FPALM ont été développés en utilisant des protéines fluorescentes photoactivables ou photoconvertibles (dimère en tandem Eos et GFP photoactivable, PA-GFP) comme sondes commutables, tandis que STORM a été publié à l'origine en utilisant les colorants synthétiques carbocyanine, Cy3 et Cy5, pour marquer de courtes molécules d'ADN. Indépendamment des différences mineures dans le développement historique, il est possible et pratique de mener des expériences PALM avec des colorants synthétiques et des expériences STORM avec des protéines fluorescentes. Contrairement à la situation de la microscopie à fluorescence classique, la microscopie à superrésolution basée sur des sondes permet de définir des structures biologiques avec une précision nanométrique, similaire aux techniques de superrésolution basées sur l'éclairage les plus sophistiquées. Cependant, l'application de techniques d'imagerie de localisation de molécules uniques permet également d'identifier individuellement des sondes fluorescentes mettant en évidence des structures subcellulaires à des densités moléculaires élevées afin que leurs distributions et dynamiques puissent être analysées. Une résolution aussi élevée ouvre la porte à de nombreuses possibilités pour aborder les questions mécanistiques concernant la fonction biologique, y compris la cartographie de la machinerie moléculaire, ainsi que la stoechiométrie et la dynamique.

La configuration de base du microscope pour la superrésolution d'une seule molécule à réflexion interne totale à champ large (TIRF) est présentée à la figure 2. Les lasers de photoactivation et de lecture (405 et 561 nanomètres, respectivement) sont positionnés de manière à pouvoir être obturés ou utilisés simultanément si nécessaire. L'agencement le plus polyvalent couple directement les lasers au microscope sans fibre optique pour offrir la quantité maximale de puissance (bien que les instruments commerciaux couplent efficacement le ou les lasers à l'aide de fibres optiques). Un système de caméra à dispositif à couplage de charge et multiplicateur d'électrons refroidi ( EMCCD ) est fixé au port arrière du microscope, qui devrait recevoir 100 % de la lumière émise pour un rapport signal/bruit maximal. L'échantillon est monté dans un support spécialisé et boulonné à l'étage de précision x - y pour recueillir des images transitoires de molécules uniques. Un objectif à grande ouverture numérique est positionné sous l'échantillon et fonctionne en mode TIRF. L'utilisation d'un système auxiliaire de condenseur à fond clair (non représenté) équipé d'un contraste interférentiel différentiel (DIC) permet l'examen de l'échantillon pour rechercher des régions appropriées de l'échantillon pour l'imagerie d'une molécule unique. Au cœur de l'instrumentation se trouve un système informatique à grande vitesse qui acquiert et traite les images enregistrées par la caméra.

Les techniques de superrésolution basées sur l'éclairage, telles que STED, et les techniques basées sur des sondes, telles que PALM, permettent désormais aux biologistes de visualiser les structures et les processus dynamiques dans les cellules au niveau moléculaire ou à proximité. L'amélioration de l'ordre de grandeur de la résolution spatiale obtenue par rapport à la méthodologie de microscopie optique précédente indique que ces nouvelles approches présentent un potentiel énorme pour répondre à d'innombrables questions biologiques qui nécessitent une résolution point à point inférieure à la limite de diffraction de 200 nanomètres. À ce jour, la microscopie à superrésolution a fourni des détails sur l'architecture fine des structures cellulaires telles que les mitochondries, les lysosomes, les adhérences focales, les microtubules, les filaments d'actine et les vésicules revêtues. Des processus dynamiques ont également été observés, notamment le mouvement des complexes d'adhésion focale, le transport des vésicules sous-résolution et les complexes de polarité des bactéries, ainsi que des molécules uniques contraintes à la membrane plasmique. Nul doute que ces efforts exploratoires aboutiront finalement à de nombreuses investigations sur les mystères de la structure et de la fonction cellulaires.

Haut de la page ^ Concepts fondamentaux de l'imagerie PALM

Le principe entourant la microscopie de localisation photoactivée et les techniques associées repose sur une combinaison d'imagerie de fluorophores uniques (imagerie à molécule unique) avec l'activation contrôlée et l'échantillonnage de sous-ensembles clairsemés de ces marqueurs dans le temps. L'imagerie d'une molécule unique a été initialement démontrée en 1989, d'abord à des températures cryogéniques et plus tard à température ambiante en utilisant la microscopie optique à balayage en champ proche. Depuis lors, la méthodologie a évolué pour devenir une technique standard de microscopie à grand champ. La connaissance préalable que l'image limitée en diffraction d'une molécule provient d'une source unique permet d'estimer la localisation (centre) de cette molécule avec une précision bien au-delà de celle de la limite de diffraction. Ce haut niveau de précision est évolutif avec l'inverse du carré du nombre de photons détectés, comme cela sera décrit ci-dessous.

En termes généraux, une seule molécule fluorescente forme une image à diffraction limitée ayant des dimensions latérales et axiales définies par la longueur d'onde d'excitation, l'indice de réfraction du support d'imagerie et l'ouverture angulaire de l'objectif du microscope :

Résolution x,y = λ / 2[η • sin(α)] (1) Résolution z = 2λ / [η • sin(α)] 2 ( 2)

où λ est la longueur d'onde de la lumière (excitation en fluorescence) et le terme combiné η • sin(α) est connu sous le nom d'ouverture numérique objective ( NA ). Les objectifs couramment utilisés en microscopie ont une ouverture numérique inférieure à 1,5 (bien que les nouveaux objectifs haute performance approchent de près cette limite), limitant le terme α dans les équations (1) et (2) à moins de 70 degrés. Par conséquent, la limite de résolution théorique à la longueur d'onde d'excitation pratique la plus courte (environ 400 nanomètres en utilisant un objectif ayant une ouverture numérique de 1,40) est d'environ 150 nanomètres dans la dimension latérale et approchant 400 nanomètres dans la dimension axiale. En termes pratiques pour l'imagerie de la protéine fluorescente verte améliorée ( EGFP ) dans les cellules vivantes, ces valeurs sont respectivement d'environ 200 et 500 nanomètres. Ainsi, les structures situées à moins de 200 à 250 nanomètres ne peuvent pas être résolues dans le plan latéral à l'aide d'un microscope à fluorescence à champ large ou confocal.

Lors de l'examen du plan image latéral dans un champ de vision d'émetteurs à molécule unique, la partie centrale de chaque spot à diffraction limitée correspond à la position probable d'une molécule et peut être localisée avec une précision nanométrique élevée en rassemblant un nombre suffisant de photons. Les méthodes de détermination du centre de localisation sont basées sur un ajustement statistique de la distribution des photons mesurés (en fait, la tache de l'image, mais également appelée fonction d'étalement des points) à une fonction gaussienne (voir Figure 3). Le but ultime de cet exercice est de déterminer le centre ou la valeur moyenne de la distribution des photons ( μ = x 0 , y 0 ), et son incertitude, l'erreur standard de la moyenne, σ , selon l'équation :

où N est le nombre de photons rassemblés, a est la taille de pixel du détecteur CCD d'imagerie, b est l'écart type du fond (qui inclut l'émission de fluorescence de fond combinée au bruit du détecteur) et si est l'écart type ou la largeur du distribution (dans la direction i ). L'indice i fait référence à la direction x ou y. Le premier terme sous la racine carrée du côté droit de l'équation (3) fait référence au bruit photonique, tandis que le second terme englobe l'effet de la taille de pixel finie du détecteur. Le dernier terme prend en compte l'effet du bruit de fond. En appliquant ces techniques mathématiques simples, une précision de localisation d'environ 10 nanomètres peut être obtenue avec une distribution de photons d'environ 1000 photons lorsque le bruit de fond est négligeable. L'extension de cette idée a donné lieu à une multitude d'expériences intelligentes étudiant des structures isolées qui sont séparées par moins que la limite de diffraction, telles que les moteurs moléculaires marqués et les « règles » moléculaires de l'ADN à l'échelle nanométrique. Un développement technologique majeur dans la prise en charge de la superrésolution basée sur des sondes est la disponibilité généralisée et la facilité d'utilisation des systèmes de caméras EMCCD (voir Figure 2), qui ont une sensibilité à un seul photon.

Comme décrit par l'équation (3), la clé des résultats de haute précision pour la localisation moléculaire dans l'imagerie de superrésolution à molécule unique est de minimiser le bruit de fond et de maximiser la sortie de photons de la sonde fluorescente, une tâche plus facile à décrire qu'à accomplir. Dans le meilleur des cas, si 10 000 photons peuvent être collectés en l'absence de fond avant que le fluorophore blanchisse ou soit éteint, le centre de localisation peut être déterminé avec une précision d'environ 1 à 2 nanomètres. En revanche, si seulement 400 photons sont collectés, la précision de localisation chute à environ 20 nanomètres ou pire. Le bruit de fond dans les échantillons de superrésolution provient de l'autofluorescence naturelle ou induite par un réactif de transfection, ainsi que de la fluorescence résiduelle des sondes environnantes qui sont entrées dans l'état sombre. Ainsi, pour les techniques d'imagerie de superrésolution à molécule unique basées sur des sondes telles que PALM, les molécules fluorescentes doivent afficher un rapport de contraste élevé (ou plage dynamique), qui est défini comme le rapport de fluorescence avant et après photoactivation. La variabilité des rapports de contraste dans les protéines fluorescentes et les fluorophores synthétiques est due à des différences dans leur photoconversion spontanée en l'absence d'activation contrôlée.

