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Quels milieux de culture sont adaptés aux cellules épithéliales des joues ?

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Il y a un mois, j'ai essayé d'isoler des cellules de joue de la salive et l'expérience a été un succès, cependant, je me demandais s'il était possible de cultiver ces cellules in vitro. Je dirais que c'est possible, mais je n'ai pas pu trouver de publications sur ce sujet en ligne, même sur PubMed (j'en ai trouvé une, mais elle était obsolète et la partie avec les médias utilisés n'était pas claire). Est-il possible d'utiliser uniquement des médias DMEM et si oui, combien de temps les cellules survivront-elles dans les médias, ou existe-t-il d'autres alternatives ?


Culture cellulaire primaire : 3 techniques (avec schéma)

La culture primaire implique largement les techniques de culture réalisées après l'isolement des cellules, mais avant la première sous-culture. Les cultures primaires sont généralement préparées à partir de masses tissulaires importantes. Ainsi, ces cultures peuvent contenir une variété de cellules différenciées, par ex. fibroblastes, lymphocytes, macrophages, cellules épithéliales.

Grâce à l'expérience du personnel travaillant dans les laboratoires de culture tissulaire, les critères/caractéristiques suivants sont pris en compte pour un développement efficace des cultures primaires :

une. Les tissus embryonnaires plutôt que les tissus adultes sont préférés pour les cultures primaires. Cela est dû au fait que les cellules embryonnaires peuvent être facilement désagrégées et produire des cellules plus viables, en plus de proliférer rapidement in vitro.

b. La quantité de cellules utilisées dans la culture primaire doit être plus élevée car leur taux de survie est sensiblement inférieur (par rapport aux sous-cultures).

c. Les tissus doivent être traités avec un minimum de dommages aux cellules pour une utilisation en culture primaire. De plus, les cellules mortes doivent être éliminées.

ré. La sélection d'un milieu approprié (de préférence riche en nutriments) est conseillée. Pour l'ajout de sérum, la source bovine fœtale est préférée plutôt que le sérum de veau ou de cheval.

e. Il est nécessaire d'éliminer les enzymes utilisées pour la désagrégation des cellules par centrifugation.

Techniques pour la culture primaire :

Parmi les différentes techniques conçues pour la culture primaire de tissus isolés, trois techniques sont les plus couramment utilisées :

1. Désagrégation mécanique.

2. Désagrégation enzymatique.

3. Technique d'explantation primaire.

Un aperçu de ces techniques est illustré à la figure 36.1, et les procédures sont brièvement décrites :

Technique # 1. Désagrégation mécanique :

Pour la désagrégation des tissus mous (par exemple la rate, le cerveau, le foie embryonnaire, les tumeurs molles), une technique mécanique est généralement utilisée. Cette technique consiste essentiellement à hacher ou à trancher soigneusement les tissus en morceaux et à collecter les cellules déversées.

Les cellules peuvent être collectées de deux manières :

je. Pressage des morceaux de tissu à travers une série de tamis avec une réduction progressive de la taille des mailles.

ii. Forcer les fragments de tissus à travers une seringue et une aiguille.

Bien que la désagrégation mécanique implique le risque de dommages cellulaires, la procédure est moins coûteuse, rapide et simple. Cette technique est particulièrement utile lorsque la disponibilité du tissu est abondante et que l'efficacité du rendement n'est pas très cruciale. Il faut cependant noter que la viabilité des cellules obtenues à partir des techniques mécaniques est bien inférieure à la technique enzymatique.

Technique # 2. Désagrégation enzymatique :

La désagrégation enzymatique est principalement utilisée lorsqu'une récupération élevée de cellules est requise à partir d'un tissu. La désagrégation des tissus embryonnaires est plus efficace avec un rendement plus élevé de cellules grâce à l'utilisation d'enzymes. Cela est dû à la présence de moins de tissu conjonctif fibreux et de matrice extracellulaire. La désagrégation enzymatique peut être effectuée en utilisant de la trypsine, de la collagénase ou d'autres enzymes.

Désagrégation par trypsine :

Le terme trypsinisation est couramment utilisé pour la désagrégation des tissus par l'enzyme trypsine.

De nombreux travailleurs préfèrent utiliser de la trypsine brute plutôt que de la trypsine pure pour les raisons suivantes :

je. La trypsine brute est plus efficace en raison de la présence d'autres protéases

ii. Les cellules peuvent mieux tolérer la trypsine brute.

iii. L'activité résiduelle de la trypsine brute peut être facilement neutralisée par le sérum des milieux de culture (lorsque des milieux sans sérum sont utilisés, un inhibiteur de trypsine peut être utilisé pour la neutralisation).

La désagrégation des cellules peut également être réalisée en utilisant de la trypsine pure qui est moins toxique et plus spécifique dans son action. Le tissu souhaité est coupé en morceaux de 2-3 mm puis soumis à une désagrégation par la trypsine. Il existe deux techniques de trypsinisation-trypsinisation à chaud et trypsinisation à froid (Fig. 36.2).

Trypsinisation à chaud (Fig. 36.2A) :

Cette méthode est largement utilisée pour la désagrégation des cellules. Le tissu coupé est lavé avec une solution saline de dissection (DBSS), puis transféré dans un flacon contenant de la trypsine chaude (37°C). Le contenu est agité, et toutes les trente minutes, le surnageant contenant les cellules dissociées peut être collecté. Après élimination de la trypsine, les cellules sont dispersées dans un milieu adapté et conservées (en gardant le flacon sur de la glace).

Le processus d'ajout de trypsine fraîche (aux morceaux de tissu), d'incubation et de collecte des cellules dissociées (à des intervalles de 30 minutes) est effectué pendant environ 4 heures. Les cellules désagrégées sont regroupées, comptées, diluées de manière appropriée puis incubées.

Trypsinisation à froid (Fig. 36.2B) :

Cette technique est plus appropriée appelée trypsinisation avec pré-exposition au froid. Le risque d'endommagement des cellules par une exposition prolongée à la trypsine à 37°C (en trypsinisation à chaud) peut être minimisé dans cette technique.

