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T50 : Hh-PPP - Biologie

T50 : Hh-PPP - Biologie



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T50V

  1. Changenet-Barret, Pascale, Pascal Plaza, Monique M. Martin, Haik Chosrowjan, Seiji Taniguchi, Noboru Mataga, Yasushi Imamoto et Mikio Kataoka. "Effets structurels sur la photoisomérisation ultrarapide de la protéine jaune photoactive. Spectroscopie d'absorption transitoire de mutants à deux points†." Le Journal de Chimie Physique C 113, non. 27 (2009) : 11605-11613. pdf (vérifié)
  2. Chosrowjan, Haik, Noboru MATAGA, Seiji TANIGUCHI, Masashi UNNO, Hironari KAMIKUBO, Yasushi IMAMOTO et Mikio KATAOKA. "Enquêtes dans le domaine du temps et de la fréquence sur la dynamique de photoréaction ultrarapide de la protéine jaune photoactive (PYP)." L'examen de l'ingénierie laser 32, non. 2 (2004) : 114-120. pdf (vérifié)
  3. Chosrowjan, Haik, Seiji Taniguchi, Noboru Mataga, Masashi Unno, Seigo Yamauchi, Norio Hamada, Masato Kumauchi et Fumio Tokunaga. "Les vibrations basse fréquence et leur rôle dans la dynamique de réaction de photoisomérisation ultrarapide de la protéine jaune photoactive." Le Journal de Chimie Physique B 108, non. 8 (2004) : 2686-2698. pdf (vérifié)
  4. Mataga, Noboru, Haik Chosrowjan, Seiji Taniguchi, Norio Hamada, Fumio Tokunaga, Yasushi Imamoto et Mikio Kataoka. « Photoréactions ultrarapides dans les nanoespaces protéiques, comme le révèlent les mesures de la dynamique de fluorescence fs sur la protéine jaune photoactive et les systèmes associés. » Chimie Physique Physique Chimique 5, non. 11 (2003) : 2454-2460. pdf (vérifié)
  5. Mataga, Noboru, Haik Chosrowjan, Yutaka Shibata, Yasushi Imamoto et Fumio Tokunaga. « Effets de la modification de la structure du nanoespace de la protéine et du changement de température sur la dynamique de fluorescence femtoseconde à picoseconde de la protéine jaune photoactive. » Le Journal de Chimie Physique B 104, non. 21 (2000) : 5191-5199. pdf (vérifié)
  6. Chosrowjan, Haik, Noboru Mataga, Yutaka Shibata, Yasushi Imamoto et Fumio Tokunaga. "Effets environnementaux sur la dynamique de fluorescence femtoseconde-picoseconde de la protéine jaune photoactive: chromophores dans des solutions aqueuses et dans des nanoespaces protéiques modifiés par mutagenèse dirigée." Le Journal de Chimie Physique B 102, non. 40 (1998) : 7695-7698. pdf (vérifié)
  7. Mataga, Noboru, Haik Chosrowjan et Seiji Taniguchi. « Enquêtes sur la dynamique et les mécanismes des réactions photo-induites ultrarapides qui se déroulent dans des nanoespaces de protéines photosensibles (PNS)." Journal of Photochemistry and Photobiology C: Avis de photochimie 5, non. 2 (2004) : 155-168. pdf (vérifié)

T50A

  1. Mataga, Noboru, Haik Chosrowjan, Yutaka Shibata, Yasushi Imamoto et Fumio Tokunaga. pdf (vérifié)
  2. Mataga, Noboru, Haik Chosrowjan et Seiji Taniguchi. pdf (vérifié)

La dialyse au bicarbonate sans acétate et acidifié au citrate améliore la propension à la calcification sérique - une étude préliminaire

Fond: Un nouveau test in vitro (test T50) évalue la propension à la calcification sérique ex vivo et prédit la mortalité chez les patients atteints d'insuffisance rénale chronique et d'hémodialyse (HD). Pour ces derniers, il a été démontré qu'un déclin dépendant du temps de T50 était lié à la mortalité. Ici, nous avons évalué si un passage de 3 mois à un bicarbonate HD standard sans acétate, acidifié au citrate (CiaHD) améliore durablement la propension à la calcification.

Méthodes : Les valeurs de T50 ont été évaluées dans des sérums de pré-dialyse appariés en milieu de semaine collectés avant et 3 mois après CiaHD chez 78 patients HD européens prévalents. Au total, 44 sont ensuite passés à l'acétate. Une corrélation partielle a été utilisée pour étudier les associations de changement de T50 et de changement de covariables. Des modèles linéaires à effets mixtes ont été construits pour évaluer l'association de la CiaHD et des covariables avec le changement de T50.

Résultats: Une augmentation intra-individuelle significative de la résilience à la calcification sérique a été trouvée après 3 mois sous CiaHD (206 ± 56 à 242 ± 56 min P < 0,001), mais pas après le retour à l'acétate (252 ± 63 à 243 ± 64 min n = 44 p = 0,29). CiaHD, Δ phosphate sérique et Δ albumine mais pas Δ calcium et magnésium ionisés étaient les déterminants les plus forts de la modification de la T50. Sous T50, seule l'albumine sérique mais pas le phosphate a changé de manière significative pendant 3 mois de CiaHD.

Conclusion: La dialyse CiaHD affectait favorablement la propension à la calcification telle que mesurée par le test T50. La question de savoir si ce traitement, au-delà des traitements établis à base de phosphate, a le potentiel de faire pencher la balance de manière durable vers un milieu sérique plus anti-calcaire doit être étudiée plus avant.


Propension à la calcification sérique et risque de mortalité cardiovasculaire et toutes causes confondues dans la population générale : l'étude PREVEND

Objectif: La calcification vasculaire contribue à la cause des maladies cardiovasculaires. Le temps de maturation des particules de calciprotéine (T50) dans le sérum, une mesure de la propension à la calcification, a été associée à des résultats indésirables chez les patients atteints d'insuffisance rénale chronique, mais son rôle dans la population générale n'est pas clair. Nous avons étudié si le sérum T50 est associée à la mortalité cardiovasculaire dans une large cohorte basée sur la population générale. Approche et résultats : La relation entre le sérum T50 et la mortalité cardiovasculaire a été étudiée chez 6231 participants de la cohorte PREVEND (Prevention of Renal and Vascular End-Stage Disease). La mortalité toutes causes était le critère de jugement secondaire. L'âge moyen (± ET) était de 53±12 ans, 50 % étaient des hommes et le T sérique moyen50 était de 329 ± 58 minutes. Un sérum T plus court50 indique une propension à la calcification plus élevée. Sérum T50 était inversement associé au phosphate circulant, à l'âge, au taux de filtration glomérulaire estimé et à la consommation d'alcool, tandis que le magnésium plasmatique était positivement associé à la T sérique.50 (P<0.001, modèle multivariable total R 2 = 0,281). Au cours du suivi médian (intervalle interquartile) pendant 8,3 (7,8-8,9) ans, 364 patients sont décédés (5,8 %), dont 95 (26,1 %) sont décédés d'une cause cardiovasculaire. Dans les modèles multivariables à risque proportionnel de Cox, chaque 60 minutes diminue le T sérique50 était indépendamment associée à un risque plus élevé de mortalité cardiovasculaire (rapport de risque entièrement ajusté [IC à 95 %], 1,22 [1,04-1,36], P=0,021). Cette association a été modifiée par l'analyse stratifiée du diabète sucré qui a indiqué une association plus prononcée chez les personnes atteintes de diabète sucré.

Conclusion : Sérum T50 est indépendamment associée à un risque accru de mortalité cardiovasculaire dans la population générale et peut donc être un marqueur de risque précoce et potentiellement modifiable de mortalité cardiovasculaire.

Mots clés: association propension à la calcification (T50) particules de calciprotéine maladies cardiovasculaires diabète sucré mortalité population.


Les patients atteints d'insuffisance rénale chronique avancée et de calcification vasculaire ont un grand rayon hydrodynamique de particules de calciprotéine secondaire

Fond: La taille des particules de calciprotéine secondaire (CPP2) et la vitesse de transformation (T50) des particules de calciprotéine primaire (CPP1) en CPP2 dans le sérum peuvent être associées à une calcification vasculaire (VC) chez les patients atteints d'insuffisance rénale chronique (IRC).

Méthodes : Nous avons développé un test à haut débit basé sur des microplaques utilisant la diffusion dynamique de la lumière (DLS) pour mesurer la transformation de CPP1 en CPP2, le rayon hydrodynamique (Rh) de CPP1 et CPP2, T50 et l'agrégation de CPP2. Nous avons utilisé ce test DLS pour tester l'hypothèse selon laquelle un Rh élevé de CPP2 et/ou un T50 rapide sont associés à la CV chez 45 participants atteints d'IRC de stade 4 à 5 (22 sans CV et 23 avec CV) et 17 volontaires sains (HV) . La CV a été définie comme un score de Kauppila >6 ou un score d'Adragao ≥3.

Résultats: Les participants IRC avec CV avaient des cumulants plus grands Rh de CPP2 <370 nm [intervalle interquartile (IQR) 272-566]>par rapport aux participants IRC sans CV [212 nm (IQR 169-315)] et comparés à HV [168 nm (IQR 145 -352), P < 0.01 pour chaque]. Plus de CPP2 étaient dans les agrégats chez les participants IRC avec CV que ceux sans CV (70 % contre 36 %). Les probabilités d'avoir une CV augmentaient de 9 % avec chaque augmentation de 10 nm du Rh de la CPP2, après ajustement pour l'âge, le diabète, la calcémie et le phosphate [rapport de cotes 1,09, intervalle de confiance (IC) à 95 % 1,03, 1,16, P = 0,005 ]. L'aire sous la courbe caractéristique de fonctionnement du récepteur pour les CV de taille CPP2 était de 0,75 (IC à 95 % 0,60, 0,90). Le T50 était similaire chez les participants IRC avec et sans CV, bien que les deux groupes aient un T50 inférieur à celui de HV.

Conclusion : Le Rh de CPP2, mais pas de T50, est indépendamment associé à la CV chez les patients atteints d'IRC de stade 4 à 5.

Mots clés: propension à la calcification particule de calciprotéine maladie rénale chronique métabolisme minéral calcification vasculaire.

© The Author(s) 2018. Publié par Oxford University Press pour le compte d'ERA-EDTA. Tous les droits sont réservés.


Résultats et discussion

Prédiction et détection expérimentale d'un effet isotopique spectral dans le PYP

L'échange de l'atome d'hydrogène dans une liaison hydrogène au deutérium modifie légèrement la force de l'interaction de la liaison hydrogène. Dans l'eau, les liaisons hydrogène sont plus faibles que les liaisons deutérium de 𢏀.6 kJ/mol, ce qui correspond à un affaiblissement de 5% (28,29). En revanche, les études expérimentales en phase gazeuse sur les petites molécules et les études informatiques ont révélé que les liaisons hydrogène ioniques sont caractérisées par l'effet inverse, avec une liaison deutérium qui est 5% plus faible (29,30). L'effet de l'échange hydrogène/deutérium (H/D) sur la force de la liaison hydrogène est basé sur des changements subtils des modes de vibration intramoléculaires donneur-accepteur à travers la liaison hydrogène, ce qui entraîne des effets opposés sur l'échange H/D pour les liaisons hydrogène neutres par rapport aux liaisons ioniques ( 29,30). L'influence de l'échange H/D sur la force de la liaison hydrogène se reflète également dans un changement dans la géométrie de la liaison hydrogène, qui est l'effet Ubbelohde (31). Récemment, des calculs ab initio ont révélé un tel effet pour le pLes liaisons hydrogène de la chaîne latérale CA au niveau du site actif sur PYP (32).

