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8 : Transcription - Biologie

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Bien que l'ADN soit un excellent support pour le stockage d'informations, la caractéristique même qui le rend si stable et intrinsèquement autocorrecteur - étant double brin - le rend également difficile à manier pour utiliser cette information génétique pour fabriquer des composants cellulaires. Étant donné que les parties informationnelles de la molécule (les bases azotées) sont verrouillées à l'intérieur de l'échelle, sa lecture nécessite la tâche énergétiquement coûteuse de briser toutes les liaisons hydrogène qui maintiennent les deux brins ensemble. Le faire pour chaque copie de chaque protéine nécessaire à la cellule prendrait non seulement beaucoup d'énergie, mais aussi beaucoup de temps. Au lieu de cela, il doit y avoir un mécanisme pour prendre les informations de l'ADN une fois (ou plusieurs fois), puis faire de nombreuses copies d'une protéine à partir de cette seule information. Ce mécanisme est la transcription.

Vignette : schéma simplifié de la synthèse et du traitement de l'ARNm. (CC BY 3.0 - non porté ; Kelvinsong).


8 : Transcription - Biologie

À la fin de cette section, vous serez en mesure de :

  • Lister les étapes de la transcription eucaryote
  • Discuter du rôle des ARN polymérases dans la transcription
  • Comparer et contraster les trois ARN polymérases
  • Expliquer la signification des facteurs de transcription

Les procaryotes et les eucaryotes effectuent fondamentalement le même processus de transcription, avec quelques différences clés. La différence la plus importante entre les procaryotes et les eucaryotes est le noyau et les organites liés à la membrane de ces derniers. Avec les gènes liés dans un noyau, la cellule eucaryote doit être capable de transporter son ARNm vers le cytoplasme et doit protéger son ARNm de la dégradation avant qu'il ne soit traduit. Les eucaryotes emploient également trois polymérases différentes qui transcrivent chacune un sous-ensemble différent de gènes. Les ARNm eucaryotes sont généralement monogéniques, ce qui signifie qu'ils spécifient une seule protéine.


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L'expression des gènes est contrôlée par un certain nombre de caractéristiques – régulation de la transcription et de la traduction :

Chez les eucaryotes, la transcription ou les gènes cibles peuvent être stimulés ou inhibés lorsque des facteurs transcriptionnels spécifiques se déplacent du cytoplasme vers le noyau. Comme seuls les gènes cibles sont transcrits, cela signifie que des protéines spécifiques sont fabriquées. Chaque type de cellule du corps a des cellules cibles différentes, de sorte qu'elles donnent des caractéristiques différentes, c'est-à-dire qu'une cellule nerveuse est différente d'un globule rouge. Les facteurs de transcription peuvent modifier le taux de transcription et le processus est le suivant :

  • Les facteurs de transcription entrent par diffusion dans le noyau à partir du cytoplasme.
  • Lorsqu'ils sont dans le noyau, ils peuvent se lier à la séquence promotrice (la séquence qui est le début du gène cible).
  • Les facteurs de transcription augmentent ou diminuent le taux de transcription selon s'ils se sont liés à la séquence promotrice.

Certains facteurs de transcription sont appelés activateurs lorsqu'ils augmentent le taux de transcription. Ceci est fait par les facteurs de transcription aidant l'ARN polymérase à se lier à la séquence promotrice pour activer la transcription. D'autres sont appelés répresseurs où ils diminuent le taux de transcription. Ceci est fait par les facteurs de transcription se liant à la séquence promotrice empêchant l'ARN polymérase de se lier. Cela arrête la transcription.

L'œstrogène peut initier la transcription de gènes cibles. NB : Parfois, cela peut faire d'un facteur de transcription un répresseur. Vous n'avez pas besoin de le savoir pour l'examen AQA. Un facteur de transcription peut être lié à un inhibiteur l'empêchant de se lier à la séquence promotrice. L'œstrogène se lie au facteur de transcription en formant un complexe œstrogène-récepteur d'œstrogène et modifie le site où l'inhibiteur est joint (appelé site de liaison à l'ADN). Cela signifie que l'inhibiteur est détaché permettant au facteur de transcription de se fixer à la séquence promotrice. NB : Vous n'avez pas besoin de connaître le nom de l'inhibiteur. De plus, le site de liaison à l'ADN sur le facteur de transcription reste modifié pendant que l'œstrogène s'y est lié.

Chez les eucaryotes et certains procaryotes, la traduction de l'ARNm produit à partir des gènes cibles peut être inhibée par l'interférence ARN connue sous le nom d'ARNi. Les molécules d'ARN courtes telles que le micro-ARN, connu sous le nom de miARN, et le petit ARN d'interférence, connu sous le nom de siARN, forment un complexe de silençage induit par l'ARN, connu sous le nom de RISC, avec des protéines. NB: Les petites molécules d'ARN connues pour être double brin dans les guides de révision ou dans les manuels scolaires, cela prête à confusion, il est donc préférable de commencer le processus car les miARN et les siARN sont simple brin. L'ARN forme un complexe avec une protéine qui est une enzyme appelée ARN hydrolase. miARN ne forme pas un complexe avec l'ARN hydrolase mais une autre protéine. Ces molécules d'ARN peuvent chacune faire un RISC avec plus d'une protéine et les protéines impliquées n'ont pas besoin d'être connues pour l'AQA. Les complexes se fixent chacun à leur séquence d'ARNm cible et empêchent la traduction de différentes manières. Voici comment cela se fait pour chaque petite molécule d'ARN :

  • siRNA/miRNA dans les plantes :
  • Les bases de l'ARNsi se fixent aux bases de l'ARNm par appariement de bases complémentaires.
  • L'ARN hydrolase hydrolyse le brin d'ARNm en fragments empêchant la traduction de se produire car toute la chaîne polypeptidique ne sera pas fabriquée

NB : Il n'est pas nécessaire de savoir que les fragments sont dégradés dans le corps de traitement. Si vous voulez apprendre cela, il n'y a pas de mal.