Après avoir été coupés et lavés, les morceaux de tissu sont conservés dans un flacon (sur de la glace) et trempés dans de la trypsine froide pendant environ 6 à 24 heures. La trypsine est retirée et jetée. Cependant, les morceaux de tissu contiennent de la trypsine résiduelle. Ces morceaux de tissu dans un milieu sont incubés à 37°C pendant 20-30 minutes. Les cellules se dispersent par pi-pets répétés. Les cellules dissociées peuvent être comptées, diluées de manière appropriée puis utilisées.

La méthode de trypsinisation à froid entraîne généralement un rendement plus élevé de cellules viables avec une survie améliorée des cellules après 24 heures d'incubation. Cette méthode n'implique ni agitation ni centrifugation et peut être facilement adoptée en laboratoire. La principale limitation de la trypsinisation à froid est qu'elle n'est pas adaptée à la désagrégation de cellules à partir de grandes quantités de tissus.

Limites de la désagrégation de la trypsine :

La désagrégation par la trypsine peut endommager certaines cellules (par exemple les cellules épithéliales) ou elle peut être presque inefficace pour certains tissus (par exemple le tissu conjonctif fibreux). Par conséquent, d'autres enzymes sont également utilisées pour la dissociation des cellules.

Désagrégation par collagénase :

Le collagène est la protéine structurelle la plus abondante chez les animaux supérieurs. Il est principalement présent dans la matrice extracellulaire du tissu conjonctif et du muscle. L'enzyme collagénase (généralement une enzyme brute contaminée par des protéases non spécifiques) peut être utilisée efficacement pour la désagrégation de plusieurs tissus (normaux ou malins) qui peuvent être sensibles à la trypsine.

Des qualités hautement purifiées de collagénase ont été essayées, mais elles sont moins efficaces par rapport à la collagénase brute. Les étapes importantes de la désagrégation de la collagénase, représentées sur la figure 36.3, sont brièvement décrites ci-dessous.

Le tissu souhaité en suspension dans une solution de sel basal, contenant des antibiotiques est coupé en morceaux. Ces morceaux sont lavés par décantation, puis mis en suspension dans un milieu complet contenant de la collagénase. Après incubation pendant 1 à 5 jours, les morceaux de tissu sont dispersés par pipetage. Les amas de cellules sont séparés par décantation. Les cellules épithéliales et les cellules fibroblastiques peuvent être séparées.

La désagrégation de la collagénase a été utilisée avec succès pour le cerveau humain, les poumons et plusieurs autres tissus épithéliaux, en plus de diverses tumeurs humaines et d'autres tissus animaux. L'ajout d'une autre enzyme hyaluronidase (agit sur les résidus glucidiques à la surface des cellules) favorise la désagrégation.

La collagénase en combinaison avec la hyaluronidase s'avère très efficace pour dissocier le foie de rat ou de lapin. Cela peut être fait en perfusant l'ensemble de l'organe in situ. Certains chercheurs utilisent la collagénase en association avec la trypsine, une formulation développée dans le sérum de poulet, pour la désagrégation de certains tissus.

Utilisation d'autres enzymes dans la désagrégation :

La trypsine et la collagénase sont les enzymes les plus largement utilisées pour la désagrégation. Certaines protéases bactériennes (par exemple pronase, dispase) ont été utilisées avec un succès limité. Outre la hyaluronidase, la neuraminidase est également utilisée conjointement avec la collagénase pour une dégradation efficace des glucides de la surface cellulaire.

Technique # 3. Technique d'explantation primaire :

La technique d'explantation primaire était en fait la méthode originale, développée par Harrison en 1907. Cette technique a subi plusieurs modifications et est toujours utilisée. La procédure simplifiée adoptée pour la culture d'explants primaires est illustrée à la figure 36.4 et brièvement décrite ci-dessous.

Le tissu en solution basale de sel est finement haché et lavé par décantations. La solution de sel basal est ensuite éliminée. Les morceaux de tissu sont répartis uniformément sur la surface de croissance. Après addition d'un milieu approprié, l'incubation est effectuée pendant 3 à 5 jours. Puis le milieu est changé toutes les semaines jusqu'à ce qu'une importante excroissance de cellules soit observée. Maintenant, les explants sont prélevés et transférés dans un nouveau récipient de culture.

La technique d'explantation primaire est particulièrement utile pour la désagrégation de petites quantités de tissus (par exemple, des biopsies cutanées). Les deux autres techniques de désagrégation mécanique ou enzymatique ne conviennent cependant pas pour de petites quantités de tissus, car il y a un risque de perdre les cellules.

La limitation de la technique d'explantation est la faible adhérence de certains tissus à la surface de croissance et la sélection de cellules dans l'excroissance. Il est cependant observé que la technique d'explantation primaire peut être utilisée pour une majorité de cellules embryonnaires, par ex. fibroblastes, myoblastes, cellules épithéliales, cellules gliales.

Séparation des cellules viables et non viables :

C'est une pratique courante d'éliminer les cellules non viables pendant que la culture primaire est préparée à partir des cellules désagrégées. Ceci est généralement effectué lors du premier changement de support. Le très petit nombre de cellules non viables restantes se dilue et disparaît progressivement au fur et à mesure que la prolifération des cellules viables commence.

Parfois, les cellules non viables des cultures primaires peuvent être éliminées par centrifugation. Les cellules sont mélangées avec du ficoll et du métrizoate de sodium et centrifugées. Les cellules mortes forment un culot au fond du tube.

Éthique médicale et mesures de sécurité dans les techniques de culture :

Puisque les techniques de culture impliquent l'utilisation de tissus animaux ou humains, il est absolument nécessaire de suivre plusieurs mesures de sécurité et d'éthique médicale. En fait, dans certains pays, il existe une législation/des normes établies pour la sélection et l'utilisation des tissus dans les cultures. Par exemple, au Royaume-Uni, la loi de 1986 sur les expérimentations animales (procédures scientifiques) est appliquée.