Sur la base de la dépendance empirique de la λmax du PYP sur la force de la liaison hydrogène entre le résidu 46 et le pCA, et les effets rapportés de l'échange H/D sur la force de liaison hydrogène, l'effet de l'échange H/D de la chaîne latérale de Glu-46 sur la λmax du PP peut être prédit. Parce que le Glu-46-pLa liaison hydrogène CA est ionique et devrait donc être affaiblie lors de l'échange H/D, et parce qu'un Glu-46- affaiblipLa liaison hydrogène CA entraîne un décalage vers le rouge, nous nous attendons à ce que la λmax du PP en D2O est légèrement décalé vers le rouge. Nous nous référons aux changements de position du pic d'une transition électronique λmax lors de l'échange H/D en tant qu'effet spectral isotopique (SIE).

Une estimation de la taille de ce SIE pCA peut être obtenu si à la fois le changement de force de liaison hydrogène lors de l'échange H/D (ΔHBSHD) et le changement de λmax causé par un changement dans la force de liaison hydrogène (Δλmax, HBS) sont connus : SIE = ΔHBSHD × Δλmax, HBS.

Nous estimons la dépendance de la λmax de Hh PYP sur la force de liaison hydrogène entre le résidu 46 et le pCA basé sur les décalages spectraux causés par les mutations E46Q et E46V (23�). La mutation E46Q provoque un redshift de 14 nm (de 446 à 460 nm). Nous utilisons l'approximation selon laquelle la mutation E46Q réduit la force de liaison hydrogène entre le pCA et le résidu 46 de moitié (estimé à � kJ/mol, c'est-à-dire la moitié d'une liaison hydrogène ionique typique, voir ci-dessous), correspondant à un décalage vers le rouge de 721਌m 𢄡 dans λmax pour une réduction de �਌m 𢄡 de la force de la liaison hydrogène (voir le tableau 1 ). Ces données donnent une valeur pour Δλmax, HBS de 𢏀.6 nm par 1 kJ/mol perte de force de liaison hydrogène. Une estimation similaire est obtenue lorsque le décalage de 32 nm dans λmax lors de la suppression complète de cette liaison hydrogène (estimée à � kJ/mol) dans E46V PYP est considérée. Sur la base des résultats publiés (29), nous utilisons une valeur de 5% de réduction de la force de la liaison hydrogène ionique entre le résidu 46 et le pCA sur échange H/D. Par conséquent, une réduction de 5% (2,5 kJ/mol) de la force du Glu-46-pLa liaison hydrogène CA causée par l'échange H/D devrait entraîner un décalage vers le rouge de 𢏁.5 nm dans le λmax du PP. Nous avons testé expérimentalement cette prédiction à la fois pour le PYP hautement étudié de Hh PYP et le PYP récemment identifié de la bactérie extrêmement halophile Sr PYP, qui s'est avéré présenter des propriétés spectrales et cinétiques significativement différentes (12,17).

Tableau 1

Changements observés expérimentalement dans les maxima d'absorbance de Sr PYP et Hh PYP et de leurs mutants E46Q causés par l'échange H/D par rapport aux estimations provisoires de la force de la liaison hydrogène entre le pCA et résidu 46

ProtéineAbsorbance maximale Estimation provisoire de pRésidu CA 46 HB force a
nmcm 𢄡 kJ/molcm 𢄡
Sr PP
H2O431.823,158504,179
2O437.122,87847.73,970
Δ par H/D échange5.32802.5209
Sr E46Q PP
H2O455.121,973252,089
2O457.821,84323.81,989
Δ par H/D échange2.71301.3100
Δ par mutation23.31,185252,090
Hh PP
H2O445.722,436453,761
2O447.522,346433,594
Δ par H/D échange1.8902167
Hh E46Q PP
H2O460.521,715231,922
2O461.521,668221,839
Δ par H/D échange1.047183
Δ par mutation14.8721221,880

Nous avons déterminé l'effet de l'échange H/D sur le spectre d'absorbance du PYP en mesurant les spectres d'absorbance UV/vis de Hh PYP et Sr PYP dans H tamponné.2O et D2O solutions (pH 7,0). Cette mesure a révélé des changements faibles mais mesurables dans les spectres d'absorbance à la fois du Hh PYP et du Sr PYP (Fig.ਂ, Tableau 1). Les premières dérivées des spectres d'absorbance ont été utilisées pour extraire les positions exactes des pics des bandes d'absorbance du chromophore. Cette quantification du SIE dans Hh PYP et Sr PYP a donné deux observations clés. Premièrement le λmax de Hh PYP à 445,7 nm présente un décalage vers le rouge de 1,8 nm en D2O (Fig.ਂ), cohérent avec les résultats précédents (33). Après incubation dans D2O et l'échange H/D qui en résulte, le λmax de Sr PYP à 431,8 nm est décalé vers le rouge de 5,3 nm (Fig.ਂ). Ainsi, pour les deux PP, un SIE est observé. La direction de ce SIE est cohérente avec le décalage attendu pour une liaison hydrogène ionique dérivée précédemment. Nous appelons cet effet un SIE inversé, car il est à l'opposé de ce qui serait attendu pour une liaison hydrogène standard. Deuxièmement, le SIE inversé pour Sr PYP est plus grand d'un facteur trois par rapport à celui de Hh PYP.

Effets spectraux des isotopes dans le PYP. Les spectres d'absorbance UV/vis des PP de S. ruber (les deux premières courbes) et H. halophila (deux courbes du bas) et le mutant E46Q de Sr PYP (deux courbes du milieu) en H2O (le noir) et D2O (rouge). Les décalages dans les bandes d'absorbance du chromophore lors de la dissolution des protéines dans D2O sont indiqués. Pour voir cette figure en couleur, allez en ligne.

Affectation et analyse du SIE au Glu-46-pliaison hydrogène CA

Comme première étape vers une affectation solide du groupe d'échange H/D responsable du SIE inversé observé dans le PYP, nous notons que le pLa molécule CA dans PYP ne contient aucun proton échangeable (voir Fig.ਁ). Par conséquent, tout changement de λmax sur l'échange H/D sont causées par des effets indirects à travers des interactions entre les pCA et chaînes latérales et/ou groupes OH/NH du squelette dans la protéine qui subissent un échange H/D. Une possibilité est que le SIE observé soit le résultat cumulatif de multiples très petits effets causés par des événements d'échange H/D sur un certain nombre de sites. Une autre explication est que le SIE observé est causé par un groupe échangeable qui interagit directement avec le pCALIFORNIE. Ci-dessous, nous considérons explicitement ces deux options.

Les effets des mutations sur le λmax de Hh PYP a été étudiée par le biais de mutations dirigées sur 22 résidus sélectionnés sur la base de la structure cristalline de PYP (résumée en (12)), plaçant chacune des 19 chaînes latérales possibles en position 46 (25,26), et une alanine complète scan du PP (34). Les perturbations causées par ces mutations ont en général tendance à provoquer de petits décalages spectraux à la fois vers les côtés bleu et rouge du spectre. Notamment, le décalage de loin le plus important est causé par des substitutions en position 46, ce qui implique que ce résidu joue un rôle inhabituel dans l'accord spectral de PYP. Sur la base de ces données, on s'attendrait à ce que dans le cas où un nombre substantiel d'événements d'échange H/D affecte le λmax de Sr PYP, ces petits effets indépendants provoqueraient de petits changements dans λmax à la fois vers le bleu et vers le rouge, et s'annulerait donc largement (Δλmax𢒀). Une autre considération est que la stabilité thermodynamique des protéines contre le dépliement est connue pour être légèrement affectée par l'échange H/D (35). Cependant, dans les études de mutation systématique de Hh PYP, aucune corrélation n'a été trouvée entre la stabilité thermodynamique d'un mutant et sa λmax (34). Cela implique que la stabilité du PYP contre le dépliement n'est pas un mécanisme impliqué dans l'ajustement spectral de cette protéine, et donc un petit changement dans sa stabilité causé par l'échange H/D ne devrait pas altérer son λmax. Ces considérations vont à l'encontre d'une explication du SIE observé basée sur de petits décalages λmax causés par des événements d'échange H/D sur plusieurs sites différents.

En considérant une origine possible du SIE dans l'échange H/D d'un groupe dans la poche de liaison aux protéines du pCA il convient de noter que les interactions faibles entre le chromophore et la protéine, telles que les liaisons hydrogène et les contre-ions, sont de nature électronique, alors que l'échange H/D est une perturbation nucléaire qui ne modifie pas la structure électronique. Dans le cas de la liaison hydrogène, l'échange H/D provoque une modification de 𢏅% de la force de l'interaction. Ainsi, l'interaction faible qui est affectée par l'échange H/D résultant du SIE observé devrait avoir un effet substantiel sur λmax. Sur la base de la structure cristalline du PYP, la chaîne latérale Arg-52 a été initialement proposée comme le contre-ion de la charge négative. pCA (36). Cependant, des études ultérieures sur les mutants R52A et R52Q n'ont révélé que des effets relativement faibles sur les deux λmax et pKune du pCALIFORNIE. Sur la base des petits effets des mutations R52A et R52Q beaucoup plus dramatiques sur le spectre d'absorbance du PYP, nous concluons que l'effet de l'échange H/D de l'Arg-52 serait trop faible pour provoquer le SIE observé.Cela laisse le groupe OH phénolique de Tyr-42 et le groupe COOH de Glu-46 comme candidats mutations aux deux résidus ont des effets relativement forts sur le λmax de Hh PP. De plus, le groupe NH du squelette de Cys-69, qui forme une liaison hydrogène entre l'oxygène carbonyle du pCA est un candidat pour le groupe d'échange H/D contribuant aux mesures RMN publiées SIE observées (37) indiquent que l'amide du squelette de Cys-69 subira effectivement un échange H/D dans les conditions de mesure utilisées ici. La chaîne latérale de Glu-46 est l'option la plus probable, car le SIE prédit sur la base de l'échange H/D de cette chaîne latérale dérivée précédemment correspond assez bien à l'effet observé.

Pour tester expérimentalement la possibilité que le SIE significatif dans Sr PYP soit dû aux liaisons hydrogène du pCA avec Tyr-42 ou Glu-46, et pour décortiquer les contributions de ces deux interactions au SIE, nous avons préparé les mutants Y42F et E46Q de Sr PYP. Ces mutants diminuent fortement leur liaison hydrogène au pCA et réduirait donc également le SIE associé à ces liaisons hydrogène. Y42F Sr PYP présentait un rendement d'expression très faible et une instabilité significative, empêchant sa purification pour des études spectroscopiques. Pour le mutant E46Q de Sr PYP, nous avons détecté un décalage vers le rouge de 2,7 nm dans son λmax à 455.1 nm lors de l'incubation dans D2O (Fig.ਂ). La réduction par deux du SIE du E46Q Sr PYP par rapport au Sr PYP de type sauvage établit que la forte interaction de liaison hydrogène entre le Glu-46 et le pL'AC est directement impliquée dans cet effet. Le mutant E46Q est une variante particulièrement intéressante pour étudier le SIE dans le PYP, car il est connu pour ne provoquer que des perturbations locales au pPoche de reliure CA (20,22). Une preuve supplémentaire de cette affectation est fournie par les similitudes dans le comportement du SIE dans Sr PYP et Hh PYP, qui partagent seulement 28 % d'identité de séquence d'acides aminés mais conservent des résidus de site actif fonctionnellement importants : pour les deux PYP i), le λmax en ré2O est décalé vers le rouge et ii), le SIE est sensiblement réduit SIE par la mutation E46Q (Fig.ਂ et Tableau 1).