La figure 3 illustre les étapes impliquées dans la localisation de molécules uniques avec une grande précision en ajustant la fonction d'étalement des points à une fonction gaussienne. Sur la figure 3 (a), la fonction de propagation ponctuelle d'un microscope à fluorescence à grand champ est superposée à une représentation filaire de la matrice de pixels d'un appareil photo numérique dans les deux (en haut à gauche) et les diagrammes en trois dimensions. La fonction d'étalement des points pixélisés d'un seul fluorophore comme imagé avec un EMCCD est montrée dans le coin supérieur gauche de la figure 3 (b), et modélisée par une fonction gaussienne tridimensionnelle, avec l'intensité pour chaque pixel mappé en couleur dans le centre partie de la figure 3(b). Une carte de contour des intensités est présentée à la figure 3(c). Dans les cas où deux cartes de contour se chevauchent en raison de l'émission par des fluorophores avec une distance de séparation plus courte que la limite de diffraction, le centroïde de chaque fluorophore peut être localisé individuellement en soustrayant la fonction d'étalement des points d'un fluorophore de l'autre (après son entrée dans un état ou est photoblanchi) en raison de la stratégie de cartographie temporelle pour générer des images PALM.

La plupart des structures et des organites observés par microscopie à fluorescence dans les systèmes biologiques sont très densément peuplés de fluorophores, avec significativement plus d'une molécule partageant le même volume limité par la diffraction. Dans de tels cas, la localisation d'une seule molécule est pratiquement impossible en raison du fait que les images de fluorescence résultantes apparaissent sous la forme d'une distribution très chevauchante de taches floues limitées par la diffraction. Le mécanisme autour de cette situation, et au cœur du concept entourant PALM, est de localiser séquentiellement des sous-ensembles clairsemés de molécules. Ce concept a été démontré pour la première fois par Eric Betzig et Harald Hess une décennie avant l'introduction de PALM en résolvant des centres luminescents densément distribués (ayant des spectres distincts) dans un puits quantique par imagerie avec une longueur d'onde finement divisée. En conséquence, bien qu'il y ait eu de nombreux centres confinés dans un volume de résolution spatiale, ils sont devenus résolubles lorsqu'ils sont séparés le long d'une autre dimension, la longueur d'onde.

La généralisation de l'expérience de Betzig et Hess pour la microscopie est que si la réponse fluorescente d'un ensemble de molécules peut être étalée dans un espace de dimension supérieure, il serait alors possible d'imager les sources individuellement, de localiser chacun de leurs centres, puis accumuler les coordonnées du centre pour créer une image superrésolution. Le concept a été appliqué avec succès dans plusieurs enquêtes avant l'introduction de PALM et STORM. En utilisant la spectroscopie laser, les spectres (et la localisation) des fluorophores organiques qui se chevauchent ont été séparés avec succès, bien qu'à des températures cryogéniques. Par la suite, la méthodologie a été étendue à la localisation de molécules uniques par photoblanchiment séquentiel ou par recrutement stochastique de sondes fluorescentes sur un site de liaison stationnaire. De plus, la localisation d'une seule molécule a été démontrée grâce à l'analyse du clignotement stochastique des points quantiques.

La microscopie à superrésolution par sonde est devenue une réalité avec la découverte de marqueurs fluorescents photoactivables (à la fois des protéines fluorescentes et des fluorophores synthétiques) qui pourraient être activés séquentiellement à temps pour produire des milliers de sous-ensembles clairsemés. Le principe de fonctionnement de cette méthodologie est de commencer avec la grande majorité des marqueurs fluorescents à l'état inactif et ne contribuant pas à la fluorescence de l'échantillon. Une petite fraction (moins de 1 %) est ensuite activée par illumination avec une lumière proche de l'ultraviolet (dans certains cas, d'autres régions spectrales sont utiles) pour induire une modification chimique dans quelques molécules qui leur permet de devenir fluorescentes.Ce sous-ensemble clairsemé est ensuite imagé et localisé pour générer des coordonnées ayant une précision de l'ordre du nanomètre (voir la figure 3). Les étiquettes enregistrées sont ensuite supprimées par photoblanchiment afin qu'un nouveau sous-ensemble clairsemé puisse être transféré à l'état actif et échantillonné pour rassembler un nouvel ensemble de coordonnées moléculaires. Le processus peut être répété plusieurs milliers de fois jusqu'à ce que des millions de ces coordonnées moléculaires s'accumulent dans la région à imager. Une image composite rendue à partir de tous les ensembles de coordonnées produit une image de superrésolution à molécule unique de la structure marquée par fluorescence à l'étude. Notez que les coordonnées moléculaires ne sont pas réellement représentées par un seul point pour identifier leur position spatiale, plutôt une distribution d'intensité gaussienne correspondant à l'incertitude de position de leur emplacement est utilisée pour construire la carte d'image.

Haut de page ^ Techniques de localisation moléculaire

Une multitude de techniques de localisation moléculaire ont été décrites qui identifient plus d'une molécule par foyer à diffraction limitée. Comme discuté ci-dessus, l'une des premières expériences réussies dans ce domaine a été réalisée en utilisant le binning spectral sur des espèces luminescentes individuelles densément réparties dans un puits quantique. Une technique similaire a été appliquée à des molécules de pentacène intégrées dans un cristal de para-terphényle pour obtenir des précisions de localisation d'environ 40 et 100 nanomètres dans les dimensions latérales et axiales, respectivement. Une autre approche a examiné les différentes durées de vie fluorescentes dans le colorant carbocyanine, Cy5, et le dérivé de rhodamine JF9 pour localiser deux molécules différentes fluorescentes avec des longueurs d'onde similaires dans la même région limitée par la diffraction. De même, les variations des taux de photoblanchiment ont été utilisées pour imager et localiser séquentiellement les champs de molécules jusqu'à ce que toutes soient blanchies. Dans cette expérience, la détermination du centroïde a commencé avec la molécule la plus photostable, a localisé cette molécule et a répété le processus pour localiser jusqu'à cinq molécules avec une précision de 10 nanomètres dans le même foyer.

Plusieurs autres approches de la localisation de molécules uniques de haute précision ont également été rapportées, mais aucune n'a été appliquée avec succès à de grands ensembles, tels que ceux trouvés dans une adhérence focale hautement fluorescente. En revanche, PALM et des techniques étroitement apparentées (telles que FPALM) ont étendu ces concepts à la localisation de milliers de molécules à l'aide de protéines fluorescentes photoconvertibles ou photoactivables. La technique STORM a été introduite sur la base du phénomène de photocommutation des colorants cyanine courants lorsqu'ils sont situés à proximité les uns des autres (moins de 2 nanomètres). Ces avancées significatives ont permis aux chercheurs d'activer et de désactiver des molécules à plusieurs reprises de manière contrôlée et de maintenir ainsi la faible densité requise de molécules détectées. Parce que les techniques de superrésolution à molécule unique récemment introduites de PALM, FPALM et STORM ont avancé la localisation moléculaire à un nombre beaucoup plus élevé de molécules, ces approches ont eu un impact révolutionnaire sur la biologie cellulaire et devraient conduire à de nombreux autres nouveaux développements basés sur des principes similaires.

Comme mentionné, la capacité de commuter sélectivement une molécule fluorescente entre un état clair et un état sombre (photocommutation) ou entre un spectre d'émission de fluorescence et un autre (photoconversion) est au cœur du concept d'imagerie à superrésolution basée sur des sondes. Ce type de transition est à la base d'un commutateur moléculaire, qui est détaillé dans un concept appelé transition optique fluorescente saturable/commutable réversible ( RESOLFT ). Le concept RESOLFT comprend l'isomérisation de commutation entre les états cis et trans et diverses autres transitions optiquement bistables dans les fluorophores. Pratiquement toutes les techniques de superrésolution signalées, y compris STED et GSD, impliquent un certain type de photocommutation ou de photoconversion. Par exemple, une méthode appelée PALM avec acquisition indépendante ( PALMIRA ) utilise des protéines fluorescentes photocommutables, alors que de nombreuses autres techniques, y compris la STORM directe ( dSTORM ), la microscopie à photoblanchiment réversible ( RPM ), l'appauvrissement de l'état fondamental avec retour de molécule individuelle ( GSDIM ) et la microscopie à fonction d'étalement du point à double hélice (DH-PSF) utilisent toutes la photocommutation dans des états sombres en utilisant un ou plusieurs colorants synthétiques conventionnels, comme cela sera discuté ci-dessous.

La figure 4 illustre la photocommutation de plusieurs fluorophores contenant un système d'anneaux de xanthène sous une puissance laser modérée pour démontrer le concept d'épuisement de l'état fondamental et de retour d'une seule molécule. Le graphique présenté sur la figure 4(a) montre la chute rapide de l'intensité de fluorescence pour les sondes rhodamine 6G et ATTO 532 en présence d'un agent de trempe à l'état triple (bêta-mercaptoéthanol) lorsque l'intensité du laser d'excitation est augmentée. Notez que l'intensité de fluorescence commence à chuter rapidement à la puissance laser relativement faible d'environ 2 kilowatts par centimètre carré, puis chute beaucoup plus lentement (atteignant presque un plateau) sur le reste de la plage de puissance. La figure 4(b) représente une trace en accéléré d'une émission de fluorescence d'une seule molécule à partir de molécules ATTO 532 conjuguées à des anticorps secondaires de chèvre ciblant l'anti-alpha-tubuline de souris dans des cellules HeLa cultivées sur des lamelles couvre-objet. Les cellules fixées et colorées ont été immergées dans de l'alcool polyvinylique en présence de quantités millimolaires de bêta-mercaptoéthanol. Notez qu'à des puissances laser plus élevées, des colorants synthétiques similaires (tels que Alexa Fluor 488 et 568) entreront dans un état sombre de longue durée à partir duquel ils reviennent stochastiquement en utilisant uniquement des solutions salines simples sans thiol ou alcool à haute viscosité ajouté. Cette dernière technique est appelée microscopie à photoblanchiment réversible, comme mentionné ci-dessus, bien que la photocommutation soit probablement un terme plus approprié pour décrire le phénomène.