La manipulation des tissus humains pose plusieurs problèmes que l'on ne rencontre habituellement pas avec les tissus animaux. Lorsqu'il s'agit de matériel fœtal et de biopsies humaines, le consentement du patient et/de ses proches, en plus du consentement du comité d'éthique local est requis. De plus, le prélèvement de tout tissu (même en quantités infimes) sur des donneurs humains nécessite le plein consentement du donneur dans un format prescrit.

Les problèmes suivants doivent être pleinement pris en compte lors du traitement des tissus humains :

1. Le consentement du patient et/ou de ses proches pour l'utilisation des tissus à des fins de recherche.

2. Propriété des lignées cellulaires développées et de leurs dérivés.

3. Consentement à la modification génétique des lignées cellulaires.

6. Droits de brevet pour toute utilisation commerciale de lignées cellulaires.

Dans la pratique générale des techniques de culture utilisant des tissus humains, le donneur et/ou ses proches sont invités à signer une déclaration de non-responsabilité (dans un pro forma prescrit) avant que le tissu ne soit prélevé. Par cette approche, les complications juridiques sont minimisées.

La manipulation de tissus humains est associée à un risque élevé d'exposition à diverses infections. Par conséquent, il est absolument nécessaire que le matériel humain soit manipulé dans une armoire à risques biologiques. Les tissus doivent être dépistés pour diverses infections telles que l'hépatite, la tuberculose, le VIH, avant leur utilisation. De plus, les milieux et appareils, après leur utilisation, doivent être autoclavés ou désinfectés, de sorte que la propagation des infections soit considérablement réduite.


Numéros utiles pour la culture cellulaire

Il existe différentes tailles de boîtes et de flacons utilisés pour la culture cellulaire. Certains nombres utiles tels que la surface et les volumes de solutions de dissociation sont donnés ci-dessous pour des récipients de culture de différentes tailles.

Numéro de catalogueSuperficie (cm 2 )Densité de semis*Cellules à confluence*Versène
(mL de 0,05 % d'EDTA). Environ. le volume
Trypsine
(mL de 0,05 % de trypsine, 0,53 mM d'EDTA). Environ. le volume
Un milieu de croissance
(ml). Environ. le volume
Vaisselle
35 mm1504601503188.80,3 x 10 6 1,2 x 10 6 112
60mm15046215028821.50,8 x 10 6 3,2 x 10 6 335
100 mm15046415035056.72,2 x 10 6 8,8 x 10 6 5512
150mm1504681683811455,0 x 10 6 20,0 x 10 6 101030
Plaques de culture
6-puits1406759.60,3 x 10 6 1,2 x 10 6 111 à 3
12 puits1506283.50,1 x 10 6 0,5 x 10 6 0,4 à 10,4 à 11 à 2
24 puits1424751.90,05 x 10 6 0,24 x 10 6 0,2 à 0,30,2 à 0,30,5 à 1,0
48 puits1506871.10,03 x 10 6 0,12 x 10 6 0,1 à 0,20,1 à 0,20,2 à 0,4
96 puits1670080.320.01 10 6 0,04 x 10 6 0,05 à 0,10,05 à 0,10,1 à 0,2
Flacons
T-25156367156340250,7 x 10 6 2,8 x 10 6 333–5
T-75156499156472752,1 x 10 6 8,4 x 10 6 558–15
T-1751599101599201754,9 x 10 6 23,3 x 10 6 171735–53
T-2251599341599332256,3 x 10 6 30 x 10 6 222245–68
*La densité d'ensemencement est donnée pour chaque type de récipient de culture comme suit : Boîtes et flacons : cellules par récipient Plaques de culture : cellules par puits.

†Le nombre de cellules sur une plaque, une boîte ou un flacon confluent varie selon le type de cellule. Pour ce tableau, des cellules HeLa ont été utilisées.


Microscopie optique

Parce que la plupart des cellules sont trop petites pour être vues à l'œil nu, l'étude des cellules dépend fortement de l'utilisation de microscopes. En effet, la découverte même des cellules est née du développement du microscope : Robert Hooke a inventé le terme �ll” à la suite de ses observations d'un morceau de liège avec un simple microscope optique en 1665 (figure 1.23). À l'aide d'un microscope grossissant des objets jusqu'à environ 300 fois leur taille réelle, Antony van Leeuwenhoek, dans les années 1670, a pu observer divers types de cellules, notamment des spermatozoïdes, des globules rouges et des bactéries. La proposition de la théorie cellulaire par Matthias Schleiden et Theodor Schwann en 1838 peut être considérée comme la naissance de la biologie cellulaire contemporaine. Des études microscopiques de tissus végétaux par Schleiden et de tissus animaux par Schwann ont abouti à la même conclusion : tous les organismes sont composés de cellules. Peu de temps après, il a été reconnu que les cellules ne sont pas formées de novo mais ne résultent que de la division de cellules préexistantes. Ainsi, la cellule a atteint sa reconnaissance actuelle en tant qu'unité fondamentale de tous les organismes vivants grâce aux observations faites au microscope optique.

Graphique 1.23

La structure cellulaire du liège. Une reproduction du dessin de Robert Hooke d'une fine tranche de liège examinée au microscope optique. Les �lls” que Hooke a observées n'étaient en fait que les parois cellulaires restantes de cellules qui avaient depuis longtemps (plus.)

Le microscope optique reste un outil de base des biologistes cellulaires, avec des améliorations techniques permettant la visualisation de détails toujours croissants de la structure cellulaire. Les microscopes optiques contemporains sont capables de grossir des objets jusqu'à environ mille fois. Étant donné que la plupart des cellules ont un diamètre compris entre 1 et 100 μm, elles peuvent être observées au microscope optique, tout comme certains des plus grands organites subcellulaires, tels que les noyaux, les chloroplastes et les mitochondries. Cependant, le microscope optique n'est pas suffisamment puissant pour révéler les détails fins de la structure cellulaire, pour lesquels résolution—la capacité d'un microscope à distinguer des objets séparés par de petites distances𠅎st encore plus importante que le grossissement. Les images peuvent être agrandies autant que souhaité (par exemple, par projection sur un grand écran), mais un tel agrandissement n'augmente pas le niveau de détail qui peut être observé.