  • miARN chez les mammifères :
  • Les bases du miARN se fixent aux bases de l'ARNm par appariement de bases complémentaires.
  • Les ribosomes sont empêchés de se fixer au brin d'ARNm, ce qui empêche la traduction de se produire.

NB : Ici encore, il n'est pas nécessaire de savoir que l'ARNm est dégradé ou stocké dans l'organisme de traitement.

L'épigénétique implique des modifications héréditaires de la fonction des gènes, sans modification de la séquence des bases d'ADN. Ces changements sont causés par des changements dans l'environnement (plus d'exposition à la pollution) qui inhibent la transcription par :

  • Augmentation de la méthylation de l'ADN :Un groupe méthyle (connu sous le nom de marque épigénétique) s'attache à la cytosine qui doit faire partie du nucléotide qui est attaché à la guanine par une liaison phosphodiester. NB: Vous pouvez être confus en ce moment, mais regardez le diagramme ci-dessous d'un brin d'ADN et remarquez à quel nucléotide de cytosine le groupe méthyle se joint. Notez que le nucléotide à l'extrême droite du brin et le troisième à partir de la gauche n'ont pas de groupe méthyle car ils ne sont pas à côté d'un nucléotide avec la guanine comme base. La jonction du groupe méthyle ne doit pas être confondue en se joignant à la cytosine qui est complémentaire de la guanine sur l'autre brin car c'est faux. Aussi le groupe méthyle – CH3 – ne modifie pas la séquence de base mais la structure. Au fur et à mesure que la structure a changé, il est devenu plus difficile pour les enzymes de se fixer à l'ADN, arrêtant l'expression d'un gène. Si le gène suppresseur de tumeur n'est pas transcrit, il peut provoquer un cancer.

  • Diminution des histones associées : Un groupe acétyle – COCH3 – est une autre marque épigénétique qui se fixe aux protéines histones pour rendre la chromatine (mélange d'ADN enroulé autour des protéines histones) moins condensée pour faciliter l'expression génétique. Le problème survient lorsque l'histone désacétylase rompt la liaison entre la protéine histone et le groupe acétyle. L'ADN devient très condensé, ce qui rend difficile l'expression des gènes par les enzymes. NB : L'histone déacétylase peut être abrégée en HDAC mais il est préférable de conserver le nom complet.

Les modifications épigénétiques de l'ADN sont heureusement réversibles, elles sont donc de bonnes cibles pour les médicaments pour arrêter les effets de l'épigénétique. Ces médicaments peuvent soit arrêter la méthylation de l'ADN, soit inhiber l'histone désacétylase permettant aux groupes acétyle de rester attachés à l'ADN.


Comment fonctionnent les facteurs de transcription ?

Activateurs

Répresseurs


Résumé

1-palmitoyl-2-arachidonoyl- oxydésnLa -glycéro-3-phosphorylcholine (Ox-PAPC) régule à la hausse un spectre de cytokines inflammatoires et de molécules d'adhésion différentes de celles induites par les médiateurs inflammatoires classiques tels que le tumor necrosis factor-α (TNF-α) ou le lipopolysaccharide. Fait intéressant, Ox-PAPC induit également l'expression d'un ensemble de protéines similaires à celles induites par le TNF-α ou le lipopolysaccharide, qui incluent la protéine chimiotactique des monocytes chimiokines-1 (MCP-1) et l'interleukine (IL)-8. Pour élucider les mécanismes moléculaires de l'expression génique induite par Ox-PAPC et déterminer si Ox-PAPC et d'autres médiateurs inflammatoires tels que le TNF-α utilisent des voies de signalisation communes, nous avons examiné la régulation transcriptionnelle de l'IL-8 par Ox-PAPC et TNF- dans les cellules endothéliales aortiques humaines. L'Ox-PAPC et le TNF-α ont tous deux induit l'expression de l'ARNm de l'IL-8 d'une manière dépendante de la dose, cependant, la cinétique de l'accumulation de l'ARNm de l'IL-8 entre les 2 ligands différait. L'ARNm de l'IL-8 induit par Ox-PAPC a été observé dès 30 minutes, a culminé entre 4 et 8 heures et a diminué considérablement en 24 heures. En revanche, la synthèse d'ARNm d'IL-8 induite par le TNF-α était élevée à 30 minutes, a culminé à 2 heures et a atteint des niveaux basaux/indétectables en 6 heures. Les expériences d'actinomycine D ont suggéré qu'à la fois Ox-PAPC et TNF-α régulent l'expression de l'IL-8 au niveau transcriptionnel. De plus, la demi-vie de l'ARNm de l'IL-8 pour les deux ligands était similaire (<30 minutes), suggérant que la stabilité de l'ARNm n'était pas responsable des différences de cinétique d'accumulation d'IL-8 entre les 2 ligands. Des études de transfection transitoire avec des constructions rapporteurs contenant 1,48 kb du promoteur IL-8 ont identifié une région de réponse spécifique à Ox-PAPC entre -133 et -1481 pb du promoteur IL-8. En revanche, l'activation du TNF-α du promoteur IL-8 a été médiée presque entièrement par les éléments de réponse du facteur nucléaire-κB et de la protéine d'activation-1 présents entre -70 et -133 pb du promoteur IL-8. Ainsi, bien que Ox-PAPC et TNF-α aient tous deux induit la synthèse d'IL-8, nos données suggèrent que les 2 ligands utilisent des mécanismes différents dans la régulation de la transcription d'IL-8.