Haut de la page ^ Localisation moléculaire à haute densité

Étant donné que la collecte de grands ensembles de données en microscopie de superrésolution de localisation de molécule unique nécessite des échelles de temps étendues (en particulier par rapport à l'imagerie traditionnelle à grand champ et confocale), la plupart des expériences PALM sont menées sur des préparations de cellules ou de tissus fixes. Les cellules de culture tissulaire adhérentes fixées avec du paraformaldéhyde sont peu susceptibles de subir des modifications structurelles, de sorte que le temps d'acquisition de l'image n'est pas un facteur critique et est normalement dicté par le nombre de molécules fluorescentes dans l'échantillon couplé à la patience de l'investigateur. Les spécimens de cette catégorie ont produit une vaste gamme d'images révélant l'organisation moléculaire des protéines au sein des structures subcellulaires à une résolution nanométrique, y compris les réseaux d'actine filamenteuse et de microtubules. Étant donné que les microtubules sont des filaments distincts et bien caractérisés ayant un diamètre d'environ 25 nanomètres et situés à des distances variables les uns des autres, ces structures font d'excellents candidats pour les tests de résolution et les exercices de configuration de microscope. D'autres spécimens potentiellement utiles pour la validation sont des constituants d'adhésion focale et des protéines intégrées dans la membrane plasmique ou les mitochondries.

Une caractéristique unique associée à toutes les techniques de localisation de molécules uniques est que l'investigateur a la liberté de définir l'ensemble de molécules qui sont affichées dans la sortie finale. Par exemple, dans certains cas, seules les molécules qui se localisent avec une incertitude supérieure à 10 nanomètres sont affichées, tandis que dans d'autres cas, s'appuyant sur le même ensemble de données, les molécules qui se localisent avec une précision de 20 nanomètres ou moins peuvent être incluses. Cette polyvalence soulève un point critique dans l'imagerie PALM à molécule unique qui fait la distinction entre la haute précision moléculaire et la résolution pouvant être obtenue avec des sondes et des préparations d'échantillons spécifiques. Même si l'emplacement des molécules dans un échantillon peut être déterminé avec une grande précision (jusqu'à quelques nanomètres dans le meilleur des cas), la résolution déclarée d'éléments structurels distincts doit toujours obéir au critère d'échantillonnage de Nyquist d'environ deux points de données par unité de résolution. . Par conséquent, la densité de molécules localisées devient un facteur important pour les revendications de résolution, comme illustré à la figure 5 pour une photographie traditionnelle d'un jeune garçon.

Le concept de précision de localisation, de résolution et de densité moléculaire dans la localisation d'une molécule unique est illustré de manière abstraite à la figure 5. La série d'images d'un jeune garçon montre comment l'image de superrésolution est construite en traçant des molécules localisées, représentées sur la figure 5 sous forme de points. À des fins d'illustration, les tailles de points dans les panneaux (a) à (c) sont représentées beaucoup plus grandes que ce qui serait nécessaire pour obtenir l'image finale présentée dans le panneau (d). L'image du garçon sur la figure 5(a) montre de nombreux points localisés, mais la densité relativement faible ne permet pas la reconnaissance de l'image. Au fur et à mesure que de plus en plus de points sont ajoutés aux images des figures 5(b) et 5(c), le garçon devient plus reconnaissable, mais la distinction (résolution) des traits fins associés à son visage nécessite une densité plus élevée de points de données, comme le montre la figure 5(d). Le concept important à noter est qu'une image peut être générée qui contient des points de données localisés avec précision à l'aide de techniques de localisation à molécule unique, mais la densité de ces points affecte directement la capacité à résoudre les caractéristiques de l'image.

Dans PALM et d'autres méthodes de localisation de molécules uniques, les images peuvent être rendues avec les molécules localisées avec les plus hautes précisions (un nanomètre ou deux) en excluant sélectivement les points de données avec une mauvaise localisation, mais ce succès se fait au détriment de la densité moléculaire (et donc résolution) dans l'image finale. Cette situation peut survenir simplement en fonction du type d'échantillon et de la molécule cible d'intérêt plutôt que d'une limitation arbitrairement imposée de la précision moléculaire. Ainsi, une faible densité moléculaire peut survenir en raison du fait que la molécule cible est peu représentée dans l'échantillon. Par exemple, si le diamètre moyen d'une protéine fluorescente est d'environ 2,5 nanomètres et que la protéine est intégrée dans un organite confiné à un plan bidimensionnel (comme une membrane), la densité maximale de molécules de protéines fluorescentes serait environ 20 000 par micromètre carré. De plus, pour atteindre une densité aussi élevée, ce calcul suppose que seules des molécules de protéines fluorescentes sont situées dans ce plan.

Bien que de rares situations puissent survenir où les densités moléculaires sont excessivement élevées dans les échantillons biologiques, telles que la membrane tassée discutée ci-dessus, il s'agit généralement d'une situation physiologique peu probable ailleurs dans la cellule. Si les fusions de protéines fluorescentes comprennent un pour cent des molécules dans une membrane organelle, cela conduit à environ 2000 molécules par micromètre carré ou environ deux molécules tous les 40 à 50 nanomètres. Les densités d'échantillonnage de ce niveau sont pâles par rapport à la précision moléculaire obtenue observée par microscopie électronique et limitent toute revendication de résolution concernant les caractéristiques structurelles. Quoi qu'il en soit, une expérience PALM qui observe 2000 molécules par centimètre carré dans une membrane organelle offre une quantité importante d'informations, malgré les limites de la résolution. En effet, les images à cette densité peuvent révéler des distributions moléculaires relatives au sein de l'échantillon, ce qui est souvent le but d'une expérience d'imagerie. Si ces données sont mises en contexte avec d'autres caractéristiques connues de l'échantillon (comme l'utilisation de la microscopie électronique corrélative), le potentiel augmente pour obtenir beaucoup plus d'informations.

Haut de page ^ Sondes pour la microscopie à superrésolution d'une molécule unique

Plusieurs classes de fluorophores de premier plan ont émergé comme les meilleurs candidats pour le marquage de cibles subcellulaires dans PALM et les techniques associées. Ceux-ci incluent des fusions de protéines fluorescentes génétiquement codées, des colorants synthétiques, des points quantiques et des systèmes hybrides qui combinent un peptide cible génétiquement codé avec un composant synthétique séparé qui est perméable à la membrane (tel que le système FlAsH/ReAsH). Chaque classe spécifique de sondes fluorescentes a ses forces et ses faiblesses particulières, cependant aucune classe ou fluorophore individuel n'a encore été développé qui combine toutes les caractéristiques préférées d'une sonde idéale pour toute application en microscopie à superrésolution à molécule unique. La considération fondamentale pour le développement de sondes de superrésolution est qu'elles doivent être capables d'être photoactivées, photocommutées ou photoconverties par la lumière d'une bande de longueur d'onde définie afin de modifier leurs propriétés spectrales pour la détection de sous-populations sélectionnées.

Parmi les attributs les plus souhaitables pour les sondes de superrésolution mono-molécule figurent des niveaux de luminosité et de contraste très élevés, qui sont nécessaires pour maximiser le nombre de photons pouvant être détectés par molécule avant qu'elle ne blanchisse ou ne revienne à un état sombre et non fluorescent. La luminosité est déterminée par le produit du coefficient d'extinction molaire ( &# 949 abs ) et du rendement quantique de fluorescence ( φ ). Ainsi, les meilleures sondes ont des coefficients d'extinction et des rendements quantiques élevés et offrent un excellent contraste sur le fond. En général, les niveaux de luminosité des colorants synthétiques populaires, tels que Cy5, ATTO 650 et Alexa Fluor 488, sont très élevés en raison de coefficients d'extinction de 100 000 en moyenne et de rendements quantiques supérieurs à 0,90. De même, les points quantiques ont des niveaux de luminosité tout aussi élevés. En revanche, les propriétés optiques des protéines fluorescentes des surligneurs optiques sont beaucoup moins optimales avec des coefficients d'extinction allant d'environ 15 000 à 85 000 et des rendements quantiques compris entre 0,05 et 0,80. De toute évidence, il existe un besoin important de concevoir génétiquement des protéines fluorescentes plus utiles pour l'imagerie en superrésolution.

En plus d'avoir des niveaux de luminosité élevés, les meilleures sondes pour la microscopie à superrésolution doivent présenter des profils spectraux pour les espèces actives et inactives qui sont suffisamment bien séparés et thermiquement stables pour que les énergies d'interconversion spontanée soient très faibles par rapport à l'énergie d'activation contrôlée par la lumière. Idéalement, ces sondes devraient également présenter une fiabilité de commutation élevée, de faibles taux de fatigue (en fait, le nombre de cycles de commutation pouvant survivre) et une cinétique de commutation qui peut être facilement contrôlée. En termes de photoblanchiment ou de photocommutation vers un état sombre, les meilleures sondes sont celles dont l'inactivation peut être équilibrée avec le taux d'activation pour garantir que seule une petite population de molécules est activée (pour être fluorescente) pour la lecture, et que ces molécules activées sont séparés par une distance supérieure aux limites de résolution du système de caméra. De plus, chaque molécule photoactivée doit émettre suffisamment de photons lorsqu'elle est dans un état activé pour déterminer avec précision ses coordonnées de position latérale.

En plus d'afficher l'émission de fluorescence nécessaire et d'autres propriétés photophysiques, les sondes de superrésolution PALM doivent également être capables de localiser leurs cibles avec une grande précision et présenter les niveaux de bruit de fond les plus bas possibles. Les protéines fluorescentes, les systèmes hybrides et les fluorophores synthétiques hautement spécifiques (tels que les MitoTrackers) sont capables de cibler sélectivement des assemblages de protéines ou des organites, mais la plupart des colorants synthétiques et des points quantiques doivent d'abord être conjugués à une molécule porteuse pour un étiquetage précis. Dans de nombreux cas, la proximité exacte de la sonde fluorescente à la cible est discutable, tout comme le nombre d'unités de fluorophore réelles impliquées, en particulier lorsque de petites molécules de colorant synthétiques ou des points quantiques sont conjugués à de grands anticorps. En outre, les variations des propriétés photophysiques (telles que le rendement quantique de fluorescence) induites par les fluctuations environnementales ou les interactions intermoléculaires peuvent compliquer l'analyse des données. Enfin, que l'analyse de localisation soit effectuée sur des cellules fixées ou vivantes, l'autofluorescence provenant des fixateurs et des réactifs de transfection peut souvent produire un signal de fond excessivement élevé, réduisant ainsi la précision de la localisation.