La limite de résolution du microscope optique est d'environ 0,2 μm deux objets séparés par moins de cette distance apparaissent comme une seule image, plutôt que d'être distingués l'un de l'autre. Cette limitation théorique de la microscopie optique est déterminée par deux facteurs&# x02014la longueur d'onde (&# x003bb) de la lumière visible et la puissance de collecte de la lumière de l'objectif du microscope (ouverture numérique, N / A)—selon l'équation suivante :

La longueur d'onde de la lumière visible est de 0,4 à 0,7 μm, donc la valeur de λ est fixée à environ 0,5 μm pour le microscope optique. L'ouverture numérique peut être envisagée comme la taille du cône de lumière qui pénètre dans l'objectif du microscope après avoir traversé l'échantillon (Figure 1.24). Il est donné par l'équation

Graphique 1.24

Ouverture numérique. La lumière est focalisée sur l'échantillon par la lentille du condenseur puis collectée par l'objectif du microscope. L'ouverture numérique est déterminée par l'angle du cône de lumière entrant dans l'objectif (α) et par (plus. )

La limite théorique de résolution du microscope optique peut donc être calculée comme suit :

Des microscopes capables d'atteindre ce niveau de résolution avaient déjà été fabriqués à la fin du XIXe siècle. On ne peut s'attendre à de nouvelles améliorations dans cet aspect de la microscopie optique.

Plusieurs types différents de microscopie optique sont couramment utilisés pour étudier divers aspects de la structure cellulaire. Le plus simple est microscopie à fond clair, dans laquelle la lumière traverse directement la cellule et la capacité de distinguer différentes parties de la cellule dépend du contraste résultant de l'absorption de la lumière visible par les composants de la cellule. Dans de nombreux cas, les cellules sont colorées avec des colorants qui réagissent avec des protéines ou des acides nucléiques afin d'améliorer le contraste entre les différentes parties de la cellule. Avant la coloration, les échantillons sont généralement traités avec des fixateurs (tels que l'alcool, l'acide acétique ou le formaldéhyde) pour stabiliser et préserver leurs structures. L'examen des tissus fixés et colorés par microscopie à fond clair est l'approche standard pour l'analyse des échantillons de tissus dans les laboratoires d'histologie (Figure 1.25). De telles procédures de coloration tuent les cellules, cependant, et ne conviennent donc pas pour de nombreuses expériences dans lesquelles l'observation de cellules vivantes est souhaitée.

Graphique 1.25

Micrographie à fond clair des tissus colorés. Coupe transversale d'un follicule pileux dans la peau humaine, coloré à l'hématoxyline et à l'éosine. (G. W. Willis/Service de photos biologiques.)

Sans coloration, le passage direct de la lumière ne fournit pas un contraste suffisant pour distinguer de nombreuses parties de la cellule, limitant l'utilité de la microscopie à fond clair. Cependant, des variations optiques du microscope optique peuvent être utilisées pour améliorer le contraste entre les ondes lumineuses traversant des régions de la cellule avec des densités différentes. Les deux méthodes les plus courantes pour visualiser les cellules vivantes sont microscopie à contraste de phase et microscopie différentielle interférentielle à contraste (Figure 1.26). Les deux types de microscopie utilisent des systèmes optiques qui convertissent les variations de densité ou d'épaisseur entre les différentes parties de la cellule en différences de contraste visibles sur l'image finale. En microscopie à fond clair, les structures transparentes (comme le noyau) ont peu de contraste car elles absorbent mal la lumière. Cependant, la lumière est ralentie lorsqu'elle traverse ces structures de sorte que sa phase est altérée par rapport à la lumière qui a traversé le cytoplasme environnant. La microscopie à contraste de phase et à contraste d'interférence différentiel convertit ces différences de phase en différences de contraste, produisant ainsi des images améliorées de cellules vivantes non colorées.

Graphique 1.26

Observation microscopique de cellules vivantes. Photomicrographies de cellules de joue humaines obtenues avec (A) un champ clair, (B) un contraste de phase et (C) une microscopie différentielle à contraste d'interférence. (Gracieuseté de Mort Abramowitz, Olympus America, Inc.)

La puissance du microscope optique a été considérablement augmentée par l'utilisation de caméras vidéo et d'ordinateurs pour l'analyse et le traitement d'images. De tels systèmes électroniques de traitement d'images peuvent améliorer considérablement le contraste des images obtenues avec le microscope optique, permettant la visualisation de petits objets qui autrement ne pourraient pas être détectés. Par exemple, microscopie à contraste d'interférence différentielle améliorée par vidéo a permis de visualiser le mouvement des organites le long des microtubules, qui sont des filaments de protéines du cytosquelette d'un diamètre de seulement 0,025 μm (Figure 1.27). Cependant, cette amélioration ne dépasse pas la limite théorique de résolution du microscope optique, environ 0,2 μm. Ainsi, bien que l'amélioration vidéo permette la visualisation des microtubules, les microtubules apparaissent sous forme d'images floues d'au moins 0,2 μm de diamètre et un microtubule individuel ne peut pas être distingué d'un faisceau de structures adjacentes.

Graphique 1.27

Microscopie à contraste d'interférence différentielle améliorée par vidéo. Le traitement électronique de l'image permet la visualisation de microtubules uniques. (Avec l'aimable autorisation de E. D. Salmon, Université de Caroline du Nord, Chapel Hill.)

La microscopie optique a été portée au niveau de l'analyse moléculaire par des méthodes de marquage de molécules spécifiques afin qu'elles puissent être visualisées à l'intérieur des cellules. Des gènes spécifiques ou des transcrits d'ARN peuvent être détectés par hybridation avec des sondes d'acide nucléique de séquence complémentaire, et des protéines peuvent être détectées à l'aide d'anticorps appropriés (voir chapitre 3). Les sondes d'acide nucléique et les anticorps peuvent être marqués avec une variété d'étiquettes qui permettent leur visualisation au microscope optique, ce qui permet de déterminer l'emplacement de molécules spécifiques dans des cellules individuelles.