Les études structurales et spectroscopiques fournissent un cadre pour l'interprétation de ces données spectroscopiques et indiquent deux facteurs importants pour comprendre le SIE inversé du PYP. Le premier facteur est que les liaisons hydrogène de Tyr-42 et Glu-46 avec le pCA sont courts. Des études cristallographiques aux rayons X à une résolution de 0,82 et 1,00&# x000a0&# x000c5 ont révélé que les liaisons hydrogène des chaînes latérales de Glu-46 et Tyr-42 au pCA chromophore sont 2.6 et 2.5 Å, respectivement (13,20) ( Fig.ਁ B), et sont donc significativement plus courtes que les liaisons hydrogène standard. Des études de diffraction des neutrons ont confirmé la présence de ces liaisons hydrogène courtes (38,39). Des informations indépendantes sur la présence de ces fortes liaisons hydrogène courtes avec le pLe CA a été obtenu à la fois par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier du mode d'étirement C=O de la chaîne latérale de Glu-46 dans Hh PYP (14,15) et par spectroscopie RMN des signaux RMN du proton en champ lointain de Tyr-42 et Glu -46 (21). La deuxième considération est que les chaînes latérales de Tyr-42 et Glu-46 sont neutres, alors que le pCA dans PYP est ionisé (40). Ainsi, l'oxygène phénolique chargé négativement du pCA interagit avec les chaînes latérales neutres de Tyr-42 et Glu-46 via une liaison hydrogène ionique fourchue (13,20,39). La courte longueur et la nature ionique du Glu-46-pLes liaisons hydrogène CA sont en excellent accord avec l'attribution d'un SIE à cette interaction.

Le rôle de la liaison hydrogène entre le groupe NH du squelette de Cys-69, et l'oxygène carbonyle du pL'AC dans le réglage spectral du PYP est difficile à étudier directement, car l'atome de squelette de Cys-69 impliqué ne peut pas être modifié par mutagenèse dirigée. Okamoto etਊl. (41,42) ont abordé ce problème en utilisant des composés modèles qui combinent un pfraction CA avec des composés capables ou incapables de former un cycle à 7 chaînons par liaison hydrogène intramoléculaire. Les mesures de ces composés modèles de chromophore déprotonés dans un solvant aprotique (tétrahydrofurane) ont révélé que la rupture de cette liaison hydrogène décale le maximum d'absorbance du composé modèle de � nm à � nm (voir Fig.ਅ, une et b dans (41)). Ces résultats indiquent que la liaison hydrogène Cys-69-chromophore dans le PYP contribue à son maximum d'absorbance relativement décalé vers le rouge à 446 nm dans la protéine native. Ce résultat implique qu'une augmentation de la force de la liaison hydrogène entre le pCA et le groupe amide du squelette de Cys-69 entraînent un décalage vers le rouge dans le λmax du PP. Étant donné que cette liaison hydrogène a une longueur standard proche de 2,8 Å et parce que la plupart de la charge négative du chromophore déprotoné dans PYP est centrée près de l'oxygène phénolique, le pLa liaison hydrogène CA-Cys-69 est du type standard. Par conséquent, son échange H/D entraînera une petite augmentation de sa force, ce qui devrait provoquer un petit décalage vers le rouge du λmax du PP lors de l'échange H/D. Étant donné que ce changement va dans le sens que nous avons observé expérimentalement, nous devons considérer la contribution de cet effet au SIE dans le PP.

Sur la base de l'hypothèse que les résultats des composés modèles précédents sont directement applicables au PYP, la perturbation du Cys-69-pLa liaison hydrogène CA provoque un décalage vers le bleu de 840਌m 𢄡 (de 430 à 415 nm), tandis que la perturbation du Glu-46-pLa liaison hydrogène CA (dans E46I PYP) provoque un décalage vers le rouge de 1501਌m 𢄡 (de 446 à 478 nm). Cette considération indique que l'effet du Glu-46-pliaison hydrogène CA sur le λmax du PYP est sensiblement plus fort que celui du Cys-69-pliaison hydrogène CA. Dans le cas du mutant E46Q de Hhal PYP, la liaison hydrogène entre le résidu 46 est allongée de 11% (de 2,58 à 2,87 Å), tandis que le Cys-69-pCA est allongé de 3% (de 2,72 à 2,80 Å). Cette analyse soutient l'interprétation selon laquelle le SIE réduit dans E46Q PYP est en grande partie causé par un affaiblissement de la liaison hydrogène entre le pCA et résidu 46. Nous concluons qu'une contribution possible du Cys-69-pLa liaison hydrogène CA au SIE observé dans le PYP n'affecte pas notre attribution d'une grande partie de cet effet au Glu-46-pliaison hydrogène CA.

L'observation que le SIE inversé pour Sr PYP est significativement plus grand que celui pour Hh PYP conduit à proposer que le Glu-46-pLa liaison hydrogène CA dans Sr PYP est plus forte que celle dans Hh PYP. Ce serait inattendu, car dans Hh PYP, cette liaison hydrogène est déjà assez forte et courte (13,20,21,39). Deux considérations appuient directement cette interprétation. Premièrement le λmax de Sr PYP est significativement décalé vers le bleu par rapport à celui de Hh PYP. Une augmentation de la force du Glu-46-pLa liaison hydrogène CA devrait provoquer un tel décalage vers le bleu. Deuxièmement, la mutation E46Q provoque un fort décalage vers le rouge de 1185਌m 𢄡 dans le λmax de Sr PYP à 457,8 nm ( Fig.ਂ ) par rapport au plus petit décalage vers le rouge de 721਌m 𢄡 causé par la même mutation dans Hh PYP (23,24). Ces résultats soutiennent l'idée que l'étendue du SIE dans le PYP reflète la force de la liaison hydrogène ionique entre le Glu-46 et le pCALIFORNIE. Dans la Fig.ਃ, nous résumons la lecture spectroscopique de la force de la liaison hydrogène ionique entre le résidu 46 et le pCA au site actif du PP via un SIE inversé.

Effets de l'échange H/D sur la force de liaison hydrogène du site actif et le maximum d'absorbance dans le PYP. L'affaiblissement estimé de la liaison hydrogène entre le résidu 46 et le chromophore lors de l'échange H/D, et le décalage vers le rouge résultant détecté expérimentalement dans le maximum d'absorbance sont représentés pour le PYP de Salinibacter ruber et son mutant E46Q.

Classification des liaisons hydrogène avec des propriétés qualitativement différentes

Actuellement, la classification la plus utile des interactions de liaison hydrogène dans les protéines est débattue. Certains auteurs ont proposé une classification basée sur la force des liaisons hydrogène, avec des liaisons hydrogène fortes (60� kJ/mol), modérées (15� kJ/mol) et faibles (㰕 kJ/mol) (43 ). D'autres ont souligné la forme du potentiel de liaison hydrogène en tant que puits double, puits unique et LBHB (44). Une autre classification, introduite dans les études sur le rôle des liaisons hydrogène C-H⋅⋅⋅O, se concentre sur le type d'atome auquel l'atome d'hydrogène formant la liaison hydrogène est connecté (6). En particulier, le rôle que jouent les liaisons hydrogène ioniques (7,45), dans lesquelles une charge nette est présente sur la paire donneur-accepteur de liaisons hydrogène, dans les protéines reste incertain.

Sur la base des résultats rapportés ici en combinaison avec l'analyse de la richesse des données biophysiques disponibles sur le PP (voir (8,9)) et en s'appuyant sur le grand nombre d'informations disponibles sur les liaisons hydrogène (7,43,45), nous proposons que il est utile de distinguer trois types qualitativement différents de liaisons hydrogène impliquant des atomes N et O (Fig.਄). Sur la base de la littérature publiée (7,43,45), ces liaisons hydrogène peuvent être distinguées par leur comportement le long de deux coordonnées de réaction clés. Premièrement, la distance entre les hétéroatomes dans la paire donneur-accepteur de liaison hydrogène définit la longueur et la force de la liaison hydrogène (Fig.਄ UNE). Deuxièmement, la position du proton entre ces deux hétéroatomes décrit le transfert de proton le long de la liaison hydrogène (Fig. B). Cette approche conduit aux trois types de liaisons hydrogène suivants : i), les liaisons hydrogène standard, telles que celles qui tiennent ensemble α-hélices, avec une longueur proche de 2,8 Å et une force typique de � kJ/mol (43) ii), des liaisons hydrogène ioniques, avec une longueur proche de 2,6 Å et un type force proche de 50 kJ/mol (7,45) et iii), LBHBs avec une longueur proche de 2,4 Å et une force typique de � kJ/mol (5,7). Bien que les longueurs de ces trois types de liaisons hydrogène soient assez bien définies, leurs énergies sont susceptibles de varier considérablement en fonction des détails chimiques et de l'environnement moléculaire de la liaison hydrogène. De ces trois types de liaisons hydrogène, seul le LBHB agit comme un système de puits unique pour le transfert de protons. Cette analyse implique que la présence d'une courte liaison hydrogène ionique est distincte d'un LBHB. Ainsi, les liaisons hydrogène courtes et fortes souvent mentionnées dans divers systèmes protéiques (par exemple, (46)) peuvent en fait impliquer deux types distincts de liaisons hydrogène.

Distinction entre trois types de liaisons hydrogène. La distance entre les hétéroatomes dans la paire donneur-accepteur de liaison hydrogène (UNE) définissent la longueur et la force d'équilibre des liaisons hydrogène, tandis que la position du proton le long de cette liaison hydrogène (B) détermine l'énergie potentielle de transfert de protons entre le donneur et l'accepteur de liaison hydrogène. Ces deux coordonnées de réaction conduisent à une distinction entre les liaisons hydrogène normales (NHB) d'une longueur de 3,00 (ଐ.20) Å, la liaison hydrogène ionique (IHB) d'une longueur de 2,72 (ଐ.10) & #x000c5, et des liaisons hydrogène à faible barrière (LBHB) d'une longueur de 2,46 (ଐ.03) Å. Les courbes d'énergie potentielle représentées sont destinées à refléter les différences qualitatives entre les trois types de liaisons hydrogène, tout en décrivant des valeurs physiquement raisonnables. Des informations quantitatives sur les formes de ces paysages énergétiques ont été obtenues à partir de (52�). Bien que les liaisons hydrogène ioniques et les LBHB soient tous deux considérablement plus forts que les liaisons hydrogène standard, les valeurs de leur force sont moins bien définies et susceptibles de varier considérablement en fonction des détails de la nature chimique de la paire donneur-accepteur et de leur environnement physique. De même, les valeurs exactes des barrières et des différences d'énergie pour le transfert de protons dans le panneau B sont destinés à illustrer les différences entre les trois types de liaisons hydrogène, les énergies absolues des bons puits et les niveaux de vibration sont à des fins d'illustration. Les valeurs représentées ont été choisies pour refléter les liaisons hydrogène impliquant des hétéroatomes O (et N). Les liaisons hydrogène normales sont abondantes dans les protéines. Les liaisons hydrogène ioniques se trouvent sur certains sites actifs et se produisent souvent à la surface des protéines. Les LBHB sont rares et sont souvent présents au site actif de la protéine.

Pertinence de la liaison hydrogène ionique pour les protéines

La valeur de la classification précédente des liaisons hydrogène est illustrée par le récent débat sur une liaison hydrogène fonctionnellement importante et courte au site actif du PYP : différents groupes de recherche ont rapporté que cette liaison hydrogène est (39) ou n'est pas (38,47 ) un LBHB. Nous proposons que la vérité se situe probablement entre les deux, à savoir que cette liaison hydrogène de site actif est une liaison hydrogène ionique forte sans être un LBHB, c'est-à-dire la deuxième classe de liaisons hydrogène représentée sur la figure.਄. Cette proposition réconcilie la courte longueur de la liaison hydrogène avec la spectroscopie vibrationnelle montrant que dans l'état sombre du PYP la chaîne latérale de Glu-46 est protonée (14,15) alors que la pL'AC est ionisée et est conforme aux résultats de calcul récents (47).