Propriétés des sondes fluorescentes sélectionnées pour la microscopie à superrésolution


Protéine
(Acronyme)
Ex
(nm)
Em
(nm)
CE
(x 10 -3 )
QY N photons
Émis
Contraste
Rapport
Quaternaire
Structure
Luminosité
(% de l'EGFP)
Protéines fluorescentes photoactivables
PA-GFP (N) 400 515 20.7 0.13 70 N / A Monomère 8
PA-GFP (G) 504 517 17.4 0.79 300 100 Monomère 41
PS-CFP2 (C) 400 468 43.0 0.20 ND N / A Monomère 26
PS-CFP2 (G) 490 511 47.0 0.23 260 1500 Monomère 32
PA-mCherry1 (R) 564 595 18.0 0.46 ND 4000 Monomère 25
PA-TagRFP (R) 562 595 66.0 0.38 500 550 Monomère 75
Protéines Fluorescentes photoconvertibles
mKikGR (G) 505 515 49.0 0.69 ND N / A Monomère 101
mKikGR (R) 580 591 28.0 0.63 970 400 Monomère 53
tdEos (G) 506 516 34.0 0.66 ND N / A Dimère tandem 165
tdEos (R) 569 581 33.0 0.60 750 >4000 Dimère tandem 59
mEos2 (G) 506 519 56.0 0.74 ND N / A Monomère 140
mEos2 (R) 573 584 46.0 0.66 500 >2000 Monomère 90
Dendra2 (G) 490 507 45.0 0.50 ND N / A Monomère 67
Dendra2 (D) 553 573 35.0 0.55 ND 300 Monomère 57
Protéines fluorescentes photocommutables
Dronpa 503 517 95.0 0.85 120 Monomère 240
Dronpa-3 487 514 58.0 0.33 ND ND Monomère 56
rsFastLime 496 518 39.1 0.77 ND ND Monomère 89
Padron 503 522 43.0 0.64 ND ND Monomère 82
bsDronpa 460 504 45.0 0.50 ND ND Monomère 67
KFP1 580 600 59.0 0.07 ND ND tétramère 12
mTFP0.7 453 488 60.0 0.50 ND ND Monomère 89
E2GFP 515 523 29.3 0.91 ND ND Monomère 79
rsCerise 572 610 80.0 0.02 ND ND Monomère 5
rsCherryRev 572 608 84.0 0.005 ND ND Monomère 1
Protéines fluorescentes photoconvertibles/photocommutables
IrisFP (G) 488 516 52.2 0.43 ND ND tétramère 67
IrisFP (R) 551 580 35.4 0.47 ND ND tétramère 50
Fluorophores synthétiques
Cy5 649 664 250.0 0.28 6000 ND N / A 208
Cy5.5 675 694 190.0 0.23 6000 ND N / A 130
Cy7 747 767 200.0 0.28 1000 ND N / A 167
Alexa Fluor 647 650 665 240.0 0.33 6000 ND N / A 236
ATTO 532 532 553 115.0 0.90 ND ND N / A 308
Rhodamine B 530 620 105.0 0.65 750 ND N / A 203
C-Rhodamine 545 575 90.0 0.90 ND ND N / A 241
C-Fluorescéine 494 518 29.0 0.93 ND ND N / A 80

Tableau 1

Une compilation des propriétés des protéines fluorescentes et des colorants synthétiques les plus utiles pour la microscopie à superrésolution est présentée dans le tableau 1. Avec le nom commun et/ou l'acronyme pour chaque fluorophore, les longueurs d'onde d'excitation maximale (Ex) et d'émission (Em), l'extinction molaire Le coefficient ( EC ), le rendement quantique ( QY ), la luminosité relative, le nombre de photons émis par molécule ( N Photons ) et la structure quaternaire physiologiquement pertinente sont répertoriés. La C-Rhodamine et la C-Fluorescéine font référence à des dérivés en cage. Les valeurs de luminosité calculées ont été dérivées du produit du coefficient d'extinction molaire et du rendement quantique, divisé par la valeur de l'EGFP. La désignation ND indique que les valeurs n'ont pas été déterminées, tandis que NA signifie que la valeur n'est pas applicable pour la sonde répertoriée. Cette liste a été créée à partir de ressources documentaires scientifiques et commerciales et ne prétend pas être exhaustive. Les valeurs de pic d'excitation et d'émission répertoriées peuvent varier dans les rapports publiés en raison, dans certains cas, des profils spectraux larges. Dans les enquêtes de microscopie à fluorescence réelles, la luminosité expérimentale d'un fluorophore particulier peut différer (en termes relatifs) de la luminosité fournie dans ce tableau. Parmi les nombreuses raisons potentielles de ces différences figurent les variations dépendantes de la longueur d'onde de la transmission ou de la réflectance de l'optique du microscope et de l'efficacité de la caméra.

La capacité intrinsèque d'un sous-ensemble de protéines fluorescentes à modifier leurs propriétés spectrales lors de l'exposition à la lumière d'une longueur d'onde spécifique couplée à leur excellente spécificité de ciblage a été largement exploitée en imagerie de superrésolution (voir les sondes répertoriées dans le tableau 1).Bien que les protéines fluorescentes soient connues pour subir une variété de caractéristiques de photocommutation induite par la lumière, y compris la génération d'états émissifs et non émissifs distincts ainsi qu'un comportement de clignotement allumé et éteint, les propriétés les plus utiles sont la photoactivation, la photoconversion et la photocommutation, propriétés qui peuvent être collectivement appelées mise en évidence optique (comme décrit ci-dessous). Les protéines fluorescentes photoactivables sont capables d'être activées d'un état sombre à un état fluorescent brillant lors d'un éclairage avec une lumière ultraviolette ou violette, tandis que les protéines fluorescentes photoconvertibles peuvent être optiquement transformées d'une bande passante d'émission de fluorescence à une autre. Parmi les membres les plus utiles de la boîte à outils des protéines fluorescentes photoactivables pour l'imagerie en superrésolution figurent PA-GFP et PA-mCherry1. les protéines fluorescentes photoconvertibles qui ont trouvé une utilité dans PALM et les techniques associées sont le dimère en tandem Eos (tdEos), mEos2, Dronpa, rsCherry (et le dérivé inverse) et PS-CFP2.

Les membres de la classe potentiellement la plus utile des surligneurs optiques à protéines fluorescentes, ceux qui sont capables de basculer entre un état fortement fluorescent et un état sombre, n'ont pas été particulièrement utiles dans les études de superrésolution d'une molécule unique en raison de la faible production de photons à l'état brillant. Dronpa a été utilisé en imagerie PALM bicolore, comme nous le verrons par la suite, mais est marginal par rapport à la plupart des protéines fluorescentes photoactivables et photoconvertibles en termes de production de photons par molécule. Cependant, Dronpa présente un contraste de photocommutation très élevé et émet une fluorescence pendant une période prolongée, ce qui peut être avantageux pour l'imagerie de cellules vivantes (par exemple, en utilisant le suivi d'une seule particule comme décrit ci-dessous). Outre l'exigence selon laquelle les protéines fluorescentes doivent afficher un certain type de comportement de mise en évidence optique pour l'imagerie en superrésolution, elles doivent également avoir une luminosité, des taux de maturation des chromophores et un caractère monomère suffisants pour exprimer la fusion sans artefacts, tels qu'un mauvais ciblage et un dysfonctionnement. De plus, l'oligomérisation dans les protéines fluorescentes peut présenter un problème en microscopie à superrésolution stochastique car il y a plus d'un chromophore pour chaque molécule sonde localisée.

Un nombre rapidement croissant de fluorophores organiques synthétiques apparaissent comme d'excellents candidats pour l'imagerie de superrésolution à molécule unique, y compris de nombreuses sondes traditionnelles utilisées depuis plusieurs décennies dans la préparation d'échantillons pour la microscopie à fluorescence à grand champ et confocale (voir Tableau 1). De nombreux composés que l'on pensait à l'origine photostables ont depuis été démontrés pour entrer dans des états sombres dans des conditions de faible teneur en oxygène en présence de thiols aliphatiques. Par conséquent, la photocommutation réversible est probablement un phénomène plus répandu qu'on ne le pensait à l'origine, ce qui ouvre la porte à un nombre encore plus grand de candidats potentiels à la sonde. De plus, une photoactivation irréversible peut être obtenue en « mettant en cage » des fluorophores avec une partie réactive protectrice qui est éliminée par irradiation avec de la lumière ultraviolette. Malheureusement, cependant, il n'y a eu aucun rapport à ce jour de composés organiques ou de points quantiques qui sont capables d'être photoconvertis d'une bande de longueur d'onde d'émission à une autre.

La figure 6 illustre les structures de ruban, les modèles moléculaires et/ou les dessins animés des diverses sondes fluorescentes qui sont potentiellement utiles dans l'imagerie de superrésolution à molécule unique. Le colorant carbocyanine synthétique, Cy5 (Figure 6 (a)) est significativement plus petit qu'un point quantique jaune (Figure 6 (c)) ou l'architecture polypeptidique en forme de canon bêta typique d'une protéine fluorescente (structure de ruban vert Figure 6 ( ré)). De même, toutes ces sondes sont de taille réduite par rapport à un anticorps IgG primaire ou secondaire, qui peut s'étendre sur 12 à 15 nanomètres de diamètre (structure en ruban rouge Figure 6 (b)). Les points quantiques doivent être traités avec des fragments d'anticorps, de la streptavidine, de la phalloïdine ou une autre fraction fonctionnelle afin de cibler des régions subcellulaires spécifiques. Dans de nombreux cas, la taille combinée d'un point quantique conjugué à un ou plusieurs anticorps secondaires peut aller jusqu'à 25 à 30 nanomètres, ce qui dépasse considérablement la taille d'une protéine fluorescente monomère. Les plus petites sondes fluorescentes sont les colorants synthétiques (figure 6 (a)), mais ceux-ci présentent une efficacité de ciblage relativement faible et génèrent généralement un signal de fond important.