Nous avons déjà montré que le 1-palmitoyl-2-arachidonoyl- oxydésnLa -glycéro-3-phosphorylcholine (Ox-PAPC), un composant bioactif majeur des LDL minimalement modifiées (MM-LDL), est présente dans les lésions athéroscléreuses et d'autres sites d'inflammation chronique. 1,2 Semblable à d'autres cytokines inflammatoires telles que le facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α), Ox-PAPC active les cellules endothéliales pour améliorer les interactions monocytes-endothéliales en partie par l'induction de chimiokines telles que la protéine chimiotactique des monocytes-1 (MCP-1 ) et l'interleukine (IL)-8. 3,4 Il est intéressant de noter que Ox-PAPC (ou MM-LDL) mais pas le TNF-α améliore la liaison monocytes-endothélial en médiant l'activation des integr1-intégrines, entraînant le dépôt du domaine de connexion du segment 1 de la fibronectine sur la surface apicale de cellules endotheliales. 5 D'autre part, le TNF-α améliore les interactions endothéliales-monocytes par l'induction de la sélectine E et de la molécule d'adhésion cellulaire vasculaire-1, qui ne sont pas affectées par Ox-PAPC. 6 Ainsi, Ox-PAPC et TNF-α utilisent des modèles d'induction d'expression génique à la fois similaires et distincts pour initier des interactions endothéliales-monocytes. Bien que les mécanismes moléculaires de l'induction des gènes par le TNF-α soient bien compris, les récepteurs cibles, les voies de signalisation et les mécanismes moléculaires par lesquels Ox-PAPC (1) initie des changements fonctionnels dans les cellules endothéliales et (2) améliore les interactions endothéliales-monocytes ne sont pas connu.

L'IL-8, un membre de la famille des chimiokines CXC, a été initialement caractérisée comme un facteur chimiotactique et activateur des neutrophiles. 7,8 L'IL-8 a par la suite été identifiée comme jouant un rôle important dans de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques. 9,10 Plus récemment, l'IL-8 a été impliquée dans l'activation des monocytes et la chimiotaxie endothéliale au cours de l'angiogenèse. 11 L'ARNm de l'IL-8 s'est avéré élevé dans les lésions athéroscléreuses des artères carotides humaines athérectomisées ainsi que dans les cellules spumeuses des macrophages dans l'athérome humain. 12 Le traitement Ox-LDL et la charge en cholestérol induisent l'ARNm de l'IL-8 dans les macrophages. 13 Gerszten et al 14 ont démontré que l'IL-8 est critique pour l'adhésion ferme des monocytes aux cellules endothéliales activées. La transplantation de moelle osseuse de souris dépourvues du récepteur CXC-2 (un orthologue du récepteur humain IL-8) dans des souris déficientes en récepteurs LDL a entraîné une réduction du développement de l'athérosclérose dans les aortes des receveurs. 15 Ces données suggèrent que l'IL-8 contribue au développement de l'athérosclérose.

Un certain nombre de ligands tels que le TNF-a et le lipopolysaccharide induisent la synthèse d'IL-8 dans un certain nombre de types cellulaires, y compris les cellules endothéliales. 16-18 L'induction de l'IL-8 par le TNF-α, l'IL-1β, l'IL-6 et le lipopolysaccharide est régulée au niveau de la transcription. 18,19 Le promoteur IL-8 contient des sites de liaison consensus pour le facteur nucléaire-κB (NF-κB), la protéine de liaison à l'amplificateur CCAAT-β (C/EBPβ) et la protéine d'activation-1 (AP-1), tous situés dans la région proximale entre -70 et -133 pb du promoteur de l'IL-8 humaine. 20 Dans les macrophages et les cellules épithéliales, le TNF-α et d'autres cytokines inflammatoires activent le promoteur IL-8 par liaison coopérative de ces 3 facteurs de transcription à un Enhanceosome composite entre -70 et -133 pb du promoteur proximal. 21-24 Ox-PAPC et MM-LDL induisent l'accumulation de protéine IL-8 dans les surnageants de cellules endothéliales aortiques humaines (HAEC) 3 cependant, les mécanismes de la synthèse d'IL-8 induite par Ox-PAPC ne sont pas connus. Dans un effort pour déterminer les mécanismes moléculaires par lesquels Ox-PAPC induit l'expression du gène IL-8, nous avons examiné la régulation de l'IL-8 par Ox-PAPC et TNF-α dans les HAEC.

Méthodes

Réactifs

Les milieux de culture tissulaire et les réactifs ont été obtenus auprès d'Irvine Scientific Inc. Le sérum de veau fœtal (FBS) a été obtenu auprès de Hyclone. PAPC a été acheté auprès de Sigma, et Ox-PAPC a été préparé comme décrit précédemment. 2 L'oxydation a été contrôlée par spectrométrie de masse et arrêtée lorsque > 90 % de PAPC ont été oxydés. Dans ces conditions, une formation minimale de lysophosphatidylcholine a été observée. Ainsi, les profils de spectrométrie de masse de l'Ox-PAPC utilisés dans les présentes études étaient similaires à ceux précédemment montrés. 2 Les concentrations d'endotoxines dans les solutions de phospholipides étaient de <0,1 pg/mL. Le TNF-a a été acheté auprès de R&D. Les oligonucléotides AP-1 (5′-CTAGTGATGAGTCAGCCGCGGATC-3′), NF-κB (5′-GATCCAGGGGACTTTCCCTAGC-3′) et Oct-1 (5′-TGTCGAATGCAAATCACTAGA-3′) pour le test de déplacement de mobilité électrophorétique ont été achetés auprès de Santa Cruz Biotechnologie. Les radio-isotopes ont été achetés auprès d'Amersham Pharmacia Biotech. Le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM)/milieu à haute teneur en glucose pour la culture cellulaire HeLa et le milieu M199 pour la culture HAEC ont été achetés auprès de Gibco/BRL.

Culture de cellules

Les HAEC ont été isolées des anneaux aortiques de cœurs de donneurs explantés comme décrit précédemment 1 et cultivées dans du milieu M199 supplémenté avec 20% (vol/vol) de FBS, pénicilline-streptomycine (100 U/mL et 100 g/mL, respectivement Gibco/BRL) , pyruvate de sodium (1 mmol/L), héparine (90 g/mL, Sigma) et facteur de croissance des cellules endothéliales (20 g/mL, Fisher Scientific). Des cellules HeLa (American Type Culture Collection, Manassas, Va) ont été cultivées dans du milieu DMEM/haute teneur en glucose avec 10 % (vol/vol) de FBS et pénicilline-streptomycine.