Les liaisons hydrogène ioniques dans les protéines présentent un intérêt biologique considérable. Elles sont sensiblement plus courtes et souvent beaucoup plus fortes que les liaisons hydrogène standard (7,45), et ont été impliquées comme étant des caractéristiques importantes sur les sites actifs d'une gamme de protéines, y compris la protéine fluorescente verte (48), la sérine protéase (49) , protéase du VIH (50), acétylcholinestérase, cétostéroïde isomérase (46) et PYP (39,47). Cependant, jusqu'à récemment, ces résultats structurels et spectroscopiques ont souvent été interprétés sans tenir compte des propriétés inhabituelles de la liaison hydrogène ionique. Un exemple pertinent est que les liaisons hydrogène entre le pLe CA et les chaînes latérales de Tyr-42 et Glu-46 ont été décrits comme inhabituellement courts (20,38). Cependant, la longueur de ces liaisons hydrogène est celle attendue pour une liaison hydrogène ionique, et n'est donc inhabituelle que si les propriétés de ces liaisons hydrogène sont considérées dans le cadre des liaisons hydrogène standard. Les propriétés uniques des liaisons hydrogène ioniques sont également responsables de la nature inversée du SIE rapporté ici.

Ici, nous rapportons et attribuons un SIE dans le spectre d'absorbance électronique du récepteur de lumière bleue bactérienne PYP. Auparavant, de petits décalages dans les pics d'absorbance du PYP (33) et de la protéine fluorescente verte (51) étaient signalés comme des observations non interprétées. Nous fournissons un cadre conceptuel pour comprendre de tels effets isotopiques spectraux, rapportons l'affectation expérimentale du SIE inversé au Glu-46-ioniquepCA liaison hydrogène, et démontrer comment les effets SIE peuvent être utilisés comme une lecture spectroscopique de la présence et de la force de telles liaisons hydrogène ioniques. Déterminer la force de liaison hydrogène dans les protéines reste un défi important en biophysique des protéines, et les valeurs rapportées dans le tableau 1 sont des estimations provisoires. Cependant, les résultats et l'analyse présentés ici permettent une attribution et une analyse fermes du SIE dans le PP, et attirent l'attention sur l'importance de distinguer les interactions ioniques et LBHB. Les résultats sont susceptibles d'être largement applicables aux systèmes qui présentent des décalages spectraux prévisibles dans une transition électronique lors de changements dans les liaisons hydrogène et indiquent que le SIE inversé fournit, à notre connaissance, un nouvel outil pour sonder les liaisons hydrogène ioniques. En général, un SIE est attendu pour tous les photorécepteurs dans lesquels le λmax du photorécepteur à l'étude est affecté par les liaisons hydrogène entre le chromophore et les groupes dans sa poche de liaison, ou plus précisément, qu'un changement de 𢏅% dans la force de la liaison hydrogène du site actif conduit à un changement mesurable de λmax. Lorsque la relation entre la force de la liaison hydrogène entre le chromophore et ce groupe d'échange H/D est connue, le SIE fournit une lecture spectroscopique directe de la force relative de la liaison hydrogène par rapport à la liaison deutérium impliquée. Pour les liaisons hydrogène ioniques, un affaiblissement de la force d'interaction est attendu lors de l'échange H/D de l'hydrogène de pontage dans la liaison hydrogène.


Contenu

Chez les bactéries à Gram négatif, telles que Escherichia coli (E. coli), la phosphatase alcaline est située dans l'espace périplasmique, à l'extérieur de la membrane cellulaire interne et dans la partie peptidoglycane de la paroi cellulaire. Étant donné que la brèche périplasmique est plus sujette aux variations environnementales que la cellule interne, la phosphatase alcaline est convenablement résistante à l'inactivation, à la dénaturation ou à la dégradation. Cette caractéristique de l'enzyme est peu commune à de nombreuses autres protéines. [dix]

La structure et la fonction précises des quatre isozymes (Int dans E. coli) sont uniquement destinés à fournir une source de phosphate inorganique lorsque l'environnement manque de ce métabolite. Les quatre enzymes dépendent de l'emplacement de l'expression tissulaire. Les quatre sites d'expression tissulaire sont l'ALP intestinale, l'ALP placentaire, l'ALP des cellules germinales et l'ALP foie/os/rein. [11] Les phosphates inorganiques produits par ces isozymes sont ensuite liés à des protéines porteuses qui livrent les phosphates inorganiques à un système de transport spécifique à haute affinité, connu sous le nom de système Pst, qui transporte le phosphate à travers la membrane cytoplasmique. [12]

Tandis que la membrane externe de E. coli contient des porines perméables aux composés phosphorylés, contrairement à la membrane interne. Ensuite, un problème se pose quant à la manière de transporter ces composés à travers la membrane interne et dans le cytosol. Certes, avec la forte charge anionique des groupes phosphate avec le reste du composé, ils sont très non miscibles dans la région non polaire de la bicouche. La solution résulte du clivage du groupe phosphate du composé via ALP. En effet, avec le composé concomitant auquel le phosphate était lié, cette enzyme produit du phosphate inorganique pur qui peut être finalement ciblé par le système de transport spécifique du phosphate (système Pst) [13] pour la translocation dans le cytosol. [14] En tant que tel, le but principal de la déphosphorylation par la phosphatase alcaline est d'augmenter la vitesse de diffusion des molécules dans les cellules et de les empêcher de se diffuser. [15]

La phosphatase alcaline est une enzyme dimère contenant du zinc avec un PM : 86 000 Da, chaque sous-unité contenant 429 acides aminés avec quatre résidus cystéine reliant les deux sous-unités.[16] La phosphatase alcaline contient quatre ions Zn et deux ions Mg, Zn occupant les sites actifs A et B, et Mg occupant le site C, de sorte que la phosphatase alcaline native pleinement active est appelée (ZnUNEZnBmgC)2 enzyme. Le mécanisme d'action de la phosphatase alcaline implique la coordination géométrique du substrat entre les ions Zn dans les sites actifs, alors que le site Mg ne semble pas être assez proche pour participer directement au mécanisme d'hydrolyse, cependant, il peut contribuer à la forme du potentiel électrostatique autour du centre actif. [16] La phosphatase alcaline a un Km de 8,4 x 10 -4 . [17]

Phosphatase alcaline dans E. coli est rarement soluble et actif dans des conditions de température élevée telles que 80 °C. En raison de l'énergie cinétique induite par cette température, les faibles liaisons hydrogène et les interactions hydrophobes des protéines communes se dégradent et donc fusionnent et précipitent. Cependant, lors de la dimérisation de l'ALP, les liaisons maintenant ses structures secondaire et tertiaire sont efficacement enterrées de sorte qu'elles ne sont pas autant affectées à cette température. De plus, même à des températures plus élevées telles que 90 °C, l'ALP a la caractéristique rare de dénaturation inverse. Pour cette raison, alors que l'ALP se dénature finalement à environ 90 ° C, il a la capacité supplémentaire de reformer avec précision ses liaisons et de revenir à sa structure et à sa fonction d'origine une fois refroidi. [dix]

Phosphatase alcaline dans E. coli est situé dans l'espace périplasmique et peut donc être libéré en utilisant des techniques qui affaiblissent la paroi cellulaire et libèrent la protéine. En raison de l'emplacement de l'enzyme et de la disposition des protéines de l'enzyme, l'enzyme est en solution avec une plus petite quantité de protéines qu'il n'y en a dans une autre partie de la cellule. [18] La stabilité thermique des protéines peut également être mise à profit lors de l'isolement de cette enzyme (par dénaturation thermique). De plus, la phosphatase alcaline peut être dosée en utilisant le p-nitrophényl phosphate. Une réaction où la phosphatase alcaline déphosphoryle le substrat non spécifique, le p-nitrophényl phosphate afin de produire du p-nitrophénol (PNP) et du phosphate inorganique. La couleur jaune de PNP, et sonmax à 410 permet à la spectrophotométrie de déterminer des informations importantes sur l'activité enzymatique. [19] Certaines complexités de la régulation et du métabolisme bactériens suggèrent que d'autres objectifs, plus subtils, de l'enzyme peuvent également jouer un rôle pour la cellule. En laboratoire, cependant, le mutant Escherichia coli dépourvus de phosphatase alcaline survivent assez bien, tout comme les mutants incapables d'arrêter la production de phosphatase alcaline. [20]

Le pH optimal pour l'activité de la E. coli l'enzyme est de 8,0 [21] tandis que le pH optimal de l'enzyme bovine est légèrement supérieur à 8,5. [22] La phosphatase alcaline représente 6 % de toutes les protéines dans les cellules déréprimées. [17]

Complémentation intragénique Modifier

Lorsque plusieurs copies d'un polypeptide codé par un gène forment un agrégat, cette structure protéique est appelée multimère. Lorsqu'un multimère est formé à partir de polypeptides produits par deux allèles mutants différents d'un gène particulier, le multimère mixte peut présenter une activité fonctionnelle supérieure à celle des multimères non mélangés formés par chacun des mutants seuls. Dans un tel cas, le phénomène est appelé complémentation intragénique. E. coli la phosphatase alcaline, une enzyme dimère, présente une complémentation intragénique. [23] Lorsque des versions mutantes particulières de la phosphatase alcaline ont été combinées, les enzymes hétérodimères formées en conséquence ont présenté un niveau d'activité plus élevé que prévu sur la base des activités relatives des enzymes parentales. Ces résultats indiquent que la structure dimère de E. coli la phosphatase alcaline permet des interactions coopératives entre les monomères constitutifs qui peuvent générer une forme plus fonctionnelle de l'holoenzyme.

En modifiant les acides aminés de l'enzyme phosphatase alcaline de type sauvage produite par Escherichia coli, une phosphatase alcaline mutante est créée qui non seulement a une augmentation de 36 fois de l'activité enzymatique, mais conserve également la stabilité thermique. [24] Les utilisations typiques en laboratoire des phosphatases alcalines incluent l'élimination des monoesters de phosphate pour empêcher l'auto-ligature, ce qui est indésirable pendant le clonage d'ADN plasmidique. [25]

Les phosphatases alcalines couramment utilisées dans la recherche comprennent :

  • Phosphatase alcaline de crevette (SAP), d'une espèce de crevette arctique (Pandalus boréal). Cette phosphatase est facilement inactivée par la chaleur, une caractéristique utile dans certaines applications. (CIP) (PLAP) et sa version tronquée en C terminale dépourvue des 24 derniers acides aminés (constituant le domaine qui cible l'ancrage membranaire du GPI) - la phosphatase alcaline sécrétée (SEAP). Il présente certaines caractéristiques telles que la stabilité thermique, la spécificité du substrat et la résistance à l'inactivation chimique. [26]
  • Phosphatase alcaline intestinale humaine. Le corps humain contient plusieurs types de phosphatase alcaline, qui sont déterminés par un minimum de trois loci de gènes. Chacun de ces trois loci contrôle un type différent d'isoenzyme de la phosphatase alcaline. Cependant, le développement de cette enzyme peut être strictement régulé par d'autres facteurs tels que la thermostabilité, l'électrophorèse, l'inhibition ou l'immunologie. [27]

L'ALPase intestinale humaine présente une homologie d'environ 80 % avec l'ALPase intestinale bovine, ce qui confirme leurs origines évolutives communes. Cette même enzyme bovine a plus de 70 % d'homologie avec l'enzyme placentaire humaine. Cependant, l'enzyme intestinale humaine et l'enzyme placentaire ne partagent que 20 % d'homologie malgré leurs similitudes structurelles. [28]

La phosphatase alcaline est devenue un outil utile dans les laboratoires de biologie moléculaire, car l'ADN possède normalement des groupes phosphate à l'extrémité 5'. L'élimination de ces phosphates empêche la ligature de l'ADN (l'extrémité 5' se fixant à l'extrémité 3'), maintenant ainsi les molécules d'ADN linéaires jusqu'à l'étape suivante du processus pour lequel elles sont préparées également, l'élimination des groupes phosphate permet le radiomarquage (remplacement par des groupes phosphate radioactifs) afin de mesurer la présence de l'ADN marqué à travers d'autres étapes du processus ou de l'expérience. À ces fins, la phosphatase alcaline de crevette est la plus utile, car elle est la plus facile à inactiver une fois qu'elle a fait son travail.