Le principal avantage de l'utilisation de fluorophores synthétiques et de points quantiques par rapport aux protéines fluorescentes pour l'imagerie en superrésolution est leur luminosité intrinsèque élevée, leur excellente photostabilité, leur bon contraste et leur plus grande résistance à la fatigue. Par exemple, tdEos produit environ 750 photons par molécule contrairement aux plus de 6000 photons typiquement observés pour la combinaison de fluorophores photocommutables de Cy3 et Cy5. De plus, les colorants carbocyanines peuvent subir plus de 200 cycles de commutation avant photoblanchiment. Le principal inconvénient de l'utilisation de points quantiques et de fluorophores synthétiques est la difficulté de cibler des emplacements spécifiques et un signal de fond élevé par rapport aux protéines fluorescentes. La stratégie de ciblage la plus fiable pour les fluorophores de cette classe est la conjugaison à un anticorps primaire ou secondaire, bien qu'il ait été démontré que plusieurs nouveaux colorants synthétiques se localisent indépendamment dans des organites spécifiques.

L'inconvénient de l'utilisation d'anticorps et de techniques d'immunofluorescence pour marquer les structures intracellulaires pour l'imagerie en superrésolution est que les protéines sont trop grosses pour traverser les membranes et ne sont donc utiles que dans les cellules fixées et perméabilisées, à moins que la cible ne soit affichée sur la région externe de la membrane plasmique. Le marquage avec des anticorps est également relativement peu efficace et ajoute 10 à 20 nanomètres à l'incertitude de localisation entre le marqueur et la cible. De plus, les conjugués de points quantiques aux anticorps ne fonctionnent pas à égalité avec des conjugués analogues utilisant des colorants synthétiques tels que les Alexa Fluors et les carbocyanines. En perspective, cependant, l'utilisation d'anticorps pour cibler des sondes synthétiques pour PALM et les techniques associées fournit un niveau de signal beaucoup plus élevé que les protéines fluorescentes, qui sont plus utiles dans l'imagerie des cellules vivantes. Malheureusement, les piégeurs d'oxygène et les thiols nécessaires pour produire la photocommutation avec les colorants synthétiques populaires sont incompatibles avec les cellules vivantes, donc jusqu'à ce qu'une solution de contournement soit développée, les protéines fluorescentes seront les sondes de choix pour la microscopie à superrésolution des cellules vivantes.

Les points quantiques sont des nanocristaux semi-conducteurs inorganiques composés d'un noyau de séléniure de cadmium (CdSe) entouré d'une enveloppe de sulfure de zinc (ZnS) qui présentent des propriétés fluorescentes en raison de l'émission confinée d'excitons. Une couche de passivation et un revêtement hydrophile doivent être appliqués aux points quantiques pour les applications biologiques, et ils doivent également être conjugués à la streptavidine ou à des anticorps pour le ciblage. Le profil d'émission de fluorescence des points quantiques est remarquablement symétrique et présente généralement un rendement quantique élevé, alors que leur large profil d'absorption leur permet d'être excités sur une plage de longueurs d'onde inhabituellement large. La taille du noyau CdSe dicte le profil spectral d'émission, avec des noyaux plus petits (allant jusqu'à environ 2 nanomètres) émettant dans les régions bleue et cyan et des noyaux plus grands (5 à 7 nanomètres) émettant dans les longueurs d'onde jaune et rouge.

En général, la photostabilité des points quantiques dépasse considérablement celle de tous les autres fluorophores connus, y compris les fluorophores synthétiques et les protéines fluorescentes, ce qui crée un problème pour l'imagerie de superrésolution stochastique à moins que les points quantiques ne puissent être convertis en un état photocommutable. Récemment, des chercheurs ont démontré que le dopage au manganèse des points quantiques de ZnSe peut être utilisé pour générer une espèce qui peut être photocommutée de manière réversible avec une grande efficacité en utilisant la lumière sans avoir besoin d'activateurs ou d'extincteurs externes (effecteurs). Le ciblage reste un problème avec les points quantiques, cependant, les progrès continus de la chimie des points quantiques conduiront sans aucun doute à de nouvelles et meilleures sondes dans cette classe.

Parmi les sondes synthétiques réversibles photocommutables qui ont trouvé une utilité dans l'imagerie en superrésolution, figurent les dérivés de la rhodamine, les colorants carbocyanine (Cy2 à Cy7), Alexa Fluors et les colorants ATTO, de nouveaux candidats étant développés et testés en continu. Les colorants cyanine photocommutables ont été les sondes organiques synthétiques les plus largement utilisées dans l'imagerie à superrésolution stochastique. Le colorant proche infrarouge, Cy5, a été le plus utilisé et peut être utilisé sans effecteur, bien que la combinaison de Cy5 avec un chromophore secondaire (tel que Cy3, Cy2 ou Alexa Fluor 405) facilite considérablement la photocommutation. À titre d'exemple d'application, la combinaison de Cy5 avec Cy3 permet l'utilisation d'un laser rouge (635 nanomètres) pour photocommuter Cy5 vers un état sombre stable, tandis que l'exposition à une lumière de 543 nanomètres reconvertit Cy5 en espèces fluorescentes. Le taux de conversion en espèces fluorescentes dépend de la proximité de l'effecteur secondaire (Cy3).

Des combinaisons supplémentaires de colorants cyanine et Alexa Fluor, telles que Cy3 et Cy5.5 ou Cy7 et Alexa Fluor 647 avec Cy2 ou Cy3, ont été signalées, élargissant considérablement la palette de couleurs disponibles pour l'imagerie en superrésolution. En outre, il a été démontré qu'un grand nombre de produits synthétiques disponibles dans le commerce, y compris la plupart des familles de colorants Alexa Fluor et ATTO, effectuent une photocommutation réversible dans les cellules fixes à l'aide d'un protocole qui inclut des agents réducteurs contenant des thiols (mercaptoéthylamine, dithiothréitol ou glutathion) pour générer un état stable non fluorescent. Ainsi, le potentiel de génération de photocommutateurs organiques synthétiques pour l'imagerie multicolore, même si le mécanisme de commutation n'a pas encore été déterminé, dépasse actuellement la palette limitée de FP qui subissent une modulation induite par la lumière. La figure 7 présente les structures de plusieurs sondes synthétiques illustrant la grande diversité de fluorophores qui se sont révélés utiles pour l'imagerie en superrésolution.

Semblable aux FP photoactivables (PA-GFP et PA-mCherry), une grande bibliothèque de synthétiques en cage serait particulièrement utile pour l'imagerie de superrésolution stochastique. Malheureusement, seuls quelques candidats prometteurs ont été signalés à ce jour : des versions en cage de fluorescéine et de rhodamine, dont il a été démontré qu'elles agissent d'une manière similaire à la PA-GFP en imagerie PALM. En pratique, les synthétiques en cage sont libérés de leurs groupes esters protecteurs en utilisant une irradiation avec de la lumière ultraviolette pour générer une espèce fluorescente présentant un excellent contraste qui peut être localisée avec une grande précision puis photoblanchie. Jusqu'à ce qu'une plus grande variété de fluorophores en cage émerge, cette classe restera limitée dans les applications d'imagerie à superrésolution.

L'avenir de l'imagerie à superrésolution repose sur l'augmentation de la spécificité et de l'efficacité de marquage de fluorophores photocommutables très lumineux tout en diminuant simultanément la taille des peptides de ciblage. Un large éventail de systèmes hybrides conçus pour coupler des fluorophores synthétiques avec des cibles génétiquement codées pourraient un jour être capables d'atteindre cet objectif. Tous ces systèmes utilisent une séquence peptidique ou protéique qui est exprimée dans des cellules vivantes et est capable de recruter une petite molécule synthétique pour conférer une fluorescence. Le candidat le plus développé de cette classe utilise un motif tétracystéine fusionné à une variété de cibles génétiques pour recruter des fluorophores bleus, verts ou rouges (CHoAsH, FlAsH et ReAsH, respectivement) capables de se lier aux résidus de cystéine pour générer une sonde similaire dans spécificité aux MF. L'inconvénient majeur de ces combinaisons est l'incapacité à surmonter les niveaux de fond élevés de fluorophore non lié qui abaissent le contraste. Un certain nombre d'autres candidats de systèmes hybrides ont été développés, mais aucun n'a été utilisé de manière significative en imagerie à superrésolution.

Haut de la page ^ Microscopie superrésolution à deux couleurs

La réalisation d'une imagerie de superrésolution à molécule unique en deux couleurs nécessite une paire de sondes fluorescentes avec des spectres d'émission bien séparés et, dans le cas idéal, sont photocommutés ou photoactivés par un éclairage à différentes longueurs d'onde. Actuellement, la palette de protéines fluorescentes potentiellement utiles pour l'imagerie bicolore est limitée par les conflits de chevauchement spectral d'émission, la faible production de photons dans les sondes ayant des profils spectraux stratégiques (émission rouge) et le fait que la plupart des sondes de cette classe sont activées par lumière dans la même région de longueur d'onde (ultraviolet ou violet). Il y a beaucoup plus de potentiel pour coupler deux ou plusieurs fluorophores ensemble pour une imagerie simultanée ou séquentielle dans la classe croissante de sondes synthétiques, y compris les carbocyanines, Alexa Fluors et les colorants ATTO, qui peuvent être activés par des lignes laser dont la longueur d'onde va de 405 à plus plus de 647 nanomètres. Comme la clé de l'imagerie couleur double ou triple dans PALM et les techniques associées est la capacité d'identifier et de séparer temporellement l'émission de chaque sonde activée, la polyvalence offerte par les colorants synthétiques pour utiliser les longueurs d'onde d'émission, d'excitation ou d'activation pour distinguer les sondes est un atout puissant.