Plasmides et mutagenèse dirigée

Construction de plasmides rapporteurs de luciférase avec un promoteur IL-8 humain plus long (-1481 à +44 pb), un promoteur IL-8 plus court (-133 à +44 pb) et plusieurs copies de NF-κB individuel, C/EBPβ, ou des éléments AP-1 a été décrit précédemment. 25 Des mutations dans les éléments NF-κB et AP-1 dans le contexte de la construction rapporteur de luciférase contenant le promoteur IL-8 plus long de -1481 à +44 pb (p[-1481/+44]-Luc) ont été créées avec un kit de mutagenèse dirigée disponible dans le commerce (QuickChange, Stratagene) et protocoles fournis par le fabricant. Les amorces de mutation des 3 éléments ont été conçues comme décrit précédemment 26,27 et personnalisées à partir d'Invitrogen. L'élément NF-κB a été muté de TGAATTTCCT à TGGAATTTaaa et l'élément AP-1, de TGACTCA à TGACTgt.

Transfection transitoire

Les cellules HeLa ont été étalées dans des boîtes de culture à 6 puits (2 x 105 cellules par puits) dans du milieu DMEM/haute teneur en glucose contenant 10 % de FBS. Toutes les transfections ont été réalisées avec un total de 1 µg par puits d'ADN avec le Superfect Reagent (8 µL par puits, Qiagen) selon le protocole du fabricant. Quatre heures après la transfection, les cellules ont été stimulées avec Ox-PAPC ou TNF-a dans du DMEM/milieu à haute teneur en glucose/1 % de FBS. Après 12 heures, les lysats cellulaires totaux ont été collectés et analysés pour l'activité de la luciférase en utilisant un kit de système de dosage de la luciférase (Promega). L'activité luciférase a été normalisée à celle de la pSV-β-galactosidase cotransfectée (Promega).

Dosage immuno-enzymatique

Les niveaux d'IL-8 dans les surnageants HAEC ont été mesurés avec un kit ELISA IL-8 (Quantikine, R&D) selon le protocole du fabricant.

Buvardage du nord

L'ARN cellulaire total a été isolé des cellules HAEC et HeLa en utilisant des réactifs Trizol (Gibco/BRL) selon le protocole du fabricant. La sonde d'ADNc de l'IL-8 humaine (un Écofragment RI d'ADNc d'IL-8 humaine) a été radiomarqué avec du [α-32P]dCTP par la méthode d'amorçage aléatoire. Une sonde glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase a été incluse pour la normalisation, et des analyses quantitatives ont été effectuées dans toutes les expériences avec un phosphoimageur (Kodak).

Extraction des protéines nucléaires et dosage du décalage de la mobilité électrophorétique

Les cellules HeLa ont été préincubées avec du milieu DMEM/haute teneur en glucose contenant 1 % de FBS pendant 1 jour. Les cellules ont été traitées pendant 30 minutes avec Ox-PAPC, TNF-a et phorbol 12-myristate 13-acétate (Sigma). Les cellules ont ensuite été récoltées et remises en suspension dans 50 L de tampon de lyse cellulaire (10 mmol/L HEPES pH 7,9, 10 mmol/L KCl, 1,5 mmol/L MgCl2, 0,5 mmol/L de dithiothréitol [DTT] et 0,1 % de NP-40) et incubé sur de la glace pendant 10 minutes. Les lysats cellulaires ont été mélangés brièvement et centrifugés à 10 000 tr/min pendant 10 minutes à 4°C. Ensuite, les culots ont été remis en suspension dans 15 L de tampon de lyse des noyaux (20 mmol/L HEPES pH 7,9, 1,5 mmol/L MgCl2, 5 mmol/L de DTT, 0,5 mmol/L d'EDTA, 5 mmol/L de PMSF, 25 % de glycérol et 0,42 mol/L de NaCl) et incubé sur de la glace pendant 15 minutes. Les lysats nucléaires ont été brièvement mélangés et centrifugés à 14 000 rpm pendant 15 minutes à 4°C. Les surnageants ont été collectés et conservés à -80°C pour de futures études de test de déplacement de mobilité électrophorétique. La concentration en protéines a été déterminée par la méthode de Bradford.

L'essai de déplacement de mobilité électrophorétique a été effectué comme décrit précédemment. 28 En bref, les oligonucléotides ont été marqués avec du [γ-32 P]ATP en utilisant la polynucléotide kinase T4 et purifiés dans des colonnes Microspin (Bio-Rad). Pour chaque réaction de 10 L, 8 g de protéine d'extrait nucléaire et 1 L d'oligonucléotides marqués purifiés ont été incubés avec 1 L de dI-dC (1 g/μL) et 1 L de tampon de liaison 10× (10 mmol/L Tris- HCl pH 7,5, 50 mmol/L NaCl, 0,5 mmol/L EDTA, 1 mmol/L MgCl2, 0,5 mmol/L de DTT et 4 % de glycérol) à température ambiante pendant 20 minutes. Les échantillons ont été soumis à une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide non dénaturé à 4 % dans du tampon Tris-borate-EDTA 0,5 x à 100 V pendant 1 heure. Les gels ont été séchés et exposés à un phosphoimageur 32P pendant 2 heures à une nuit, en fonction de l'intensité de la radioactivité sur les gels séchés.

Résultats

Synthèse d'ARNm et de protéines d'IL-8 induite par Ox-PAPC dans les HAEC

Nous avons précédemment montré que Ox-PAPC induit l'accumulation de protéine IL-8 dans les surnageants HAEC. 3 Pour déterminer si l'accumulation de protéine IL-8 induite par Ox-PAPC était le résultat d'une nouvelle synthèse d'ARNm d'IL-8, nous avons effectué une analyse par transfert Northern sur des HAEC traités avec différentes concentrations d'Ox-PAPC et de PAPC. Ox-PAPC a induit la synthèse d'ARNm d'IL-8 de manière dose-dépendante (figure 1A). Les HAEC non traités et traités au PAPC (jusqu'à 100 g/mL) avaient un message IL-8 très minime, voire inexistant (figure 1A). Ox-PAPC a également induit une accumulation de protéine IL-8 dans les surnageants HAEC d'une manière dose-dépendante (figure 1B).