La microscopie à fluorescence est une méthode largement utilisée et très sensible pour étudier la distribution intracellulaire des molécules (Figure 1.28). Un colorant fluorescent est utilisé pour marquer la molécule d'intérêt dans des cellules fixes ou vivantes. Le colorant fluorescent est une molécule qui absorbe la lumière à une longueur d'onde et émet de la lumière à une seconde longueur d'onde. Cette fluorescence est détectée en éclairant l'échantillon avec une longueur d'onde de lumière qui excite le colorant fluorescent, puis en utilisant des filtres appropriés pour détecter la longueur d'onde spécifique de la lumière émise par le colorant. La microscopie à fluorescence peut être utilisée pour étudier une variété de molécules dans les cellules. Une application fréquente consiste à marquer des anticorps dirigés contre une protéine spécifique avec des colorants fluorescents, de sorte que la distribution intracellulaire de la protéine puisse être déterminée. Les protéines dans les cellules vivantes peuvent être visualisées en utilisant le protéine fluorescente verte (GFP) de méduses comme marqueur fluorescent. La GFP peut être fusionnée à une large gamme de protéines à l'aide de méthodes standard d'ADN recombinant, et la protéine marquée GFP peut ensuite être introduite dans les cellules et détectée par microscopie à fluorescence.

Graphique 1.28

Microscopie à fluorescence. (A) La lumière passe à travers un filtre d'excitation pour sélectionner la lumière de la longueur d'onde (par exemple, le bleu) qui excite le colorant fluorescent. Un miroir dichroïque dévie alors la lumière d'excitation jusqu'à l'échantillon. La lumière fluorescente émise (suite. )

Microscopie confocale combine la microscopie à fluorescence avec l'analyse électronique d'images pour obtenir des images tridimensionnelles. Un petit point lumineux, généralement fourni par un laser, est focalisé sur l'échantillon à une profondeur particulière. La lumière fluorescente émise est ensuite collectée à l'aide d'un détecteur, tel qu'une caméra vidéo. Avant que la lumière émise n'atteigne le détecteur, cependant, elle doit passer à travers une ouverture en trou d'épingle (appelée ouverture confocale) placée précisément au point où la lumière émise à partir de la profondeur choisie de l'échantillon parvient à un foyer (figure 1.29). Par conséquent, seule la lumière émise depuis le plan focal est capable d'atteindre le détecteur. Le balayage à travers l'échantillon génère une image bidimensionnelle du plan focal, une image beaucoup plus nette que celle obtenue avec la microscopie à fluorescence standard (Figure 1.30). De plus, une série d'images obtenues à différentes profondeurs peut être utilisée pour reconstruire une image tridimensionnelle de l'échantillon.

Graphique 1.29

Microscopie confocale. Un point de lumière est focalisé sur le spécimen à une profondeur particulière, et la lumière fluorescente émise est collectée par un détecteur. Avant d'atteindre le détecteur, la lumière fluorescente émise par l'échantillon doit passer à travers un confocal (suite. )

Graphique 1.30

Micrographie confocale de cellules embryonnaires de souris. Les noyaux sont colorés en rouge et les filaments d'actine sous-jacents à la membrane plasmique sont colorés en vert. (Avec l'aimable autorisation de David Albertini, faculté de médecine de l'Université Tufts.)

Microscopie à excitation à deux photons est une alternative à la microscopie confocale qui peut être appliquée aux cellules vivantes. L'échantillon est éclairé avec une longueur d'onde de lumière telle que l'excitation du colorant fluorescent nécessite l'absorption simultanée de deux photons (Figure 1.31). La probabilité que deux photons excitent simultanément le colorant fluorescent n'est significative qu'au point de l'échantillon sur lequel le faisceau laser d'entrée est focalisé, de sorte que la fluorescence n'est émise que depuis le plan de focalisation de la lumière d'entrée. Cette excitation très localisée fournit automatiquement une résolution tridimensionnelle, sans qu'il soit nécessaire de faire passer la lumière émise à travers une ouverture en trou d'épingle, comme en microscopie confocale. De plus, la localisation de l'excitation minimise les dommages à l'échantillon, permettant une imagerie tridimensionnelle des cellules vivantes.

Graphique 1.31

Microscopie à excitation à deux photons. L'absorption simultanée de deux photons est nécessaire pour exciter le colorant fluorescent. Cela ne se produit qu'au point de l'échantillon sur lequel la lumière d'entrée est focalisée, de sorte que la lumière fluorescente n'est émise que par le (plus.)


Cellules endothéliales microvasculaires cardiaques humaines (HCMEC)

Cellules endothéliales microvasculaires cardiaques humaines primaires isolées des ventricules cardiaques d'un seul donneur.

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Caractéristiques

Il n'y avait pas d'antécédents familiaux de cancer du sein.

Les cellules sont peu différenciées.

Les cellules sont négatives pour l'expression de Her2-neu et pour l'expression de p53.

HCC1806 est positif pour le marqueur spécifique des cellules épithéliales Glycoprotéine épithéliale 2 (EGP2) et pour la cytokératine 19.

Les cellules sont homozygotes pour les délétions dans le gène FHIT en 3p14.2.

Traitement de l'information

  1. Vérifiez que tous les conteneurs ne fuient pas ou ne se cassent pas.
  2. Retirez les cellules congelées de l'emballage de glace sèche et placez immédiatement les cellules à une température inférieure à -130 ° C, de préférence dans de la vapeur d'azote liquide, jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à l'emploi.

Procédure de manipulation Pour assurer le plus haut niveau de viabilité, décongeler le flacon et initier la culture dès que possible dès réception. Si à l'arrivée, un stockage continu de la culture congelée est nécessaire, elle doit être stockée en phase vapeur d'azote liquide et non à -70°C. Le stockage à -70°C entraînera une perte de viabilité.