L'application de protéines fluorescentes pour l'imagerie multicolore est rendue plus difficile par le fait que la plupart des sondes émettrices de rouge actuellement disponibles ont une émission de fluorescence de pré-activation qui chevauche l'émission de post-activation des sondes émettrices de vert. Par exemple, le couplage de Dronpa et de tdEos est entravé par le fait que le profil spectral vert de Dronpa chevauche significativement le profil pré-converti de tdEos. Cependant, les chercheurs ont réussi à imager cette paire de protéines fluorescentes dans un PALM bicolore en photoactivant et en imageant tdEos jusqu'à ce que toutes les molécules soient détectées, localisées et photoblanchies avant de désactiver les molécules Dronpa à l'aide d'une lumière intense de 488 nanomètres. Les molécules Dronpa ont ensuite été réactivées, localisées et combinées avec les images tdEos pour construire une image finale en deux couleurs. En pratique générale, cependant, l'épuisement d'une sonde fluorescente avant l'imagerie de l'autre ne permet pas une imagerie bicolore de la même région à plusieurs moments et a peu de potentiel pour l'enregistrement d'événements dynamiques.

La figure 8 illustre l'organisation nanostructurale de l'actine cytosquelettique et de la protéine d'adhésion focale, la paxilline, dans une cellule de fibroblaste humaine (ligne HFF-1) imagée avec PALM bicolore. La figure 8 (a) est une image composite (superposition de deux couleurs) d'actine fusionnée à la protéine fluorescente Dronpa (pseudocolore vert) et de paxilline fusionnée au surligneur optique, tdEos (pseudocolore rouge), telles qu'elles apparaissent dans une adhérence focale à fort grossissement . La case blanche de la figure 8 (a) est agrandie sur la figure 8 (b) pour révéler qu'il y a très peu de chevauchement direct observé entre l'actine et la paxilline (pointes de flèches blanches), bien que les faisceaux d'actine se regroupent de manière dense autour de plusieurs adhérences fibrillaires de paxilline (flèches blanches) . En imagerie TIRF grand champ, l'actine et la paxilline semblent co-localiser dans les adhérences focales, contrairement aux informations fournies par la microscopie à superrésolution.

Une approche supérieure pour mener des expériences PALM à deux couleurs utilise des protéines fluorescentes émettant du vert et du rouge qui ont peu ou pas de chevauchement spectral. Le développement d'un dérivé de protéine fluorescente mCherry photoactivable photon fluorescent rouge à haut rendement photonique, PA-mCherry1, a permis l'imagerie bicolore avec le dérivé PA-GFP vert fluorescent de la protéine fluorescente verte. Ainsi, PA-GFP et PA-mCherry1 sont tous deux allumés simultanément avec un laser de 405 nanomètres, tandis que la fluorescence à molécule unique est imagée à l'aide de lasers de 488 nanomètres et 651 nanomètres, respectivement. Bien que PA-mCherry1 bénéficiera d'améliorations supplémentaires des performances, la sonde peut également potentiellement être utilisée avec plusieurs autres protéines fluorescentes photoactivables vertes, telles que Dronpa, rsFastLime et PS-CFP2 pour donner des résultats similaires. Au fur et à mesure que de nouveaux surligneurs optiques avec une sortie photonique et des propriétés spectrales améliorées sont développés, il y aura probablement des améliorations spectaculaires dans la capacité de mener des expériences PALM bicolores avec des protéines fluorescentes dans des cellules fixes et vivantes.

Les colorants carbocyanine photocommutables offrent une large palette de sondes pour l'imagerie PALM et STORM multicolore lorsqu'ils sont couplés à des fluorophores activateurs ayant des longueurs d'onde d'activation variables. Les colorants rouge lointain et proche infrarouge Cy5, Cy5.5 et Cy7, peuvent fonctionner comme des reporters accepteurs photocommutables pour une large gamme de colorants activateurs qui incluent Alexa Fluor 405, Cy2 et Cy3. Le mélange de l'appariement d'activateurs et de rapporteurs dans cette classe augmente le nombre de combinaisons potentielles qui peuvent être discriminées en fonction de leurs longueurs d'onde d'activation ou d'émission pour l'imagerie multicolore. De plus, les carbocyanines Cy5 à Cy7 peuvent également être activées et désactivées spontanément avec un seul laser sans avoir besoin d'activateurs tout en produisant des spectres d'émission de fluorescence facilement séparés. Un certain nombre de colorants xanthènes, tels que les Alexa Fluors dans la plage d'émission comprise entre 500 et 647 nanomètres et certains colorants photochromiques de rhodamine, ainsi que les colorants ATTO, peuvent être photocommutés avec le même laser, permettant potentiellement une imagerie multicolore. Les protéines fluorescentes peuvent également être combinées avec des colorants synthétiques pour l'imagerie multicolore, comme démontré pour PALMIRA en utilisant rsFastLime associé à Cy5. Au fur et à mesure que de nouvelles sondes sont développées et testées pour leur utilité dans l'imagerie de superrésolution à molécule unique, la liste des candidats pour les expériences multicolores augmentera sans aucun doute dans les années à venir.

Haut de page ^ Imagerie PALM tridimensionnelle

Telles qu'elles ont été développées à l'origine, PALM et les techniques de superrésolution de localisation de molécules uniques associées étaient en grande partie confinées à l'imagerie dans le plan latéral bidimensionnel pour acquérir des informations de position sur les fluorophores individuels. Le sondage de la dimension axiale était limité en raison de l'application de la microscopie à réflexion interne totale pour mettre en œuvre l'imagerie, et parce que les spécimens étaient constitués de sections relativement minces produites avec un microtome. Les deux méthodologies limitent l'imagerie dans le plan z à une profondeur d'environ 100 nanomètres, ce qui offre une certaine latitude par rapport à l'imagerie axiale de petites superstructures, mais est inférieure à la taille de beaucoup d'autres. Des informations de position verticales (axiales) étendues peuvent être révélées grâce à une variété de techniques combinées à la photoactivation et à la localisation. Ces méthodes peuvent être regroupées en plusieurs catégories différentes, y compris l'exploitation de la fonction d'étalement des points dépendant de z, l'examen de l'échantillon par une approche latérale et l'utilisation de l'interférométrie le long de la direction axiale.

En termes de fonction de diffusion ponctuelle dépendante de l'axe (z), l'exemple le plus simple est la défocalisation d'un objet ponctuel (tel qu'un émetteur de molécule unique) qui est positionné au-dessus ou au-dessous du plan d'image latéral de mise au point idéal. L'image d'une telle source ponctuelle peut s'élargir, développer des anneaux concentriques autour d'un pic central, ou autrement évoluer vers une forme qui s'écarte de la fonction normale d'étalement des points. L'approche de base de ce type d'imagerie consiste à capturer deux images simultanées dans deux plans latéraux différents, l'un sous-focalisé et l'autre surfocalisé.Ceci peut être accompli en utilisant un séparateur de faisceau couplé à des détecteurs réglés pour imager deux distances focales différentes. Le rapport des tailles de spot est une fonction monotone de la position axiale et peut être facilement calculé. Connue sous le nom de méthode biplan, cette approche a atteint entre 20 et 30 % de la résolution latérale PALM standard pour produire une fonction d'étalement de point pleine largeur à mi-hauteur (FWHM) d'environ 75 nanomètres avec des protéines fluorescentes. Le principal avantage de l'imagerie biplan est la relative simplicité d'accès à la dimension supplémentaire.

Une approche similaire de surfocalisation et de sous-focalisation peut être mise en œuvre le long de deux axes orthogonaux d'une même image, de sorte que l'axe x puisse se concentrer à une position axiale différente de l'axe y. La technique a d'abord été démontrée avec STORM par l'ajout d'une lentille cylindrique faible entre l'objectif et le détecteur EMCCD. En pratique, la fluorescence d'une seule molécule produit une image elliptique présentant un rapport de diamètres x et y qui révèle la position axiale relative de l'émetteur. La lecture des ellipticités fluorescentes a donné une résolution latérale d'environ 20 nanomètres et une résolution verticale de 50 à 60 nanomètres en utilisant des paires de colorants carbocyanine (Cy3 et Cy5) dans l'imagerie STORM. Des fonctions d'étalement ponctuelles dépendantes de l'axe plus exotiques ont été produites avec un modulateur spatial de phase. A titre d'exemple, une image double point peut être générée à partir d'une source ponctuelle unique où l'orientation angulaire de ce doublet dépend de la position axiale. Ainsi, l'orientation angulaire peut être utilisée comme une lecture des coordonnées axiales.

Comme alternative à la focalisation spatiale, des impulsions femtosecondes de lumière d'excitation peuvent être focalisées dans le temps, mais une configuration de microscope beaucoup plus sophistiquée est requise et la technique dépend d'une excitation linéaire non linéaire à deux photons plutôt qu'à un seul photon. Le principal avantage de cette méthode est que l'excitation parasite est réduite dans les régions éloignées de la zone d'intérêt. En tant que tel, cela préserve la fluorescence photoactivable, permettant à plusieurs plans de 1 micromètre de former des piles d'images PALM jusqu'à environ 10 micromètres d'épaisseur. Une stratégie différente de l'imagerie tridimensionnelle consiste à capturer une image PALM à partir d'une direction orthogonale en utilisant une image virtuelle en vue latérale générée par une surface de miroir réfléchie. La configuration du microscope implique le montage de l'échantillon dans un support contenant des miroirs à rainure en V ou simplement sur une surface de miroir fortement inclinée. Un logiciel spécialisé est requis pour l'étalonnage et pour calculer les données à partir des données combinées.