Une autre utilisation importante de la phosphatase alcaline est comme marqueur pour les dosages immunologiques enzymatiques.

Les cellules souches pluripotentes indifférenciées ont des niveaux élevés de phosphatase alcaline sur leur membrane cellulaire, donc la coloration à la phosphatase alcaline est utilisée pour détecter ces cellules et tester la pluripotence (c'est-à-dire les cellules souches embryonnaires ou les cellules de carcinome embryonnaire). [29]

Il existe une corrélation positive entre les taux sériques de phosphatase alcaline osseuse (B-ALP) et la formation osseuse chez l'homme, bien que son utilisation comme biomarqueur en pratique clinique ne soit pas recommandée. [30]

Recherche en cours Modifier

Les chercheurs actuels étudient l'augmentation du facteur de nécrose tumorale-α et son effet direct sur l'expression de la phosphatase alcaline dans les cellules musculaires lisses vasculaires ainsi que la façon dont la phosphatase alcaline (AP) affecte les réponses inflammatoires et peut jouer un rôle direct dans la prévention des organes dommage. [31]

  • La phosphatase alcaline (AP) affecte les réponses inflammatoires chez les patients atteints d'insuffisance rénale chronique et est directement associée à l'anémie résistante aux agents stimulant l'érythropoïèse. [32]
  • La phosphatase alcaline intestinale (IAP) et le mécanisme qu'elle utilise pour réguler le pH et l'hydrolyse de l'ATP dans le duodénum du rat. [33]
  • Tester l'efficacité de l'inhibiteur et son impact sur l'IAP dans l'inflammation intestinale aiguë et explorer les mécanismes moléculaires de l'IAP pour « améliorer la perméabilité intestinale ». [34]

Industrie laitière Modifier

La phosphatase alcaline est couramment utilisée dans l'industrie laitière comme indicateur d'une pasteurisation réussie. C'est parce que la bactérie la plus stable à la chaleur trouvée dans le lait, Mycobactérie paratuberculosis, est détruite par des températures inférieures à celles requises pour dénaturer l'ALP. Par conséquent, la présence d'ALP est idéale pour indiquer l'échec de la pasteurisation. [35] [36]

La vérification de la pasteurisation est généralement effectuée en mesurant la fluorescence d'une solution qui devient fluorescente lorsqu'elle est exposée à l'ALP active. Les tests de fluorimétrie sont requis par les producteurs de lait au Royaume-Uni pour prouver que la phosphatase alcaline a été dénaturée, [37] car les tests de p-nitrophénylphosphate ne sont pas considérés comme suffisamment précis pour répondre aux normes de santé.

Alternativement, le changement de couleur d'un substrat de para-nitrophénylphosphate dans une solution tamponnée (test Aschaffenburg Mullen) peut être utilisé. [38] Le lait cru produirait généralement une coloration jaune en quelques minutes, alors que le lait correctement pasteurisé ne devrait montrer aucun changement. Il existe des exceptions à cela, comme dans le cas des phosphatases alcalines thermostables produites par certaines bactéries, mais ces bactéries ne devraient pas être présentes dans le lait.

Inhibiteurs Modifier

Toutes les isoenzymes de la phosphatase alcaline de mammifère, à l'exception du placenta (PALP et SEAP), sont inhibées par l'homoarginine et, de la même manière, toutes, à l'exception des enzymes intestinales et placentaires, sont bloquées par le lévamisole. [11] Le phosphate est un autre inhibiteur qui inhibe de manière compétitive la phosphatase alcaline. [39]

Un autre exemple connu d'inhibiteur de la phosphatase alcaline est l'acide [(4-nitrophényl)méthyl]phosphonique. [40]

Dans les sols contaminés par des métaux, les phosphatases alcalines sont inhibées par le Cd (cadmium). De plus, la température augmente l'inhibition de Cd sur l'activité ALP, ce qui est montré dans les valeurs croissantes de Km. [41]

Physiologie Modifier

Chez l'homme, la phosphatase alcaline est présente dans tous les tissus de l'organisme, mais elle est particulièrement concentrée dans le foie, les voies biliaires, les reins, les os, la muqueuse intestinale et le placenta. Dans le sérum, deux types d'isozymes de la phosphatase alcaline prédominent : le squelette et le foie. Pendant l'enfance, la majorité des phosphatases alcalines sont d'origine squelettique. [42] Les humains et la plupart des autres mammifères contiennent les isoenzymes de la phosphatase alcaline suivantes :

    – intestinal (poids moléculaire de 150 kDa) – tissulaire non spécifique (exprimé principalement dans le foie, les os et les reins) – placentaire (isozyme de Regan)
  • ALPG – cellule germinale

Quatre gènes codent pour les quatre isozymes. Le gène de la phosphatase alcaline non spécifique des tissus est situé sur le chromosome 1, et les gènes des trois autres isoformes sont situés sur le chromosome 2. [4]

Phosphatase alcaline intestinale Modifier

La phosphatase alcaline intestinale (IAP) est sécrétée par les entérocytes et semble jouer un rôle central dans l'homéostasie et la protection intestinales [43] [44] ainsi que dans la suppression de l'inflammation [45] via la répression du récepteur Toll-like (TLR) en aval. Cascade inflammatoire -4-dépendante et MyD88-dépendante. [46] Il déphosphoryle les ligands microbiens toxiques/inflammatoires comme les lipopolysaccharides (LPS), [47] les dinucléotides cytosine-guanine non méthylés, la flagelline et les nucléotides extracellulaires tels que l'uridine diphosphate ou l'ATP. La déphosphorylation du LPS par l'IAP peut réduire la gravité de Salmonelle tryphimurium et Clostridioides difficile infection rétablissant un microbiote intestinal normal. [47] Ainsi, l'expression altérée de l'IAP a été impliquée dans les maladies inflammatoires chroniques telles que les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). [47] [48] Il semble également réguler l'absorption des lipides [49] et la sécrétion de bicarbonate [50] dans la muqueuse duodénale, ce qui régule le pH de surface.

Dans les cellules cancéreuses Modifier

Des études montrent que la protéine phosphatase alcaline trouvée dans les cellules cancéreuses est similaire à celle trouvée dans les tissus corporels non malins et que la protéine provient du même gène dans les deux. Une étude a comparé les enzymes des métastases hépatiques du carcinome pulmonaire à cellules géantes et des cellules placentaires non malignes. Les deux étaient similaires dans NH2-séquence terminale, carte peptidique, poids moléculaire de la sous-unité et point isoélectronique. [51]

Dans une autre étude dans laquelle les scientifiques ont examiné la présence de la protéine phosphatase alcaline dans une lignée cellulaire de cancer du côlon humain, également connue sous le nom de HT-29, les résultats ont montré que l'activité enzymatique était similaire à celle du type intestinal non malin. Cependant, cette étude a révélé que sans l'influence du butyrate de sodium, l'activité de la phosphatase alcaline est assez faible dans les cellules cancéreuses. [52] Une étude basée sur les effets du butyrate de sodium sur les cellules cancéreuses indique qu'il a un effet sur l'expression du corégulateur des récepteurs androgènes, l'activité de transcription et également sur l'acétylation des histones dans les cellules cancéreuses. [53] Cela explique pourquoi l'ajout de butyrate de sodium montre une activité accrue de la phosphatase alcaline dans les cellules cancéreuses du côlon humain. [52] En outre, cela soutient davantage la théorie selon laquelle l'activité enzymatique de la phosphatase alcaline est réellement présente dans les cellules cancéreuses.

Dans une autre étude, des cellules de choriocarcinome ont été cultivées en présence de 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdUrd) et les résultats ont révélé une augmentation de 30 à 40 fois de l'activité de la phosphatase alcaline. Cette procédure d'amélioration de l'activité de l'enzyme est connue sous le nom d'induction enzymatique. Les preuves montrent qu'il existe en fait une activité de la phosphatase alcaline dans les cellules tumorales, mais elle est minime et doit être renforcée. Les résultats de cette étude indiquent en outre que les activités de cette enzyme varient entre les différentes lignées cellulaires de choriocarcinome et que l'activité de la protéine phosphatase alcaline dans ces cellules est plus faible que dans les cellules placentaires non malignes. [54] [55] mais les niveaux sont significativement plus élevés chez les enfants et les femmes enceintes. Les tests sanguins doivent toujours être interprétés en utilisant la plage de référence du laboratoire qui a effectué le test. Des niveaux élevés d'ALP peuvent survenir si les voies biliaires sont obstruées. [56]

En outre, l'ALP augmente s'il y a une formation osseuse active, car l'ALP est un sous-produit de l'activité des ostéoblastes (comme dans le cas de la maladie osseuse de Paget).

L'ALP est beaucoup plus élevée dans les cellules cancéreuses de la prostate métastatiques que dans les cellules cancéreuses de la prostate non métastatiques. [57] Des niveaux élevés d'ALP chez les patients atteints de cancer de la prostate sont associés à une diminution significative de la survie. [57]

Les niveaux sont également élevés chez les personnes atteintes de maladie cœliaque non traitée. [58] Les niveaux abaissés d'ALP sont moins communs que les niveaux élevés. La source des taux élevés d'ALP peut être déduite en obtenant des taux sériques de gamma glutamyltransférase (GGT). L'augmentation concomitante de l'ALP et de la GGT devrait faire suspecter une maladie hépatobiliaire. [59]

Certaines maladies n'affectent pas les niveaux de phosphatase alcaline, par exemple l'hépatite C. Un niveau élevé de cette enzyme ne reflète aucun dommage au foie, même si des niveaux élevés de phosphatase alcaline peuvent résulter d'un blocage du flux dans les voies biliaires ou une augmentation de la pression du foie. [60]

Niveaux élevés Modifier

S'il n'est pas clair pourquoi la phosphatase alcaline est élevée, des études d'isoenzymes utilisant l'électrophorèse peuvent confirmer la source de l'ALP. La skelphosphatase (qui est localisée dans les ostéoblastes et les couches extracellulaires de la matrice nouvellement synthétisée) est libérée dans la circulation par un mécanisme encore inconnu. [61] La phosphatase alcaline placentaire est élevée dans les séminomes [62] et les formes actives de rachitisme, ainsi que dans les maladies et affections suivantes : [63]

Niveaux abaissés Modifier

Les affections ou maladies suivantes peuvent entraîner une diminution des taux de phosphatase alcaline : [65]

    , une maladie autosomique récessive chez les femmes recevant un traitement œstrogénique en raison du vieillissement
  • Hommes ayant récemment subi une chirurgie cardiaque, une malnutrition, une carence en magnésium ou une anémie sévère
  • Enfants atteints d'achondroplasie et de carence congénitale en iode
  • Enfants après un épisode sévère d'entérite
  • Traitement aux stéroïdes
  • Colite

De plus, il a été démontré que les contraceptifs oraux réduisent la phosphatase alcaline. [66]

Utilisations pronostiques Modifier

La mesure de la phosphatase alcaline (avec l'antigène spécifique de la prostate) pendant et après six mois de cancer de la prostate métastatique traité aux hormones s'est avérée prédire la survie des patients. [67]

Phosphatase alcaline leucocytaire Modifier

La phosphatase alcaline leucocytaire (LAP) se trouve dans les globules blancs matures. Les taux de globules blancs de LAP peuvent aider au diagnostic de certaines conditions.

  • Des niveaux plus élevés sont observés dans la réponse physiologique, la réaction leucémique et dans les pathologies qui incluent les globules blancs matures, telles que la polyglobulie vraie (PV), la thrombocytose essentielle (TE) et la myélofibrose primaire (PM).
  • Des niveaux inférieurs sont trouvés dans des pathologies impliquant des leucocytes non développés, telles que la leucémie myéloïde chronique [68] (LMC), l'hémoglobinurie paroxystique nocturne (HPN) et la leucémie myéloïde aiguë (LAM).