Figure 1. Ox-PAPC induit le message IL-8 et la protéine. Les HAEC ont été traités avec différentes concentrations d'Ox-PAPC (0 à 100 g/mL) et de PAPC (0 à 100 g/mL). Quatre heures plus tard, l'ARN total et le surnageant ont été collectés pour déterminer les niveaux d'ARNm d'IL-8 induite par Ox-PAPC (A) et de protéine (B). Les résultats sont représentatifs de 4 expériences distinctes, les barres d'erreur ont été déterminées statistiquement avec des triples de la même condition dans 1 expérience.

La cinétique de l'accumulation d'ARNm d'IL-8 est différente dans les HAEC traités par Ox-PAPC et par TNF-α

Nous avons ensuite examiné l'évolution dans le temps de l'accumulation de messages d'IL-8 induite par le TNF-α et par l'Ox-PAPC dans les HAEC. Les transcrits d'IL-8 induits par Ox-PAPC ont été observés dès 30 minutes (augmentation de 3 fois), ont culminé entre 4 et 8 heures (augmentation d'environ 60 fois) et ont diminué de manière significative en 24 heures (augmentation de 8 fois). et 2B). En revanche, les niveaux d'ARNm d'IL-8 induits par le TNF-α étaient maximaux en 2 heures (induction de 300 fois) mais sont revenus à la ligne de base en 6 heures (figures 2A et 2B). En présence de cycloheximide, l'ARNm de l'IL-8 était encore augmenté de 65 fois, suggérant que la nouvelle synthèse de protéines ne joue pas de rôle dans cette induction prolongée par Ox-PAPC. La protéine IL-8 a été détectée dans les surnageants HAEC traités par Ox-PAPC dès 2 heures, et les niveaux augmentaient encore à 24 heures (figure 2C). La protéine IL-8 induite par le TNF-α s'est accumulée dès 1 heure et a culminé entre 8 et 12 heures. Il n'y avait pas de différence significative dans le niveau d'IL-8 après 12 heures (figure 2D). Ces données suggèrent que l'accumulation de la protéine IL-8 est parallèle à l'induction de l'ARNm de l'IL-8 par les 2 agents.

Figure 2. Ox-PAPC et TNF-α induisent l'ARNm et la protéine de l'IL-8, mais avec des cinétiques différentes. Les HAEC ont été traités soit par Ox-PAPC (50 g/mL) soit par TNF-α (2 ng/mL). L'ARN total et le milieu ont été collectés à différents intervalles de temps (0 à 24 heures). A, des Northern blots ont été réalisés avec 5 ug d'ARN total extrait de HAEC traités par Ox-PAPC- (panneau supérieur) ou TNF-α- (panneau inférieur). B, Analyse par phosphoimage de Northern blots d'ARNm d'IL-8 induite par Ox-PAPC et TNF-α. Tous les niveaux de message IL-8 ont été normalisés aux niveaux de glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase. C et D, des ELISA ont été effectués sur des surnageants HAEC pour déterminer les niveaux de synthèse de protéine IL-8 induite par Ox-PAPC (C) et TNF-α (D) à différents intervalles de temps (0 à 24 heures). Les résultats sont représentatifs de 3 expériences distinctes.

Ox-PAPC a augmenté l'accumulation d'ARNm d'IL-8 en augmentant la transcription

Pour déterminer si l'accumulation d'ARNm d'IL-8 se produit au niveau de la transcription, les HAEC ont été prétraités avec de l'actinomycine D (400 nmol/L) pendant 30 minutes puis traités avec soit Ox-PAPC (50 g/mL) soit TNF-α (20 ng/mL) pendant 2 heures. L'analyse par transfert de Northern (figure 3A) a montré que l'actinomycine D inhibait complètement la transcription de l'IL-8 à la fois par Ox-PAPC et par TNF-a (87 % et 91 % de réduction, respectivement figure 3B). Pour déterminer si les différences de régulation post-transcriptionnelle de l'IL-8 expliquaient les différences de cinétique d'induction de l'IL-8 par Ox-PAPC et TNF-α, les HAEC ont été traités avec Ox-PAPC ou TNF-α pendant 2 heures avant l'actinomycine. D (400 nmol/L) et l'ARNm de l'IL-8 a été quantifié à différents moments. Le transcrit de l'ARNm de l'IL-8 était complètement dégradé en 1 heure pour le TNF-a et l'Ox-PAPC (figure 3B), indiquant que la demi-vie de l'ARNm de l'IL-8 pour les deux était similaire (<30 minutes). These data suggest that both Ox-PAPC-induced and TNF-α-induced IL-8 expression is regulated at the level of transcription in HAECs (Figure 3C).

Figure 3. Ox-PAPC and TNF-α regulate IL-8 message at the level of transcription. HAECs were treated with or without actinomycin D (400 nmol/L) for 30 minutes and then with Ox-PAPC (40 μg/mL) or TNF-α (2 ng/mL). Two hours later, total RNA were extracted and IL-8 message induced by TNF-α and Ox-PAPC was determined by Northern blot (A) and quantified by phosphoimage analysis (B). All IL-8 message levels were normalized to glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase levels. The stability of induced IL-8 mRNA by both ligands was determined by measuring the message half-life. HAECs were first treated with either Ox-PAPC or TNF-α. Two hours later, actinomycin D (400 nmol/L) was added to inhibit any further synthesis of new message. Total RNA was extracted at different time intervals (0, 1, 2, and 4 hours) after addition of actinomycin D. Northern blots and phosphoimager analysis were performed to quantify the levels of IL-8 mRNA (expressed as the percentage of IL-8 message amount at 0 hours) induced by Ox-PAPC (solid line) or TNF-α (dashed line). Results are representative of 2 separate experiments.