Peut-être que la meilleure résolution en imagerie tridimensionnelle d'une molécule unique est obtenue avec l'interférométrie combinée avec PALM. La technique est connue sous le nom d'interférence-PALM ( iPALM ), et a démontré une précision de localisation verticale de 10 nanomètres combinée à une précision de localisation latérale de 20 nanomètres à l'aide de marqueurs protéiques fluorescents. L'interférométrie est une technique courante pour mesurer les positions et est basée sur la façon dont la lumière interfère après avoir emprunté deux voies différentes dépendant de la position avant d'être recombinée avec un séparateur de faisceau. Les exigences particulières de cohérence, d'étalonnage et de tolérance de la nature fluctuante très instable de la fluorescence nécessitent une attention particulière aux détails de la configuration de l'instrument, qui est mieux mise en œuvre avec des objectifs opposés similaires à un système 4Pi. La cohérence peut être maintenue en réalisant que tout photon émis est toujours cohérent par rapport à lui-même, un concept critique pour iPALM. Une interférence impliquant le même photon qui emprunte deux chemins avec des longueurs de chemin différentes dépendant de l'axe satisfait cette exigence. L'exigence d'auto-étalonnage est également remplie par l'auto-interférence à photon unique et peut être tolérante aux fluctuations d'une source fluorescente en utilisant l'interférométrie multiphase simultanée fournie par un séparateur de faisceau spécialisé.

La figure 9 présente une comparaison des techniques de localisation de molécules uniques en trois dimensions pour les protéines fluorescentes et les colorants synthétiques en fonction du nombre de photons émis et de la résolution axiale et latérale FWHM. La précision tridimensionnelle de l'iPALM et de la technique de défocalisation est montrée en fonction du nombre de photons émis par les billes d'or. iPALM (représenté par des cercles et des carrés pleins) présente une meilleure précision de localisation par photon émis que les techniques de défocalisation (cercles et carrés ouverts) et affiche une meilleure résolution axiale (cercles rouges pleins) que latérale (carrés bleus pleins). En revanche, les techniques de défocalisation ont nettement moins de précision par photon émis dans la dimension axiale (cercles rouges non remplis) par rapport à la direction latérale (carrés bleus non remplis). En règle générale, la plupart des techniques de microscopie à fluorescence, y compris celles pour la superrésolution, présentent une résolution axiale plus faible que latérale, l'iPALM étant une exception.

Pour une évaluation complète des différentes approches PALM tridimensionnelles pour une expérience particulière, les contraintes pratiques sur les paramètres de l'échantillon doivent être prises en compte, notamment l'épaisseur tolérable, la taille latérale, l'échelle de temps, la densité et la précision de l'étiquetage de la sonde, ainsi que la résolution. Il convient de garder à l'esprit que la résolution n'est pas seulement un nombre instrumental, mais est en fait étroitement liée à l'approche d'étiquetage. Par exemple, des marqueurs plus brillants qui produisent plus de photons donnent une meilleure précision de localisation mais sont tempérés par des considérations telles que les longueurs de liaison des anticorps, la spécificité de ciblage et la densité du marquage moléculaire. Les marqueurs de protéines fluorescentes endogènes, tels que tdEos, ont une luminosité réduite et nécessitent une procédure de localisation plus efficace pour acquérir des données satisfaisantes. Les compromis impliqués pour les techniques d'imagerie et de défocalisation iPALM sont présentés dans la figure 9.

Haut de page ^ Imagerie de cellules vivantes avec PALM

Le processus répétitif de photoactivation, d'imagerie et de photoblanchiment impliqué avec PALM et des techniques similaires de localisation de molécule unique impose des contraintes temporelles importantes à l'observation des spécimens. Afin de migrer la technique vers l'imagerie des cellules vivantes, le processus PALM peut être accéléré en augmentant les intensités lumineuses d'activation et d'excitation pour accélérer le renouvellement des molécules, mais les cellules vivantes doivent être soigneusement surveillées pour s'assurer qu'elles sont en bonne santé. Bien que l'imagerie des cellules vivantes avec la microscopie à superrésolution en soit encore à ses balbutiements, plusieurs recherches servent à renforcer les bases sur lesquelles les recherches futures seront probablement basées. Celles-ci incluent l'utilisation de protéines fluorescentes de surligneur optique pour créer des images PALM en accéléré, pour déterminer les distributions ou les distances moyennes entre les molécules dans les cellules vivantes et pour créer des cartes moléculaires dynamiques. Semblable aux techniques décrites ci-dessus, la densité moléculaire imagée dans n'importe quel cadre unique d'une expérience PALM time-lapse doit rester suffisamment faible pour isoler des molécules uniques.

Un point important à noter est que dans le PALM à cellules vivantes, la densité de molécules localisées doit être suffisamment élevée pour créer une image de superrésolution si l'objectif est de mesurer les mouvements et les réarrangements de structures enrichies en protéines avec une précision de sous-diffraction. Pour cette raison, les structures macromoléculaires à déplacement lent, telles que les complexes d'adhésion focale, le cytosquelette d'actine filamenteux, les microtubules, les filaments intermédiaires ou les changements morphologiques du réticulum endoplasmique sont des candidats appropriés. En pratique, environ 500 à 1000 molécules par image doivent être imagées le plus rapidement possible avec la configuration de l'instrument (les intervalles de collecte de données doivent être limités à une minute ou moins). L'imagerie des cellules vivantes avec PALM a été réalisée sur des adhérences focales pour révéler qu'un complexe d'adhérence individuel se déplaçait à des taux variables, recrutait ou perdait différents nombres globaux de molécules et subissait différents changements de forme. Les études futures aborderont une foule d'autres scénarios d'imagerie.

Dans une mise en œuvre unique de l'imagerie PALM de cellules vivantes (voir la figure 10), des milliers de fusions de protéines fluorescentes individuelles ont été suivies avec une technique connue sous le nom de PALM de suivi de particule unique ( sptPALM ). Les trajectoires des protéines fluorescentes ont été utilisées pour comparer la distribution et la dynamique de deux protéines virales (la protéine G virale de la stomatite vésiculaire ts045, VSVG et la protéine structurale du virus de l'immunodéficience humaine de type 1, Gag) exprimées dans la membrane plasmique. Dans la figure 10, le mouvement moléculaire de la protéine fluorescente VSVG-tdEos a été imagé dans une cellule COS7 en utilisant une lumière de 561 nanomètres tout en photoactivant simultanément des sous-ensembles des molécules tdEos. Les molécules ont été localisées dans chaque trame et leurs positions déterminées dans des trames consécutives ont été liées en pistes. Les pistes de la figure 10 (a) représentent des molécules qui sont restées fluorescentes pendant plus de 0,75 seconde (tracées sous différentes couleurs pour distinguer les pistes individuelles). Le coefficient de diffusion pour chaque piste a été déterminé et tracé comme un cercle plein au début de la piste (Figure 10 (b)). Chaque piste s'est vu attribuer une couleur en fonction de sa valeur de diffusion.

Le résultat de l'imagerie sptPALM sur la figure 10 était des cartes spatialement résolues des coefficients de diffusion d'une molécule unique, qui ont révélé un comportement de diffusion étonnamment différent. Les molécules VSVG se sont avérées très mobiles pour explorer librement la membrane plasmique, tandis que les protéines Gag étaient souvent présentes dans des amas immobiles d'une taille approximative de particules pseudo-virales entre 100 et 200 nanomètres de diamètre. Des expériences similaires sur des bactéries utilisant Dendra2 ont suivi l'homologue de la tubuline de mammifère, Ftx, qui forme une structure filamenteuse hélicoïdale (appelée anneau Z) impliquée dans la cytokinèse bactérienne. Contrairement aux vidéos de superrésolution d'adhérences focales qui capturent une dynamique lente, le suivi moléculaire d'une seule particule peut révéler une dynamique beaucoup plus rapide dans des ensembles de molécules.

Bien qu'encore une technique émergente, la microscopie à superrésolution à molécule unique suscite une attention croissante parmi les biologistes intéressés à comprendre les processus cellulaires à l'échelle nanométrique. Un certain nombre de méthodologies sont actuellement disponibles et d'autres sont en cours de développement pour contourner la barrière de résolution limitée par la diffraction imposée par la microscopie à fluorescence à grand champ et confocale. Les techniques de superrésolution basées sur l'éclairage, telles que STED, GSD et SSIM, ont poussé les résolutions dans la plage de 30 à 50 nanomètres en utilisant des fluorophores conventionnels, tandis que les techniques de localisation de molécules uniques (PALM et STORM) nécessitent des sondes photoactivables spéciales. Les sondes conventionnelles ont été utilisées avec succès dans la localisation de molécules uniques en s'appuyant sur les transitions de molécules entre les états clairs et sombres, mais celles-ci peuvent très bien s'accompagner de la perte de densité moléculaire lors des étapes d'irradiation pré-expérimentales nécessaires pour abaisser la fluorescence vers l'imagerie à molécule unique. niveaux.

La principale force motrice de PALM est la simplicité totale du concept et de l'instrumentation, ne nécessitant qu'un microscope à fluorescence à grand champ modifié (pour effectuer l'imagerie d'une molécule unique) et la capacité d'exprimer des fusions fluorescentes dans des cultures cellulaires adhérentes. Cependant, l'avenir de PALM et des techniques de localisation de molécules uniques associées sera probablement éclairé par une instrumentation plus avancée et de nouveaux fluorophores qui sont de meilleurs émetteurs de photons avec d'excellentes caractéristiques de photocommutation et présentent une fluorescence sur l'ensemble du spectre visible. De plus, les chercheurs doivent garder à l'esprit que ces techniques ont commencé pour de bon il y a moins d'une décennie et peuvent encore être envisagées au stade de développement. Quoi qu'il en soit, les techniques sont suffisamment bien développées pour qu'une instrumentation commerciale soit maintenant disponible. À l'avenir, des améliorations du comportement photophysique des sondes fluorescentes couplées à des améliorations de l'instrumentation et de l'analyse pourraient augmenter la vitesse des expériences et réduire considérablement les temps d'acquisition. Malgré ces douleurs de croissance, le rythme rapide de la microscopie à superrésolution donne la certitude que l'imagerie sous la barrière de diffraction deviendra, dans les prochaines années, aussi courante que l'imagerie confocale l'est aujourd'hui.