Structure et propriétés Modifier

La phosphatase alcaline est une enzyme homodimérique, ce qui signifie qu'elle est formée de deux molécules. Trois ions métalliques, deux Zn et un Mg, sont contenus dans les sites catalytiques, et les deux types sont cruciaux pour que l'activité enzymatique se produise. Les enzymes catalysent l'hydrolyse des monoesters dans l'acide phosphorique qui peut en outre catalyser une réaction de transphosphorylation avec de grandes concentrations d'accepteurs de phosphate. Alors que les principales caractéristiques du mécanisme et de l'activité catalytiques sont conservées entre le phosphate alcalin mammifère et bactérien, la phosphatase alcaline mammifère a une activité spécifique plus élevée et Km valeurs ainsi une affinité plus faible, un pH optimal plus alcalin, une stabilité thermique plus faible, et sont généralement liés à la membrane et sont inhibés par les acides aminés L et les peptides via un mécanisme non compétitif. Ces propriétés diffèrent sensiblement entre les différentes isozymes de la phosphatase alcaline de mammifère et présentent donc une différence de in vivo les fonctions.

La phosphatase alcaline a une homologie dans un grand nombre d'autres enzymes et fait partie d'une superfamille d'enzymes avec plusieurs aspects catalytiques et caractéristiques de substrat qui se chevauchent. Cela explique pourquoi les caractéristiques structurelles les plus saillantes des alcalines de mammifères sont telles qu'elles sont et font référence à leur spécificité de substrat et à leur homologie avec d'autres membres de la famille des isozymes nucléosidiques pyrophosphatase/phosphodiestérase. [4] La recherche a montré une relation entre les membres de la famille des phosphatases alcalines et les aryl sulfatases. Les similitudes de structure indiquent que ces deux familles d'enzymes proviennent d'un ancêtre commun. Une analyse plus poussée a lié les phosphates alcalins et les aryl sulfatases à une superfamille plus large. Certains des gènes communs trouvés dans cette superfamille sont ceux qui codent pour les phosphodiestérases ainsi que pour l'autotoxine. [69]


Locus CD33 de la maladie d'Alzheimer : fonction des monocytes altérée et biologie amyloïde

Dans notre dissection fonctionnelle du locus de susceptibilité à la maladie d'Alzheimer CD33, nous avons constaté que l'allèle de risque rs3865444(C) était associé à une plus grande expression de la surface cellulaire de CD33 dans les monocytes (t50 = 10,06, P(joint) = 1,3 × 10(-13 )) des individus jeunes et plus âgés. Il était également associé à une internalisation réduite du peptide amyloïde-β 42, à l'accumulation de pathologies amyloïdes neurétiques et d'amyloïde fibrillaire sur l'imagerie in vivo, et à un nombre accru de microglies humaines activées.

Les figures

Figure 1. Le CD33 l'allèle à risque est…

Figure 1. Le CD33 l'allèle à risque est associé à une expression accrue de CD33 et à une diminution de l'absorption

Figure 2. L'allèle de susceptibilité de rs3865444…

Figure 2. L'allèle de susceptibilité de rs3865444 est associé à une augmentation du composé de Pittsburgh…

= 1,0) chez les sujets PiB négatifs. Les valeurs PiB des cohortes HAB (c) et ADNI (d) démontrent une fréquence accrue de sujets PiB+ avec l'allèle de risque rs3865444 C. Les valeurs PiB+ et PiB− sont séparées par une ligne pointillée.

Figure 3. L'immunohistochimie révèle l'expression de CD33 dans…

Figure 3. L'immunohistochimie révèle l'expression de CD33 dans le cerveau et une augmentation de la fréquence des stades…


Traitement

Le traitement de l'amylose cardiaque comprend deux domaines : (i) le traitement et la prévention des complications et (ii) l'arrêt ou le retard du dépôt amyloïde par un traitement spécifique.

Traitement des complications et comorbidités

Les soins de soutien aux patients atteints d'amylose cardiaque englobent différents aspects cliniques, notamment le traitement de l'insuffisance cardiaque, des arythmies, des troubles de la conduction, de la thromboembolie et de la présence concomitante d'une sténose aortique sévère (Chiffre 5). 23-25

Traitement spécifique (modifiant la maladie)

Le traitement du processus de dépôt amyloïde doit viser la production de protéine précurseur amyloïde ou l'assemblage de fibrilles amyloïdes.

Amylose AL

Le traitement spécifique de l'amylose AL cardiaque doit être entrepris par des équipes pluridisciplinaires impliquant des spécialistes en oncohématologie et en cardiologie et, dans la mesure du possible, les patients doivent être orientés vers des centres spécialisés. 26

Les patients atteints d'amylose AL ont non seulement une malignité hématologique, mais aussi leur atteinte multiviscérale les rend particulièrement fragiles et sensibles à la toxicité du traitement. Les approches thérapeutiques dépendent de l'évaluation des risques qui sont définis dans de nombreuses circonstances par le degré d'atteinte cardiaque (en ligne complémentaire Chiffre S1) et la réponse cardiaque dépend également de la réponse hématologique (complément complémentaire en ligne Table S1). 23, 24 Le rôle du cardiologue dans le traitement spécifique comprend : (i) l'évaluation cardiaque pour les stratégies hématologiques initiales, y compris la prise en compte d'une autogreffe de cellules souches Tableau S2), (ii) l'évaluation de la transplantation cardiaque et (iii) la surveillance cardiaque pendant la chimiothérapie.

Amylose ATTR

Il existe une disponibilité croissante d'options thérapeutiques nouvelles, efficaces et ciblées pour l'ATTRwt et l'ATTRv. Un diagnostic rapide est essentiel pour permettre le traitement rapide des manifestations neurologiques, cardiaques et autres manifestations systémiques, car le traitement est plus efficace dans les premiers stades de la maladie. 27-29 Des thérapies efficaces réduisent la production de TTR mutée (transplantation hépatique) et globale (silencieux génétiques) ou stabilisent la molécule de TTR circulante (stabilisants), empêchant leur dissociation ou leur clivage en fragments amyloïdogènes (Chiffre 6). Plusieurs nouveaux composés sont à l'étude, y compris des agents destinés à éliminer les fibrilles amyloïdes (matériel supplémentaire en ligne).

Les alternatives thérapeutiques actuelles distinguent l'ATTRv et l'ATTRwt et, dans le cas de l'ATTRv, selon la présence d'une cardiomyopathie, d'une polyneuropathie ou des deux (Chiffre 7). Une description détaillée des thérapies ATTR disponibles ou testées dans le cadre d'essais de phase III est disponible dans le matériel supplémentaire en ligne. Tafamidis doit généralement être considéré comme l'agent de choix chez les patients cardiaques ATTR avec une survie attendue raisonnable, tandis que le patisiran pourrait être envisagé chez les patients ATTRv avec atteinte cardiaque chez lesquels des silencieux géniques sont prescrits en raison d'une maladie neurologique symptomatique.

  • - La prise en charge de l'amylose cardiaque implique le traitement et la prévention des complications, l'arrêt ou le retard du dépôt amyloïde par des traitements spécifiques.
  • - Les traitements pharmacologiques spécifiques disponibles pour l'amylose ATTR comprennent des molécules stabilisantes (tafamidis) et des silencieux génétiques (patisiran et inotersen).
  • - Tafamidis est actuellement le seul médicament qui a montré son efficacité dans un essai randomisé chez les patients avec ATTRwt et ATTRv avec cardiomyopathie, et doit être envisagé chez les patients dont la survie attendue est raisonnable.

RÉSULTATS

La radioprotection a été évaluée par une réduction de la mort cellulaire induite par les radiations, de l'apoptose et/ou des dommages à l'ADN. Nous avons mesuré ces trois paramètres pour établir le potentiel radioprotecteur de trois classes d'imitateurs SOD dans les cellules WT et AT en parallèle afin de déterminer si 1) les effets radioprotecteurs dépendent des voies liées à l'ATM, et 2) le ou les composés pourraient avoir un potentiel bénéfices thérapeutiques pour les patients radiosensibles. Nous avons noté des effets radioprotecteurs dans 2 des 11 composés testés : MnMX-2-PyP-Calbio et MnTnHex-2-PyP. En outre, nous avons noté des effets possibles dépendants de l'ATM avec trois des tests.

MnMX-2-PyP et MnTnHex-2-PyP Viabilité accrue après exposition aux radiations

XTT a été utilisé pour évaluer à la fois la toxicité des composés et l'effet de chaque composé sur la cytotoxicité induite par l'IR. Toutes les cellules ont été prétraitées avec le composé indiqué deux heures avant d'être irradiées avec 5 Gy et ont été testées pour la viabilité 48 heures après l'irradiation. Trois des onze composés testés ont réduit la cytotoxicité induite par l'IR dans les cellules WT : MnMX-2-PyP-Calbio, MnTnHex-2-PyP et MnCl2 ( Tableau 1 ). MnTnHex-2-PyP (1 μM) a montré la réduction la plus significative de la cytotoxicité induite par l'IR dans les cellules WT, par rapport aux cellules WT irradiées non traitées : 58 % (p = 0,04). MnMX-2-PyP-Calbio (56 μM) a significativement réduit la cytotoxicité induite par IR de 25 % (p= 6휐 𢄤) dans les cellules WT. MnCl2 (1 μM) a été utilisé comme témoin et a réduit la mort cellulaire induite par IR de 31 % (p=2 × 10 𢄥) dans les cellules WT. Aucun des composés n'a présenté de réduction statistiquement significative de la cytotoxicité induite par IR dans les cellules A-T.

Tableau 1

Effets radioprotecteurs des imitateurs de la SOD (% de radioprotection)

XTTAnnexine/iodure de propidiumGamma H2AX IRIFComète neutre
Nom du composéConq(μM)PO (%)StdevÀ (%)StdevPO (%)StdevÀ (%)StdevPO (%)StdevPO (%)StdevÀ (%)Stdev
MnMx-2-PyP-Calbio5625 * 7.29�.2316.1211 * 2.10�.509.969.965.7719.99 * 17.160.2214.05
MnTM-2-PyP1�.7410.91�.2212.109.016.262.039.8713.692.168.83 * 14.120.0015.89
MnTE-2-PyP1�.3341.6741.6714.2912.323.4414.216.752.225.5113.4510.570.0018.43
MnTnHex-2-PyP158 * 7.32�.4956.6828.6126.0439 * 3.2557 * 11.3129.7616.9215.4318.79
MnTTEG-2-PyP1�.7125.00�.8161.193.220.414.1210.6119.5312.3418.5616.280.0014.28
MnBr8TSPP15.354.96�.8112.47�.5811.55�.5616.7270.332.6512.7510.780.0011.12
EUK-82014.7945.50�.9214.13𢄦.1012.2319.5616.43𢄠.4310.4127.6614.6115.8616.50
EUK-13410�.573.33�.814.547.189.978 * 4.2352 * 4.3521.0227.290.0020.23
EUK-18920�.1261.59�.764.367.2512.0910.957.8230.317.120.0012.570.0016.14
M40404201.4912.90�.2421.4614.318.254.361.63�.783.2444.5012.5628.0444.87
M4040320�.044.49�.7811.6033.0219.965.044.86�.543.3035.6615.460.0018.75
MnCl2131 * 0.5516.0012.9411.6917.19−.126.4722.7913.0021.8920.130.0035.97

MnMX-2-PyP-Calbio, MnTnHex-2-PyP et EUK-134 réduit l'apoptose induite par IR

L'annexine V et la coloration à l'iodure de propidium ont été utilisées pour mesurer l'apoptose post-radiation. Trois des onze composés testés ont montré une légère réduction du pourcentage de cellules apoptotiques après exposition aux rayonnements : MnMX-2-PyP, MnTnHex-2-PyP et EUK-134 (tableau 1). MnMX-2-PyP-Calbio (56 μM) a réduit l'apoptose induite par IR de 11% (p = 0,03) dans les cellules WT. Dans les cellules AT, MnTnHex-2-PyP (1 μM) a réduit l'apoptose induite par l'IR de 39% (p=0,01) et EUK-134 (10 μM) a fourni une protection de 8% (p=0,03) contre l'IR -apoptose induite. Le reste des composés n'a montré aucune protection contre l'apoptose induite par IR. MnCl2 n'a montré aucune protection dans les deux types de cellules.