Ox-PAPC and TNF-α Activated Reporter Constructs Containing a 1.48-kb IL-8 Promoter

Both Ox-PAPC and TNF-α induced IL-8 protein synthesis in HeLa cells (data not shown) therefore, IL-8 promoter regulation study was performed in this easily transfected cell type. To determine whether Ox-PAPC can induce transcriptional activation of the human IL-8 promoter, HeLa cells were transiently transfected with a luciferase reporter plasmid containing −1481 to +44 bp of the human IL-8 promoter and were then treated with various concentrations of Ox-PAPC. Ox-PAPC induced luciferase activity in a dose-dependent fashion, suggesting that Ox-PAPC response elements are present in the first 1.48 kb of the IL-8 promoter (Figure 4).

Figure 4. Ox-PAPC and TNF-α activate luciferase reporter constructs containing the IL-8 promoter. HeLa cells were transiently transfected for 2 hours with 0.8 μg per well of p(−1481/+44)-Luc, together with 0.2 μg per well of β-galactosidase expression plasmid, as described in Methods. Transfected cells were treated with various concentrations of Ox-PAPC (from 25 to 40 μg/mL) or TNF-α (2 ng/mL) for 12 hours. Cell lysates were collected and assayed for luciferase and β-galactosidase activities. Luciferase activities were expressed in arbitrary units after being normalized against β-galactosidase activities. Results are representative of 3 separate experiments.

Studies on NF-κB, AP-1, and Oct-1 Activation

To determine whether NF-κB, C/EBPβ, or AP-1 response elements participate in Ox-PAPC-mediated transcriptional activation, reporter constructs containing multiple NF-κB (p[NF-κB]3-Luc), C/EBPβ (p[C/EBPβ]3-Luc), or AP-1 (p[AP-1]3-Luc) elements were transiently transfected into HeLa cells. TNF-α strongly activated p[NF-κB]3-Luc by 7-fold, whereas Ox-PAPC had no effect (Figure 5A). On the other hand, Ox-PAPC mildly activated the p[AP-1]3-Luc construct (Figure 5B), whereas TNF-α had no effect. Plasmid p[C/EBPβ]3-Luc was not activated by either TNF-α or Ox-PAPC (data not shown). Furthermore, nuclear extracts from cells treated with TNF-α but not Ox-PAPC showed increased binding activity to a [γ- 32 P]ATP-labeled NF-κB consensus sequence from the human IL-8 promoter (Figure 5C). TNF-α did not affect AP-1 binding activity in HeLa nuclear extracts, whereas a minimal increase was seen with Ox-PAPC (Figure 5C). Phorbol 12-myristate 13-acetate, an AP-1 activator, served as a positive control. Previous studies had shown that the induction of IL-8 may be the result of downregulation of Oct-1, a constitutive repressor of the C/EBPβ response element. 29 Because Ox-PAPC did not induce NF-κB and only minimally induced AP-1 activity, we hypothesized that Oct-1 binding activity might be decreased by Ox-PAPC and result in induction of IL-8. However, nuclear extracts from HeLa cells treated with Ox-PAPC or TNF-α showed no decrease in Oct-1 binding activity on the electrophoretic mobility shift assay (Figure 5C).

Figure 5. Activation of NF-κB, AP-1, and Oct-1. HeLa cells were transiently transfected with 0.8 μg of (A) p[NF-κB]3-Luc or (B) p[AP-1]3-Luc as per the aforementioned protocol in the legend to Figure 4. Transfected cells were treated with either 30 μg/mL Ox-PAPC (solid black bar) or 2 ng/mL TNF-α (dotted bar) for 12 hours. Results were shown in luciferase activity units that were normalized against β-galactosidase activities. p[NF-κB]3-Luc is a luciferase reporter construct with 3 copies of the NF-κB responsive element and p[AP-1]3-Luc, with 3 copies of the AP-1 responsive element. C, HeLa cell nuclear extracts were harvested after 30 minutes of stimulation with Ox-PAPC (40 μg/mL), TNF-α (2 ng/mL), phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, 20 ng/mL), or control media (C). [γ- 32 P]ATP-labeled NF-κB, AP-1, and Oct-1 oligonucleotides were individually incubated with 5 μg of nuclear extracts at room temperature for 20 minutes. Reaction products were run on nondenatured gels and exposed to phosphoimage analysis. These image values were used to calculate the fold induction (above lanes) compared with untreated cells, and all values obtained were well within the linear range of phosphoimage measurement. Results are representative of 2 separate experiments.

An Ox-PAPC-Responsive Element Is Located in the Upstream Region of the Human IL-8 Promoter

To determine the sequences in the IL-8 promoter important for Ox-PAPC-induced transcription, reporter constructs containing different lengths of the IL-8 promoter (−1481 to +44 and −133 to +44) were transiently transfected into HeLa cells. The IL-8 promoter construct containing p[−1481/+44]-Luc was activated by Ox-PAPC however, the construct containing p[-133/+44]-Luc was only mildly activated by Ox-PAPC (Figure 6B). In contrast, TNF-α activated both the longer p[−1481/+44]-Luc and the shorter p[−133/+44]-Luc constructs (>17-fold, Figure 6A). Thus, deletion of the upstream region of the IL-8 promoter from −1481 to −133 bp resulted in a 75% reduction in promoter activation by Ox-PAPC (Figures 6A and 6B), suggesting that an Ox-PAPC-response region resides between −1481 and −133 bp of the human IL-8 promoter. Individual mutations in the conserved response elements (NF-κB and AP-1) generated in the context of the longer construct p[−1481/+44]-Luc] resulted in significant inhibition of TNF-α-induced IL-8 promoter activation but only slightly decreased Ox-PAPC-induced activation (Figures 6A and 6B).