Auteurs contributeurs

Eric Betzig et Harald F. Hess - Howard Hughes Medical Institute, Janelia Farm Research Campus, Ashburn, Virginie, 20147.

Hari Shroff - Section sur l'imagerie optique à haute résolution, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, 20892.

George H. Patterson - Section de biophotonique, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, 20892.

Jennifer Lippincott-Schwartz - Programme de biologie cellulaire et de métabolisme, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, 20892.

Michael W. Davidson - Laboratoire national de champ magnétique élevé, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Floride, 32310.


Figure 3

Figure 3. Photostabilité du GaInP par rapport au bisbenzimide et au FITC pour les balayages confocaux séquentiels. Intensité relative de l'ADN cellulaire marqué au bisbenzimide (bleu), des filaments d'actine marqués au FITC-phalloidine (vert) et des nanofils de GaInP (rouge) en fonction du numéro de trame confocale (chaque trame consistant en deux balayages séquentiels, un avec 405 nm et un avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm). Les nanofils sont moins sujets au photoblanchiment que le bisbenzimide et le FITC. Dans chaque cas, le signal a été normalisé à la valeur mesurée dans la trame initiale.

Comme preuve de principe que les hétérostructures GaP-GaInP peuvent être utilisées pour identifier les nanofils de la même manière que dans les systèmes d'identification par codes-barres, in vitro et in vivo, nous avons effectué deux séries d'expériences comme indiqué ci-dessous, pour différentes tailles de nanofils et pour nanofils avec différents traitements de surface.

Pour distinguer les nanofils de longueurs similaires mais de diamètres différents, nous avons synthétisé des nanofils de 40 nm de diamètre avec un seul segment fluorescent (GaP-GaInP) et des nanofils de 80 nm de diamètre avec deux segments fluorescents (GaP-GaInP-GaP-GaInP) (Figure 4) et ajoutés à une culture cellulaire (voir Informations complémentaires pour un protocole expérimental détaillé).


17.4 : Microscope - Biologie

un laboratoire clé de la structure et des matériaux supramoléculaires, Université de Jilin, Changchun 130012, République populaire de Chine
E-mail: [email protected], [email protected]

b Laboratoire national de Pékin pour les sciences moléculaires, CAS Key Laboratory of Organic Solids, Institute of Chemistry, Chinese Academy of Sciences, R.P. Chine

c Département de physique, chimie et biologie (IFM), Université de Linköping, Linkoping 58183, Suède

Résumé

Un complexe de polyoxométalate encapsulé dans un surfactant soluble dans l'alcool (<$1 par g), à haut rendement (>90%), soluble dans l'alcool [(C8H17)4N]4[SiW12O40] a été synthétisé et utilisé comme couche intermédiaire cathodique (CIL) dans les cellules solaires polymères (PSC). Un rendement de conversion de puissance de 10,1% peut être obtenu pour les PSC à base de PTB7-Th (poly[[2,6′-4,8-di(5-ethylhexylthienyl)benzo[1,2-b3,3-b]-dithiophène][3-fluoro-2[(2-éthylhexyl) carbonyl] thiéno [3,4-b]-thiophènediyle]]):PC71BM ([6,6]-phényl C71-acide butyrique ester méthylique) en raison de l'incorporation de [(C8H17)4N]4[SiW12O40]. Les mesures combinées des caractéristiques densité de courant-tension, du photocourant transitoire, de la mobilité des porteurs de charge et des caractéristiques capacité-tension démontrent que [(C8H17)4N]4[SiW12O40] peut augmenter efficacement le potentiel intégré, la densité et la mobilité des porteurs de charge et accélérer l'extraction des porteurs de charge dans les PSC. Plus important encore, le mécanisme d'utilisation de [(C8H17)4N]4[SiW12O40] car le CIL est en outre mis en lumière par la spectroscopie de photoémission aux rayons X (XPS) et la spectroscopie de photoémission ultraviolette (UPS) du métal/[(C8H17)4N]4[SiW12O40] interface. Les résultats suggèrent que [(C8H17)4N]4[SiW12O40] a non seulement diminué le travail de sortie des cathodes métalliques, mais a également été dopé au n au contact des métaux, ce qui donne un aperçu du mécanisme de fonctionnement des CIL, améliorant simultanément la tension en circuit ouvert, le courant de court-circuit et le facteur de remplissage dans les PSC.


6 TRADUCTION VLP VACCIN

De la R&D à la licence, les nouveaux vaccins peuvent prendre jusqu'à deux décennies pour se concrétiser et leur coût est estimé entre 500 millions USD et plus d'un milliard (S. A. Plotkin, Mahmoud, & Farrar, 2015 ). Les vaccins VLP sont en cours de développement depuis >30 ans (Lua et al., 2014). Aujourd'hui, il existe six vaccins VLP sous licence commerciale et plus de 110 essais de vaccins VLP (terminés et en cours) documentés sur www.clinicaltrials.gov. Plus de 50 % de ces essais sont conçus pour évaluer les vaccins candidats VLP contre divers cancers (où Merck Sharp & Dohme Corp. et GlaxoSmithKline plc. sont les principaux sponsors) et plus de 20 % contre la grippe (où Novavax, Inc. et Medicago Inc. dominent les épreuves). VBI Vaccines Inc. et Takeda Pharmaceutical Co. Ltd. mènent actuellement des essais de vaccins contre le cytomégalovirus et le norovirus, respectivement. Fabricants basés en Inde, CPL Biologicals Pvt. Ltd. ont développé Cadiflu-S, le premier vaccin antigrippal VLP au monde à terminer avec succès les essais de phase 3 (http://cadilapharma.com). Ces essais cliniques en plusieurs étapes évaluent l'innocuité et l'efficacité et déterminent l'aptitude des vaccins candidats à l'approbation d'une licence. Cependant, la réussite de la traduction des vaccins dépend de processus de fabrication de vaccins viables pour assurer un approvisionnement fiable en vaccins et minimiser les coûts de production.

6.1 Régulation et économie

Le coût accru et l'incertitude réglementaire associés à la production de nouveaux vaccins ont longtemps été des défis pour les fabricants de vaccins (Ulmer, Valley et Rappuoli, 2006). Les subtilités de la fabrication de vaccins exigent une quantité substantielle d'expertise et contribuent de manière significative aux coûts (S. Plotkin et al., 2017). Les dépenses associées à la R&D, aux tests et à la fabrication de vaccins ainsi qu'une faible marge bénéficiaire par rapport aux marchés actuels des médicaments ont entraîné une chute spectaculaire du financement des sociétés pharmaceutiques à but lucratif (Offit, 2005). Cependant, cette baisse est considérée comme prématurée. Comme démontré tout au long de cet examen, les technologies VLP progressent rapidement en mettant l'accent sur le développement des capacités de la plate-forme et l'amélioration des rendements de production de VLP pour permettre une production rapide de vaccins plus sûrs et moins chers, en particulier lorsqu'ils sont combinés avec des systèmes de biotraitement à usage unique. Ces progrès devraient se poursuivre avec des investissements financiers provenant de sources « à but non lucratif », telles que les gouvernements nationaux, les organisations internationales et les organismes philanthropiques. En particulier, Gavi, l'Alliance des vaccins (Balaji, 2004) et la Fondation Bill & Melinda Gates (www.gatesfoundation.org) sont motivés à fournir des vaccins abordables aux pays du tiers monde qui constituent le plus grand marché de vaccins au monde. Pour garantir la pureté, la sécurité, l'efficacité et la stabilité des vaccins, les autorités réglementaires régissent chaque étape de la fabrication des vaccins, des matières premières et des processus de production aux essais cliniques et au-delà. Cela comprend l'évaluation et la certification de procédés de fabrication sûrs et viables (S. Plotkin et al., 2017 ).Le respect des exigences réglementaires peut être un processus compliqué, en particulier lors de la fabrication de vaccins pour les marchés étrangers ou de l'utilisation de bioprocédés nouvellement développés. En rationalisant les processus en amont et en aval et en utilisant une base VLP générique, la technologie de plate-forme VLP devrait réduire la charge réglementaire des vaccins individuels étant donné que les réglementations pour la base et sa purification deviendront bien caractérisées. Les plateformes VLP peuvent même accélérer la livraison des vaccins en réponse à des circonstances pandémiques.


Remerciements

Nous tenons à remercier le Dr Stephen R. Palumbi de l'Université de Stanford pour l'espace de laboratoire, Raymond Direen de l'Aquarium de Monterey Bay pour avoir fourni les échantillons de coraux, et le Dr Varghese K. George et le Dr Savita Pahwa pour leur aide dans ce projet. Nous remercions le Dr Lorraine Ling et le Dr John R Pringle d'avoir aimablement fourni A. pallida souches. Nous remercions également Karla J. palmeri, le Dr Jody M. Beers et Paul A. K. Bump pour l'édition. Ce travail a été financé par la bourse postdoctorale OCE-1323652 de la National Science Foundation Ocean Science et le prix #1012629 du Burroughs Wellcome Postdoctoral Enrichment Fund for N.T.K. Le travail de B.R. a été soutenu par la bourse postdoctorale de la Human Frontier Science Program Organization et la subvention de formation en hématologie du NIH T32 HL120824-03.


Affiliations

Département de spectroscopie, Division de physique, Centre national de recherche, Dokki, Le Caire, 12622, Égypte

Adresse actuelle : Institut de Bioingénierie, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Lausanne, Suisse

Département de bionanoscience, Université de technologie de Delft, 2628 CJ, Delft, Pays-Bas

Laboratoire de Biologie Moléculaire Eucaryote (LBME), Centre de Biologie Intégrative (CBI), CNRS, UPS, Université de Toulouse, 31062, Toulouse, France


Voir la vidéo: Microscopy: Magnification, Resolution u0026 Types of Microscopes. A-level Biology. OCR, AQA, Edexcel (Août 2022).