MnTnHex-2-PyP Immunofluorescence induite par IR réduite γ-H2AX

Les dommages à l'ADN ont été mesurés en utilisant l'immunofluorescence pour détecter le marqueur de rupture double brin (DSB) de l'ADN γ-H2AX. Trois des onze produits chimiques ont réduit les foyers nucléaires d'immunofluorescence (IRIF) induits par l'IR. Les cellules non irradiées traitées avec MnTnHex-2-PyP ont montré des signes de légère toxicité à toutes les doses, ces cellules étaient environ 25 % positives pour les IRIF entre 0,05 et 1 μM. Après irradiation (2 Gy), MnTnHex-2-PyP a considérablement réduit les IRIF d'une manière dépendante de la dose (Figure 2 A et B). Les cellules irradiées traitées avec le véhicule seul étaient positives à 72 % pour les IRIF. Nous avons observé une réduction dose-dépendante avec des concentrations croissantes, avec un effet maximal à une concentration finale de 1 μM (une diminution proportionnelle de 57 % des IRIF (p=5 × 10 𢄣 )). De même, EUK-134 (10 μM) a provoqué une diminution proportionnelle de 52 % de la formation d'IRIF (p = 0,06). Le contrôle, MnCl2 (1 μM), n'a montré aucune réduction des IRIF. La formation d'IRIF n'a pas pu être étudiée dans les cellules A-T.

Formation de foyers d'immunofluorescence gamma-H2AX dans les cellules WT. Les cellules WT ont été incubées dans MnTnHex-2-PyP pendant 18 heures, ont été irradiées avec 2 Gy et fixées avec du paraformaldéhyde sur des lamelles. Après perméabilisation avec 0,5% de Triton-X 100, les cellules ont été colorées pour γ-H2AX et les cellules ont été notées pour la présence de foyers nucléaires IRIF. (A) Résultats IRIF pour les cellules WT traitées avec MnTnHex-2-PyP. Notez la réduction des cellules IRIF-positives avec des concentrations croissantes de MnTnHex-2-PyP. (B) Quantification des résultats de l'IRIF. Ligne continue : cellules WT non irradiées Ligne en pointillés : 15 minutes après 2 cellules Gy WT. La ligne directrice en pointillé indique le pourcentage de cellules WT irradiées positives pour les IRIF, en l'absence de tout composé, la flèche en pointillé indique la réduction maximale des cellules IRIF-positives après exposition à 1 μM MnTnHex-2-PyP. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard. Toutes les diapositives ont été codées par un individu et lues à l'aveugle par un autre. Les résultats présentés ici sont les résultats moyens de 3 expériences.

MnMX-2-PyP-Calbio et EUK-8 ont réduit les longueurs de queue de comète d'ADN dans les cellules WT et A-T

Les dommages à l'ADN induits par l'irradiation et la cinétique de réparation des DSB ont été mesurés avec le test des comètes neutres. Toutes les cellules ont été incubées avec le composé indiqué pendant 18 heures avant d'être irradiées avec 10 Gy. Des doses IR plus faibles n'ont pas réussi à produire une quantité suffisante de dommages à l'ADN qui permettraient des effets mesurables. Ainsi, le 10 Gy n'était pas conçu comme une perturbation cliniquement pertinente, mais plutôt comme un modèle de laboratoire pour endommager l'ADN et suivre la réparation avec ou sans la présence d'agents radioprotecteurs. Dans les cellules WT, la réparation des dommages (indiquée par le raccourcissement des comètes aux longueurs de pré-irradiation) était terminée 2,5 heures après l'irradiation, tandis que dans les cellules A-T, cela était retardé d'au moins une heure de plus (Figure 3).

Réparation retardée des cassures double brin de l'ADN dans les cellules A-T évaluées par le test des comètes neutres. Notez le retour à la ligne de base (c'est-à-dire pas de comètes) de WT à 2,5 heures. Certaines comètes sont restées à 3,5 heures pour les cellules A-T. (A) Les queues de comètes représentatives pour chaque point dans le temps, dans les cellules WT et A-T, après 10 Gy IR. (B) La quantification de la longueur de la queue de la comète pour les cellules WT (colonne blanche) et A-T (colonne grise). Chaque point de données fait référence à la moyenne d'au moins 50 comètes et les barres d'erreur représentent les erreurs standard.

Dix des onze composés ont réduit les longueurs de queue de comète d'ADN des cellules WT. Traitement avec EUK-8 (10 μM) et MnMX-2-PyP-Calbio (56 μM) a considérablement réduit la longueur de la queue de la comète 20 minutes après–IR (10 Gy) de 30% (p=1.9 휐 𢄩 ) et de 20% (p=5.7 휐) 𢄥 ), respectivement, dans les cellules WT. En utilisant des cellules AT, seuls trois composés ont réduit la longueur de la queue des comètes à 20 minutes post-IR : M40404 (20 μM) (réduction de 28 %, p=8,6휐 𢄣 ) MnTnHex-2-PyP (1 μM ) (réduction de 15 %, p=7.3휐 𢄣 ) et EUK-8 (20 μM) (réduction de 16 %, p=2,4휐 𢄤 ) ( Tableau 1 ).

Les cellules A-T présentaient des niveaux plus élevés de ROS que Wildtype et MnTnHex-2-PyP et MnMX-2-PyP-Calbio ROS induits par IR réduits

La fluorescence DCF a été utilisée pour mesurer une variété de ROS, tels que le peroxyde d'hydrogène et le radical hydroxyle (figure 4). Les cellules A-T non irradiées ont montré un niveau de base plus élevé de ROS par rapport aux cellules WT non irradiées (p = 0,001) (figure 4A). Les cellules WT irradiées ont montré une légère augmentation de la fluorescence DCF de 20 % (p = 0,02) 5 minutes après une irradiation de 10 Gy (figure 4A). Les cellules A-T n'ont montré aucune augmentation significative de la fluorescence DCF après irradiation. Les cellules WT irradiées traitées avec les imitateurs SOD n'ont montré aucune diminution significative des niveaux de ROS (figure 4B). En revanche, le traitement avec MnTnHex-2-PyP (1 μM) et MnMX-2-PyP-Calbio (56 μM) a significativement réduit les ROS dans les cellules AT irradiées de 21% (p=6.1 휐 𢄩 ) et 8% (p=2.0휐 𢄣 ), respectivement ( Figure 4C).

Niveaux de ROS dans les cellules WT et A-T en utilisant la fluorescence de la dichlorofluorescéine (DCF). Les cellules ont été incubées dans 100 μM DCF pendant 1 heure dans du PBS à 37ଌ. Les résultats moyens de 4 barres d'erreur d'expériences distinctes représentent l'erreur standard. (A) Fluorescence DCF 5 minutes après l'exposition aux rayonnements (10 Gy) des cellules WT et A-T. Les résultats ont été normalisés à ceux des cellules WT non irradiées. Notez l'augmentation de la ligne de base ROS des cellules A-T. (B) Effet des composés sur la fluorescence DCF de cellules WT irradiées (10 Gy). Les résultats ont été normalisés à ceux des cellules WT irradiées. (C) Effet des composés sur la fluorescence DCF des cellules A-T irradiées (10 Gy). Les résultats ont été normalisés à ceux des cellules WT irradiées. Notez les effets antioxydants du MnTnHex-2-PyP et du MnMX-2-PyP-Calbio.

La formation de radicaux superoxyde a été mesurée par fluorescence DHE (figure 5). Les cellules A-T ont montré une fluorescence DHE constitutive accrue par rapport aux cellules WT (p = 1휐 𢄣) (figure 5A). Nous avons noté une légère augmentation de la fluorescence DHE après irradiation dans les cellules WT (p=5 휐 𢄢). Traitement avec MnTnHex-2-PyP (1 μM) et MnMX-2-PyP-Calbio (56 μM) a réduit la fluorescence DHE après exposition aux rayonnements (10 Gy) pour les deux types de cellules (figure 5B et 5C). Dans les cellules WT irradiées, MnTnHex-2-PyP (1 μM) et MnMX-2-PyP-Calbio (56 μM) a réduit la fluorescence DHE 5 minutes après l'exposition au rayonnement de 14 % (p=1,6 휐 𢄣 ) et 69 % (p=1,4 휐 � ), respectivement . Pour les cellules A-T irradiées, MnTnHex-2-PyP (1 μM) et MnMX-2-PyP-Calbio (56 μM) a réduit la fluorescence de la DHE de 24 % (p=1,5 휐 𢄧 ) et de 47 % (p=2,2 � � ), respectivement. Étant donné que ces composés sont des imitateurs de la SOD, nous nous attendions à voir une réduction de la formation de superoxyde après le traitement du composé et cela a été observé dans les deux types de cellules. Cela contrastait avec l'absence d'effets antioxydants de ces composés sur les cellules WT lorsqu'ils étaient évalués par le DCF, qui est une sonde générale pour de multiples formes de ROS.

La formation de radicaux superoxyde a été détectée en utilisant la fluorescence du dihydroéthidium (DHE). Les résultats indiqués sont les moyennes de pour 4 expériences, les barres d'erreur représentent les erreurs standard. (A) Fluorescence DHE 5 minutes après 10 Gy dans les cellules WT et A-T. Les résultats ont été normalisés à ceux des cellules WT non irradiées. (B) Effet des composés sur la fluorescence de la DHE dans les cellules WT irradiées (10 Gy). Les résultats ont été normalisés à ceux des cellules WT non irradiées. (C) Effet du traitement des composés sur la fluorescence de la DHE dans les cellules A-T irradiées (10 Gy). Les résultats ont été normalisés à ceux des cellules A-T non irradiées. Notez les effets antioxydants pour MnTnHex-2-PyP et MnMX-2-PyP-Calbio activé les deux Cellules WT et A-T.

MnMXTraitement -2-PyP-Calbio Amélioration du taux de respiration mitochondriale des cellules A -T

Les cellules A-T présentent généralement un taux de respiration inférieur à celui des cellules WT et cela a été noté dans nos expériences (p = 3,2휐 𢄢) [46]. Lorsque les cellules A-T ont été traitées avec 56 μM MnMX-2-PyP-Calbio, la respiration mitochondriale a été améliorée (Figure 6). En fait, MnMXLes cellules A-T traitées au -2-PyP-Calbio ont montré une augmentation du métabolisme de la résazurine de 21,46 %, ce qui a rendu le profil de la résazurine des cellules A-T traitées presque identique à celui des cellules WT (p=9,7휐 𢄢). MnTnHex-2-PyP et EUK-8 ont également été testés pour des effets sur la respiration mitochondriale, nous n'avons noté aucun effet.

Respiration mitochondriale mesurée par fluorescence de la résazurine. Cellules A-T exposées au MnMX-2-Pyp-Calbio montre des signes d'amélioration de la fonction mitochondriale par rapport aux cellules A-T non traitées. Alors que les cellules A-T traitées avec MnTnHex-2-PyP ou EUK-8 n'ont montré aucun effet. Chaque expérience a été réalisée en triple. Ces résultats sont représentatifs de 2 expériences distinctes et les barres d'erreur représentent les écarts types. Notez l'amélioration de la respiration mitochondriale dans les cellules A-T à 3 heures après l'ajout de colorant résazurine.