Figure 6. Ox-PAPC mediates IL-8 promoter activation through an Ox-PAPC-specific response region between −133 and −1481 bp of the IL-8 promoter. HeLa cells were transiently transfected with 2 luciferase reporter plasmids, p[−1481/+44]-Luc and p[−133/+44]-Luc, or with 3 separate p[−1481/+44]-Luc constructs containing site-directed mutations of the NF-κB or AP-1 element, as described in Methods. Transfected cells were treated with either 30 μg/mL Ox-PAPC (A) or 1 ng/mL TNF-α (B). Results are shown as the fold induction above control. P-1481 indicates p[−1481/+44]-Luc P-133, p[−133/+44]-Luc. Results are representative of 3 separate experiments.

Discussion

This study is the first to examine the mechanism by which Ox-PAPC, an oxidatively fragmented lipid component of MM-LDL, regulates transcription. In this study, Ox-PAPC was compared with the more thoroughly characterized regulation of IL-8 by TNF-α. Our results demonstrate that the major effect of Ox-PAPC on the IL-8 promoter is involved with an upstream sequence between −1481 and −133 bp. There are several responsive elements present in this region of the human IL-8 promoter that have been known for years, eg, the glucocorticoid responsive element and the hepatocyte nutrition factor-1 binding site, which are located at positions −330 to −325 bp and −381 to −376 bp, respectively, upstream from the TATA box. 20 Neither has been demonstrated to have a transcription-enhancing property in fact, activated glucocorticoid responsive element mediates the downregulation of NF-κB-activated transcription by interfering with the binding of NF-κB p65 to its cis-element 30 or by directly interfering with transactivation of the NF-κB p65 subunit. 31 There is no other cis-element in the human IL-8 promoter that has been described. Thus, we propose that there is a novel cis-element located in the 5′-flanking region between −1481 and −133 bp of the human IL-8 promoter. One likely candidate for this putative distant enhancer may be the peroxisome proliferator-activated receptor response element (PPRE).

Recently, work from our laboratory has shown that MM-LDL and Ox-PAPC activate PPRE and peroxisome proliferator-activated receptor-α activators and stimulate the production of MCP-1 and IL-8 in HAECs. 3 Additionally, the PPRE has been reported to function as an indispensable cis-enhancing element that may be located as far as −2 kb upstream from the transcription initiation site. 32 These observations support the notion that the PPRE may be the cis-enhancing element responsive to Ox-PAPC in the 5′-flanking sequence of the human IL-8 promoter.

In our current study, by using both gel shift assays and transient transfection experiments, neither the NF-κB nor AP-1 signaling pathway was activated by Ox-PAPC. This result is different from previous data showing activation of NF-κB and AP-1 signaling by Ox-LDL, 33–35 MM-LDL, 36 or oxidized phospholipids, such as platelet-activating factor-like lipids. 37 Activation of NF-κB by Ox-LDL was demonstrated to be a result of enhanced phosphorylation of inhibitor-κB in monocytes. 34 Platelet-activating factor-like lipids, enzymatically oxidative fragmentation products of ether-containing phosphatidylcholine, activate NF-κB signaling in the cells expressing platelet-activating factor receptors, such as monocytes. 37 MM-LDL was also shown by electrophoretic mobility shift assay to activate binding to an NF-κB consensus sequence. 36 Although Ox-PAPC activates the AP-1 element in isolation, it only minimally increased AP-1 binding on the electrophoretic mobility shift assay and activated the longer IL-8 promoter with the AP-1 mutation. Thus, we have demonstrated that unlike Ox-LDL, the AP-1 element is not important in the human IL-8 promoter activation by Ox-PAPC.

The difference in the effects of Ox-LDL, MM-LDL, platelet-activating factor-like lipids, and Ox-PAPC may be related to the different cell types used for these studies. Furthermore, they may be related to the different bioactive lipid components in Ox-PAPC versus Ox-LDL and platelet-activating factor-like lipids. We found that 1-palmitoyl-2-(5,6-epoxyisoprostane E2)-sn-glycero-3-phosphocholine, an oxidative fragmented product purified from Ox-PAPC, is the major bioactive lipid that enhances monocyte binding to endothelial cells. 38 The level of this phospholipid is quite low in Ox-LDL furthermore, Ox-PAPC, being ester derived, does not contain platelet-activating factor-like lipids. In a separate study, it will be shown that 1-palmitoyl-2-(5,6-epoxyisoprostane E2)-sn-glycero-3-phosphocholine and its dehydration product are the lipids in Ox-PAPC that are mainly responsible for inducing IL-8 in HAECs.

In summary, this current study has provided information on the mechanism by which Ox-PAPC induces IL-8 transcription. We have demonstrated that Ox-PAPC transcriptionally regulates IL-8 and causes a prolonged increase in transcription, compared with TNF-α. This prolonged increase was not secondary to new protein synthesis. We have also shown that the induction of IL-8 by Ox-PAPC, unlike that by Ox-LDL or TNF-α, is not mediated by way of the NF-κB signaling pathway. IL-8 upregulation by Ox-PAPC is also not a result of activation of NF-κB, C/EBPβ, and AP-1 or of downregulation of a constitutive transcriptional repressor Oct-1. Rather, we have demonstrated that Ox-PAPC induces IL-8 expression by activation of a putative cis-enhancer element in the upstream IL-8 promoter sequence. Our results showing differential regulation of the IL-8 promoter by Ox-PAPC compared with that by TNF-α provide a basis for the differences previously reported in genes activated by the 2 agents.

This work was supported by National Institutes of Health (NIH) grant HL30568 and NIH training grant 5T32HL07895.

Received July 16, 2001 revision accepted July 27, 2001.

We thank Dr Yin Tintut for her technical support in several key experiments in this work.


Transcription: from DNA to mRNA

Both prokaryotes and eukaryotes perform fundamentally the same process of transcription, with the important difference of the membrane-bound nucleus in eukaryotes. With the genes bound in the nucleus, transcription occurs in the nucleus of the cell and the mRNA transcript must be transported to the cytoplasm. The prokaryotes, which include bacteria and archaea, lack membrane-bound nuclei and other organelles, and transcription occurs in the cytoplasm of the cell. In both prokaryotes and eukaryotes, transcription occurs in three main stages: initiation, elongation, and termination.