  1. Décongeler le flacon par agitation douce dans un bain-marie à 37°C. Pour réduire la possibilité de contamination, gardez le joint torique et le capuchon hors de l'eau. La décongélation doit être rapide (environ 2 minutes).
  2. Retirer le flacon du bain-marie dès que le contenu est décongelé et décontaminer par trempage ou pulvérisation d'éthanol à 70 %. Toutes les opérations à partir de ce point doivent être effectuées dans des conditions d'asepsie strictes.
  3. Transférer le contenu du flacon dans un flacon de culture tissulaire de 75 cm 2 et diluer avec le milieu de culture complet recommandé (voir les informations de lot spécifiques pour le rapport de dilution recommandé). Il est important d'éviter une alcalinité excessive du milieu lors de la récupération des cellules. Il est suggéré qu'avant l'ajout du contenu du flacon, le récipient de culture contenant le milieu de croissance complet soit placé dans l'incubateur pendant au moins 15 minutes pour permettre au milieu d'atteindre son pH normal (7,0 à 7,6).
  4. Incuber la culture à 37°C dans un incubateur adapté. A 5% de CO2 en atmosphère d'air est recommandé si vous utilisez le milieu décrit sur cette fiche produit.

Noter: Si l'on souhaite éliminer immédiatement l'agent cryoprotecteur ou obtenir une suspension cellulaire plus concentrée, centrifuger la suspension cellulaire à environ 125 x g pendant 5 à 10 minutes. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules avec un milieu de croissance frais au taux de dilution recommandé dans les informations de lot spécifiques.

Procédure de sous-culture Les volumes utilisés dans ce protocole sont pour un flacon de 75 cm 2 réduire ou augmenter proportionnellement la quantité de milieu de dissociation pour les récipients de culture d'autres tailles.

  1. Retirer et jeter le milieu de culture.
  2. Rincer brièvement la couche cellulaire avec une solution de Trypsine à 0,25% (p/v)-0,53 mM d'EDTA pour éliminer toute trace de sérum contenant un inhibiteur de trypsine.
  3. Ajouter 2,0 à 3,0 ml de solution de Trypsine-EDTA dans le flacon et observer les cellules au microscope inversé jusqu'à ce que la couche cellulaire soit dispersée (généralement dans les 5 à 15 minutes).

Spécifications de contrôle qualité

Histoire

Mentions légales

Le produit est fourni « EN L'ÉTAT » et la viabilité des produits ATCC & reg est garantie pendant 30 jours à compter de la date d'expédition, à condition que le client ait stocké et manipulé le produit conformément aux informations figurant sur la fiche d'information du produit, le site Web et Certificat d'analyse. Pour les cultures vivantes, l'ATCC répertorie la formulation des milieux et les réactifs qui se sont avérés efficaces pour le produit. Alors que d'autres milieux et réactifs non spécifiés peuvent également produire des résultats satisfaisants, une modification des protocoles ATCC et/ou recommandés par les déposants peut affecter la récupération, la croissance et/ou la fonction du produit. Si une formulation de milieu ou un réactif alternatif est utilisé, la garantie de viabilité de l'ATCC n'est plus valable. Sauf indication expresse dans les présentes, aucune autre garantie de quelque nature que ce soit n'est fournie, expresse ou implicite, y compris, mais sans s'y limiter, toute garantie implicite de qualité marchande, d'adéquation à un usage particulier, de fabrication selon les normes cGMP, de typicité, de sécurité, de précision , et/ou de non-contrefaçon.

Ce produit est destiné à un usage de recherche en laboratoire uniquement. Il n'est destiné à aucun usage thérapeutique animal ou humain, aucune consommation humaine ou animale, ni aucun usage diagnostique. Toute utilisation commerciale proposée est interdite sans une licence de l'ATCC.

Bien qu'ATCC fasse des efforts raisonnables pour inclure des informations exactes et à jour sur cette fiche produit, ATCC ne fait aucune garantie ou représentation quant à son exactitude. Les citations de la littérature scientifique et des brevets sont fournies à titre informatif uniquement. ATCC ne garantit pas que ces informations ont été confirmées comme étant exactes ou complètes et le client est seul responsable de la confirmation de l'exactitude et de l'exhaustivité de ces informations.

Ce produit est envoyé à la condition que le client soit responsable et assume tous les risques et responsabilités liés à la réception, la manipulation, le stockage, l'élimination et l'utilisation du produit ATCC, y compris, sans s'y limiter, en prenant toutes les précautions de sécurité et de manipulation appropriées pour minimiser la santé. ou risque environnemental. As a condition of receiving the material, the customer agrees that any activity undertaken with the ATCC product and any progeny or modifications will be conducted in compliance with all applicable laws, regulations, and guidelines. This product is provided 'AS IS' with no representations or warranties whatsoever except as expressly set forth herein and in no event shall ATCC, its parents, subsidiaries, directors, officers, agents, employees, assigns, successors, and affiliates be liable for indirect, special, incidental, or consequential damages of any kind in connection with or arising out of the customer's use of the product. While reasonable effort is made to ensure authenticity and reliability of materials on deposit, ATCC is not liable for damages arising from the misidentification or misrepresentation of such materials.

Please see the material transfer agreement (MTA) for further details regarding the use of this product. The MTA is available at www.atcc.org.


Instructions

Co-culture Experiments with Lonza's Small Airway Epithelial Cells and SAGM TM BulletKit TM Media

Data Courtesy of Furukawa, et al. Lonza's SAEC cells were co-cultured with primary normal mammary epithelial cells, breast cancer cell lines MCF-7 and MDA-MB-231 in Lonza's SAGM TM BulletKit TM Growth Media. Breast cancer cell lines showed differences in morphology and proliferation rates in the presence of small airway epithelial cells. The image above shows phase contrast imaging with a fluorescent (red) overlay of MCF-7 cell line. MCF-7 cell lines survived as tight clusters in SAGM TM Media. When co-cultured with Lonza's primary SAECs, MCF-7 cells demonstrated enhanced growth all the while staying clustered.

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Méthodes

Growth Requirements

The culture media used for cell cultures are generally quite complex, and culture condition widely varies for each cell type. However, media generally include amino acids, vitamins, salts (maintain osmotic pressure), glucose, a bicarbonate buffer system (maintains a pH between 7.2 and 7.4), growth factors, hormones, O2 et Cie2. To obtain best growth, addition of a small amount of blood serum is usually necessary, and several antibiotics, like penicillin and streptomycin are added to prevent bacterial contamination.