Initiation

Transcription requires the DNA double helix to partially unwind in the region of mRNA synthesis. The region of unwinding is called a transcription bubble . The DNA sequence onto which the proteins and enzymes involved in transcription bind to initiate the process is called a promoter . Dans la plupart des cas, les promoteurs existent en amont des gènes qu'ils régulent. The specific sequence of a promoter is very important because it determines whether the corresponding gene is transcribed all of the time, some of the time, or hardly at all (Figure 2).

Figure 2: The initiation of transcription begins when DNA is unwound, forming a transcription bubble. Enzymes and other proteins involved in transcription bind at the promoter.

Élongation

Transcription always proceeds from one of the two DNA strands, which is called the template strand . The mRNA product is complementary to the template strand and is almost identical to the other DNA strand, called the nontemplate strand , with the exception that RNA contains a uracil (U) in place of the thymine (T) found in DNA. During elongation, an enzyme called RNA polymerase proceeds along the DNA template adding nucleotides by base pairing with the DNA template in a manner similar to DNA replication, with the difference that an RNA strand is being synthesized that does not remain bound to the DNA template. As elongation proceeds, the DNA is continuously unwound ahead of the core enzyme and rewound behind it (Figure 3).

Figure 3: During elongation, RNA polymerase tracks along the DNA template, synthesizes mRNA in the 5′ to 3′ direction, and unwinds then rewinds the DNA as it is read.

Résiliation

Une fois qu'un gène est transcrit, la polymérase procaryote doit recevoir l'instruction de se dissocier de la matrice d'ADN et de libérer l'ARNm nouvellement créé. Depending on the gene being transcribed, there are two kinds of termination signals, but both involve repeated nucleotide sequences in the DNA template that result in RNA polymerase stalling, leaving the DNA template, and freeing the mRNA transcript.

On termination, the process of transcription is complete. In a prokaryotic cell, by the time termination occurs, the transcript would already have been used to partially synthesize numerous copies of the encoded protein because these processes can occur concurrently using multiple ribosomes (polyribosomes) (Figure 4). En revanche, la présence d'un noyau dans les cellules eucaryotes empêche la transcription et la traduction simultanées.

Figure 4 : De multiples polymérases peuvent transcrire un seul gène bactérien tandis que de nombreux ribosomes traduisent simultanément les transcrits d'ARNm en polypeptides. De cette façon, une protéine spécifique peut rapidement atteindre une concentration élevée dans la cellule bactérienne.


Quelle est la relation entre la transcription et la traduction ?

Transcription est le processus de création d'une copie d'ARN d'une séquence de gènes. Traduction est le processus de traduction de la séquence d'une molécule d'ARN messager en une séquence d'acides aminés au cours de la synthèse des protéines. Ainsi, la relation entre les deux processus est qu'ils sont tous deux impliqués dans la synthèse des protéines et que la transcription est la première, puis la traduction est la deuxième. En fin de compte, c'est tout ce que nous savons sur la transcription et la traduction en termes de génétique. Continuez à lire si vous voulez en savoir plus sur la transcription et la traduction quand on parle de services.

Qu'il s'agisse d'un discours public, d'une interview, d'une étude de marché ou d'un rapport financier, si vous souhaitez que votre message atteigne un public le plus large possible, vous devriez envisager de le transcrire puis de le traduire dans vos langues cibles. Alors, c'est parti !

La transcription

Tout comme en génétique, la transcription doit avoir lieu en premier. C'est, selon Merriam Webster, l'acte de faire une copie écrite, imprimée ou dactylographiée des mots qui ont été prononcés. Avoir un format texte documenté de vos fichiers audio et vidéo est absolument nécessaire pour les entreprises, par exemple. C'est une façon pragmatique de garder une trace et de mieux comprendre ce qui se dit. Si vous avez aimé l'idée, planifiez soigneusement car il faut beaucoup de temps à toute personne inexpérimentée en transcription pour transformer un enregistrement audio en un document en texte clair. Astuce : laissez cette tâche fatigante et fastidieuse à nos transcripteurs professionnels qui garantissent confidentialité, précision et la plus haute qualité.

La traduction

Une fois que vous avez une transcription prête et relue, vous pouvez poursuivre la traduction. C'est essentiellement l'acte de changer une langue en une autre. Cependant, dans la pratique, il ne s'agit pas simplement de changer les mots en leurs équivalents dans différentes langues. Une traduction de qualité implique de connaître le contexte et le contexte culturel d'où proviennent les mots du texte original, puis de choisir des mots et des phrases dans la nouvelle langue qui transmettront le mieux la substance et le sens de l'original dans un contexte culturel nouveau et différent. À moins que tout cela ne se produise, le message peut être mal interprété ou même perdu. De plus, si vous envisagez d'investir des ressources pour ce service, assurez-vous de rechercher le meilleur timing, la simplicité et l'adaptation au public.


Regulated nuclear translocation of the Mig1 glucose repressor.

Glucose represses the transcription of many genes in bakers yeast (Saccharomyces cerevisiae). Mig1 is a Cys2-His2 zinc finger protein that mediates glucose repression of several genes by binding to their promoters and recruiting the general repression complex Ssn6-Tup1. We have found that the subcellular localization of Mig1 is regulated by glucose. Mig1 is imported into the nucleus within minutes after the addition of glucose and is just as rapidly transported back to the cytoplasm when glucose is removed. This regulated nuclear localization requires components of the glucose repression signal transduction pathway. An internal region of the protein separate from the DNA binding and repression domains is necessary and sufficient for glucose-regulated nuclear import and export. Changes in the phosphorylation status of Mig1 are coincident with the changes in its localization, suggesting a possible regulatory role for phosphorylation. Our results suggest that a glucose-regulated nuclear import and/or export mechanism controls the activity of Mig1.


Voir la vidéo: 8. Transcription (Août 2022).