Temperature varies on the type of host cell. Most mammalian cells are maintained at 37 o C for optimal growth, while cells derived from cold-blooded animals tolerate a wider temperature range (i.e. 15 o C to 26 o C). Actively growing cells of log phage should be used which divide rapidly during culture.

Process to obtain primary cell culture

Primary cell cultures are prepared from fresh tissues. Pieces of tissues from the organ are removed aseptically which are usually minced with a sharp sterile razor and dissociated by proteolytic enzymes (such as trypsin) that break apart the intercellular cement. The obtained cell suspension is then washed with a physiological buffer (to remove the proteolytic enzymes used). The cell suspension is spread out on the bottom of a flat surface, such as a bottle or a Petri dish. This thin layer of cells adhering to the glass or plastic dish is overlaid with a suitable culture medium and is incubated at a suitable temperature.

Aseptic technique

Bacterial infections, like Mycoplasma and fungal infections, commonly occur in cell culture creating a problem to identify and eliminate. Thus, all cell culture work is done in a sterile environment with proper aseptic techniques. Work should be done in laminar flow with the constant unidirectional flow of HEPA filtered air over the work area. All the material, solutions and the whole atmosphere should be of contamination-free.

Cryopreservation

If a surplus of cells is available from sub-culturing, they should be treated with the appropriate protective agent (e.g., DMSO or glycerol) and stored at temperatures below –130°C until they are needed. This stores cell stocks and prevents original cell from being lost due to unexpected equipment failure or biological contaminations. It also prevents finite cells from reaching senescense and minimizes risks of changes in long term cultures.

When thawing the cells, the frozen tube of cells is warmed quickly in warm water, rinsed with medium and serum and then added into culture containers once suspended in the appropriate media.


What Is the Function of the Cheek Cell?

A cheek cell, an epithelial cell found in the tissue on the inside lining of the mouth, continually secretes mucus to maintains a moist environment in the mouth. Together with salivary glands that secrete saliva, the cheek cells supply enough moisture in the mouth for enzymes to thrive. This moisture softens food, assists in swallowing and starts digestion.

The epithelial cells in the lining of the mouth are referred to as basal mucosa and divide roughly every 24 hours. They can easily be obtained through a simple swab or a mouth rinse. The cheek cell is very simple, but it contains the entire genetic makeup of the person's body. For this reason, cheek cells are frequently used to establish paternity and other investigations involving DNA. More recently, researchers have discovered that the cheek cell can be used to measure a person's likelihood of having high blood pressure.

A human cheek cell is thin, flat and irregularly shaped and has a large nucleus that contains the DNA. Its plasma membrane helps the cell to maintain suitable temperature while giving it its shape. Since it is selectively permeable, it only allows certain molecules into and out of the cell. Its cytoplasm contains water that dissolves nutrients and enzymes.


Basic equipment and reagents required for cell culture

To conduct research requiring cell culture work and to perform fundamental cell culture protocols, there are several key pieces of equipment and some basic reagents that are required, summarized in Tables 1 and 2.

Tableau 1: Basic equipment required for cell culture. 3 , 4 , 5 The images were created with BioRender.com.

Table 2: The basic reagents needed for cell culture. 2 , 5

See section below on media for your cells.

Phosphate-buffered saline (PBS) used for washing cells.

An enzyme used to detach adherent cells from culture vessels for culturing, such as trypsin.

An agent that reduces the freezing point of media and slows the cooling rate to reduce the risk of ice crystal formation which can damage cells and cause cell death. Dimethylsulfoxide (DMSO) is most commonly used.



It is also important to have access to deionized and distilled water as well as ice. The nature of the experiments to be performed will inform the reagents that will need to be acquired.


Current Functions

1) Tissue Procurement

Obtain nasal tissues and tracheo-bronchiolar segments from normal, CF, and disease control humans as sources of airway epithelial cells (hAE). The MLI TPC then utilizes the harvested hAE cells for culture, for ex vivo experiments, for RNA and proteins representative of in vivo conditions, and for in situ hybridization and immunohistochemistry. As a service to the greater CF research community (Function 6), the MLI TPC accepts tissues from other institutions through longstanding sources including local and distant outpatient surgical centers such as the UNC Lung Transplant Program, Carolina Donor Services, International Institute for the Advancement of Medicine (IIAM, Edison, NJ), and the National Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA). The MLI TPC also accepts tissues from highly motivated donors nationally and internationally. Ongoing sources of CF tissues from independently recruited lung transplant programs include Loyola University, Maywood IL, Vanderbilt University, Medical College of Wisconsin, Israel, and Duke University Medical Center. Furthermore, in collaboration with the Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics (CFFT) and NDRI, explanted CF lungs from multiple lung transplant centers are sent to UNC for processing.

2) Airway Epithelial Cell Isolation and Culture

une) Isolate epithelial cells from excised human nasal tissues, including endosinus mucosa, and cartilaginous bronchi of human lungs for distribution to investigators.

b) Prepare and maintain primary epithelial cell cultures, such as primary alveolar epithelial cells, microvascular endothelial cells and/or fibroblasts from the tissues noted above. The Core provides support for the preparation of well-differentiated airway epithelial cultures from passaged, or cryopreserved and thawed human cells, on permeable substrates.

c) Optimize and standardize epithelial culture conditions to replicate the gene expression, morphological differentiation, and physiologic functions of airways.

The MLI TPC also provides passage 1 airway epithelial cells, like primary cells, they too are suitable for producing well-differentiated cultures on porous supports. Representative sections of well-differentiated nasal and bronchial airway epithelial cell cultures are shown in Figure 1.

Figure 1. Representative photomicrographs of well-differentiated passage 1 nasal (A) and bronchial (B) human airway epithelial cells grown at an air-liquid interface for 14-21 days. OsO4 fixation, epon embedding and Richardsons stain, both panels at the same magnification, original magnification=1000x.

Routine MLI TPC procedures have significantly improved our ability to study differentiation-dependent functions (Figure 2) and have also increased the number and area of well-differentiated cultures produced from each sample. Possessing the ability to store primary cells at differing stages of maturity from the same patient sample allows repeat experiments with the same specimen. Additionally, we can perform simultaneous experiments with replicate cultures derived from multiple patients.

Figure 2. Demonstration of rotational mucus transport in well-differentiated cultures. A) 1 mm fluorescent microspheres were added to the culture surface and were propelled by the coordinated beating of cilia. A 5-second time-lapse exposure is shown. B) Linear velocities of the particles were measured and plotted as a function of distance from the center of rotation.

The in-house production of BEGM and ALI media has also resulted in significant cost savings and a deeper understanding of cell culture among staff. We are focused on producing cultures that accurately mirror in vivo gene expression, morphology, and physiology and which reproduce known differences between CF and non-CF individuals in vivo. Supplying large numbers of cultures, and large batches of media, in response to changing investigator needs is one of the major MLI TPC functions.

3) Collect Airway Surface Liquid (ASL) from in vivo et in vitro Échantillons

Critical testing of current advances in CF pathogenesis requires direct measurement of the chemical composition of human ASL. We have consistently collected and distributed in vivo airway mucus secretions for the study of biochemical composition, biophysical properties and as the source of the supernatant of mucopurulent material (SMM) from CF lungs. Additionally, ASL from well-differentiated cultures is used to stimulate air-liquid interface (ALI) cultures and serves as the basis for key experiments related to novel concepts in CF. The MLI TPC provides luminal contents of CF lungs explanted during transplant or removed at autopsy and harvests ASL from in vitro sources.

4) Genetic Manipulation of Cell Cultures

Figure 3. Lentiviral vector genetic manipulation of hTBE cells. A) hTBE cells were sham-transduced (control) or infected with lentiviral vectors expressing a fused GFP/Blasticidin resistance protein (GFP/BSD) or red fluorescent protein linked to GFP/BSD by an internal ribosome entry site (RFP IRES), conventional epifluorescence microscopy 5 days following infection. B) RFP IRES-infected cells were trypsinized from plastic dishes, passaged to air-liquid interface cultures and allowed to differentiate for 35 days, X-Z plane confocal image. Note that the GFP/BSD fusion protein is apparently excluded from the nucleus while the RFP distributes equally. Basal cell expression is apparently lower from the CMV promoter, and alternative promoters enabling uniform expression are being tested.

Use adenovirus, adeno-associated virus, lentivirus (see Figure 3) and retrovirus vectors in combination with chemical treatment as necessary, to assist in the production of genetically manipulated, well-differentiated primary airway epithelial cell cultures.

5) Create and Characterize Novel Cell Lines

Use recent advances in cell immortalization technology to create new cell lines and characterize their biochemical properties, morphology and electrophysiologic function. The goal of the TPC is to create new and better immortalized cells retaining a greater capacity to recapitulate normal airway epithelial function. We have used retroviral transduction to serially introduce SV40 ER or HPV E6/E7 and hTERT into non-CF and CF cells. Their growth potential, morphology, biochemical features and electrophysiologic properties are studied using typical methods. Our ongoing observations have revealed that cells immortalized by SV40 ER or HPV E6/E7 and hTERT, when grown at an air-liquid-interface, are not optimal for CF-related investigation. This has led to novel studies using Bmi-1 oncogene to create superior cell lines (AJP 2009). Six novel cell lines using the Bmi-1 oncogene (3 normal and 3 deltaF508 homozygous CF) have been characterized (see Figure 4).

6) Translation of Technology and Reagents to the Greater CF Research Community

Our Core strongly observes the philosophy of developing non-proprietary technology and supporting its widespread translation. By providing material and consultative support, the MLI TPC allows others to develop or improve upon their own in-house cell culture capabilities. This involves the shipment of cells or media, hosting visitors for training, and publication of methods specifically related to improvements in human airway cell culture. In addition to hosting periodic training sessions for visitors from the US, England, Ireland, Switzerland, Canada, France, and Israel for the purpose of technology transfer, the MLI TPC consults with distant users as they encounter experimental difficulties related to their cell model work. The MLI TPC’s standing as a recharge center has allowed for a more accessible and efficient user experience. We are able to provide immortal cell lines at minimal expense, custom cell line creation for those who have sent us tissue specimens using CRC technology, and offer customized media based on manager approval.

Some of our latest updated methods have been published as a part of the Methods in Molecular Biology (MIMB) series, with the title “Epithelial Cell Culture Protocols.” The MLI TPC strives to meet the needs of academic, UNC, and commercial interests, when possible. Consultative support including advice, protocols, and more can be found on this site. If there are any requests outside of the information provided, feel free to contact the Laboratory Manager with the link provided at the top of the page.

7) New Initiatives Based on Investigator Needs

Figure 4. Robotic two plate TECC24 device that will facilitate quality control and experimental electrophysiologic testing. This device will increase our capacity to test cells from the current six, to 36 specimens per day (in quadruplicate wells). This piece of equipment is integral in improving the efficiency of our quality control testing process. The device also requires fewer cells from each specimen for analysis, which is ideal for the conservation of our resources.

Representative Ussing chamber results from UNCN1-3T (normal) and UNCCF1-3T (CF) cell lines. Note the absence of a forskolin (Fsk) response in the 4 replicate CF cell tracings, Amil = amiloride.

The TPC is responsive to the changing needs of UNC MLI investigators and provides material support for phasic motion and cyclic compressive stress studies, chambers for exposure to hypoxic conditions, mouse airway epithelial cell cultures, human lung vascular endothelial cell cultures and human alveolar epithelial cell cultures. The TPC has applied new methods enabling routine provision of well-differentiated tracheal epithelial cell cultures from normal mice as well as cultures from genetically manipulated mice, including CF mice, mice over-expressing the epithlial Na + channel, Coxsackie adenovirus receptor expressing mice, caveolin knockout mice and other genetically unique strains.


Voir la vidéo: Suoliston hyvät bakteerit (Juin 2022).


Commentaires:

  1. Patroclus

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  2. Macdubhgall

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  5. Hwitford

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  6. Laocoon

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