MnMX-2-PyP-Calbio ni MnTnHex-2-PyP n'ont montré une quelconque protection contre la mort cellulaire mitotique induite par les radiations

Les cellules ont été préconditionnées avec un antioxydant porphyrinique pour les protéger en partie contre l'agression primaire du rayonnement. Deux des composés les plus protecteurs dans les autres tests, MnMX-2-PyP-Calbio et MnTnHex-2-PyP, ont été utilisés dans le test de survie des colonies (CSA) pour évaluer s'ils pouvaient ou non être utilisés pour réduire la mort cellulaire mitotique radio-induite. Ce test porte à la fois sur la viabilité d'une cellule et sa capacité à rester fonctionnellement active et à créer des colonies ou des clones. Cependant, aucune protection statistiquement significative n'a été conférée par l'un ou l'autre composé pour les cellules WT et A-T (données supplémentaires). Aucune donnée n'est indiquée pour les cellules WT traitées avec MnMX-2-PyP-Calbio puisque ce groupe de cellules n'a pas réussi à plusieurs reprises à développer suffisamment de colonies pour compter. Le manque de protection observé par le CSA n'est pas surprenant étant donné que les autres résultats observés dans les autres tests ont été notés dans les minutes à heures suivant l'exposition aux rayonnements, alors que le CSA détecte un effet à long terme. De plus, pour notre configuration CSA, les cellules n'ont été exposées aux composés indiqués que pendant 12 à 18 heures, puis placées dans un milieu frais pendant 2 semaines. Les composés n'avaient que ce laps de temps de 12 à 18 heures pour absorber le composé afin de créer un effet sur la formation de colonies à long terme. Il est possible que si les composés avaient été continuellement renouvelés au cours de la période de formation de la colonie de 2 semaines, une différence statistiquement significative aurait pu être observée. D'un autre côté, nous avons noté au contraire que le MnTnHex-2-PyP était légèrement cytotoxique pour les cellules W-T, mais aucun des composés n'était cytotoxique pour les cellules A-T (voir la figure supplémentaire 5).

En bref, nous avons identifié deux imitateurs de SOD qui ont montré des effets radioprotecteurs dans six de nos tests : MnMX-2-PyP-Calbio et MnTnHex-2-PyP. MnTnHex-2-PyP était environ 50 fois plus efficace que MnMX-2-PyP-Calbio dans l'ensemble. Tous les composés ont montré des effets bénéfiques sur la réparation générale de l'ADN observés avec le test des comètes neutres, y compris MnCl2, suggérant que ces imitateurs de SOD ont tous la capacité d'inhiber les dommages indirects à l'ADN. Bien que nos données XTT aient montré que 2 des imitateurs étaient protecteurs dans les cellules WT exclusivement, il est possible que ce test qui nécessite une décomposition mitochondriale du sel de tétrazolium ne soit pas bien adapté aux cellules AT qui ont déjà montré un taux de respiration plus lent. [46].Cette idée est soutenue par le fait que MnTnHex-2-PyP a montré une protection par XTT dans WT, mais pas dans AT, mais a montré des effets protecteurs dans les cellules AT mais pas WT dans le test Annexin V/PI, et le même composé était protecteur dans les deux types de cellules par essai de comète neutre. Des études complémentaires seront nécessaires pour clarifier le(s) rôle(s) exact(s) de l'ATM dans l'obtention de la radioprotection mesurée par nos dosages.


RÉSULTATS

Profil d'expression de la basonucline au cours de l'ovogenèse et du développement préimplantatoire

L'immunocoloration a montré que la basonucline n'était pas détectée dans les embryons à huit cellules (Q. J. Tian et H.T., non publié). Conformément à cette constatation, une étude récente sur microréseau a indiqué que l'ARNm de la basonucline était présent dans les ovocytes et les embryons à une cellule, mais que son niveau a rapidement diminué de plus de 30 fois au cours du développement préimplantatoire au stade de huit cellules, il était à des niveaux de fond ( Zeng et al., 2004). Nous avons d'abord confirmé ce profil d'expression de l'ARNm de la basonucline par RT-PCR (Fig. 1, trait interrompu), puis établi le profil d'expression de la protéine basonucline dans les ovocytes et les embryons préimplantatoires par immunoblot et immunocytochimie. L'immunotransfert a révélé une baisse apparente du niveau de basonucline de l'ovocyte immature (stade GV) aux stades matures de métaphase II (MII) (Fig. 1). Des quantités similaires de basonucline étaient présentes dans les œufs MII et les embryons à une cellule, mais aucune basonucline n'a été détectée dans les deux cellules et les morulae/blastocystes, ce qui est cohérent avec la disparition de son ARNm au cours du développement préimplantatoire. L'analyse immunocytochimique a également révélé une diminution similaire et progressive du matériel immunoréactif des ovocytes aux embryons préimplantatoires (Fig. 1). Ainsi, la basonucline maternelle n'est pas remplacée par la basonucline zygotique au cours du développement préimplantatoire et pourrait donc avoir un effet maternel.

Profil d'expression de la basonucline au cours de l'ovogenèse et du développement préimplantatoire. L'abondance relative de l'ARNm de la basonucline a été tracée à l'aide d'une échelle logarithmique et des données d'une analyse de microarray précédente (Zeng et al., 2004) (ligne continue) et PCR en temps réel (ligne interrompue). La coloration immunocytochimique des ovocytes et des embryons préimplantatoires est indiquée dans les encarts du graphique. Les pointes de flèches indiquent les positions des vésicules germinales, des pronuclei et des noyaux des stades de développement respectifs. Un immunoblot de basonucline aux stades de développement correspondants est présenté sous le graphique (75 ovocytes/embryons par voie). Stades de développement : GV, ovule germinatif à vésicule intacte, œuf arrêté en métaphase II 1C, embryon unicellulaire 2C, embryon bicellulaire M/B, morulae et blastocyste.

Profil d'expression de la basonucline au cours de l'ovogenèse et du développement préimplantatoire. L'abondance relative de l'ARNm de la basonucline a été tracée à l'aide d'une échelle logarithmique et des données d'une analyse de microarray précédente (Zeng et al., 2004) (ligne continue) et PCR en temps réel (ligne interrompue). La coloration immunocytochimique des ovocytes et des embryons préimplantatoires est indiquée dans les encarts du graphique. Les pointes de flèches indiquent les positions des vésicules germinales, des pronuclei et des noyaux des stades de développement respectifs. Un immunoblot de basonucline aux stades de développement correspondants est présenté sous le graphique (75 ovocytes/embryons par voie). Stades de développement : GV, ovule germinatif à vésicule intacte, œuf arrêté en métaphase II 1C, embryon unicellulaire 2C, embryon bicellulaire M/B, morulae et blastocyste.

Génération de souris transgéniques basonucline-ARNi

La présence de basonucline dans les ovocytes et les embryons précoces suggère qu'elle remplit : (1) la même fonction pour les ovocytes et les embryons (2) des fonctions non liées dans la maturation des ovocytes et/ou dans les embryons précoces ou (3) une fonction ovocytaire, qui est requise par les embryons (effet maternel). Pour résoudre ces possibilités, nous avons utilisé une approche d'ARNi transgénique récemment développée pour inhiber la fonction basonucline dans les ovocytes (Svoboda et al., 2001). Nous avons construit deux types de plasmides transgéniques ARNi, pB1rnai-zp3-1 et pB1rani-zp3-2 (Fig. 2A). Les détails de la génération de souris transgéniques sont décrits dans les matériaux et méthodes. Vingt-quatre souris fondatrices (13 femelles et 11 mâles) ont été obtenues, dont 14 ont été générées par pB1rnai-zp3-1 et 10 par pB1rnai-zp3-2.

Les femelles transgéniques basonucline-ARNi sont infertiles

Nous avons analysé la fertilité des femelles transgéniques fondatrices et de la descendance femelle des mâles fondateurs transgéniques (Fig. 2B). Pour réduire l'influence de la fertilité masculine sur les résultats, trois mâles normaux ont été accouplés dans une séquence randomisée avec chaque femelle testée. Huit des neuf femelles transgéniques fondatrices présentaient un large éventail de sous-fertilité - de modérée à sévère (infertile) - par rapport à la moyenne des sept congénères non transgéniques du groupe témoin (Fig. 2B). Il est peu probable que la sous-fertilité soit due à l'épine dorsale du vecteur et/ou aux sites d'intégration du transgène, car les femelles fondatrices provenaient d'injections multiples des deux constructions transgéniques. L'analyse Southern n'a également pas réussi à établir une quelconque corrélation entre les sites d'intégration et le nombre de copies du transgène avec la fertilité réduite observée (données non présentées).

La fertilité de la descendance femelle transgénique des fondateurs mâles reflétait celle des fondateurs femelles transgéniques (Fig. 2C). En dehors de la sous-fertilité femelle, les souris transgéniques mâles et femelles semblaient normales. Étant donné que les femelles transgéniques étaient sous-fertiles, nous avons utilisé des mâles transgéniques pour transmettre le transgène et avons concentré les études ultérieures sur la descendance femelle de deux lignées transgéniques, T50 et T8, qui avaient respectivement ∼ 10 % et 50 % de fertilité normale. A ce jour, le phénotype de sous-fertilité femelle de ces lignées est resté stable après deux générations d'élevage.

Les ovocytes transgéniques contiennent des quantités réduites d'ARNm et de protéines de basonucline

Nous avons examiné des ovocytes transgéniques complètement développés pour l'ARNm et la protéine de la basonucline afin de déterminer l'effet cumulatif de l'ARNi pendant la phase de croissance. La PCR en temps réel a démontré que la quantité d'ARNm de basonucline dans les ovocytes transgéniques des deux lignées était considérablement réduite. Pour les ovocytes T8 et T50, respectivement, 4 et 6 cycles supplémentaires ont été nécessaires pour atteindre le seuil, par rapport aux homologues non transgéniques (Fig. 2D). Cette augmentation du nombre de cycles se traduit par une réduction de 94% et 98% de l'ARNm de la basonucline. En effet, des examens immunocytochimiques (Fig. 2F) et western blot (Fig. 2G) ont confirmé la diminution spectaculaire de la teneur en protéine basonucline dans ces ovocytes transgéniques. Ces tests, cependant, n'ont pas réussi à distinguer la petite différence dans les niveaux de protéine basonucline sévèrement réduits des deux lignées transgéniques. En théorie, la nature exponentielle de la méthode RT-PCR est plus sensible dans la détection de la faible variation entre les très faibles niveaux de basonucline, qui étaient inférieurs au niveau de détection de l'immunocytochimie et du western blot. Notamment, la petite différence dans les niveaux d'ARNm a semblé produire un effet sur la fertilité dans les lignées T8 et T50, qui étaient respectivement de 50% et 90% (Fig. 2E) et en corrélation avec la réduction de 94% et 98% de la teneur en ARNm de la basonucline .

Transgène basonucline-ARNi et son effet sur la fertilité féminine, les niveaux d'ARNm et de protéines de basonucline dans les ovocytes. (UNE) Structures des deux constructions transgéniques avec différents squelettes de vecteur, séquences d'épissage et séquences d'ADNc de basonucline. Les coordonnées nucléotidiques de l'ADNc de la basonucline de souris sont indiquées au-dessus d'une copie des répétitions inversées (flèches noires).(B,C) La fertilité des femelles transgéniques ARNi a été déduite par la taille moyenne de la portée. Des femelles transgéniques (fondateur, B, ou descendance croisée des mâles fondateurs, C) ont été accouplées avec trois mâles normaux dans une séquence randomisée. (B) Les données sont basées sur trois accouplements pour chaque fondateur transgénique, et le contrôle (non-TG) est la taille moyenne de la portée des sept femelles non transgéniques. (C) Le numéro d'accouplement/grossesse (n) est indiqué au-dessus de chaque barre. * P<0.001. L'ARNm de la basonucline a été renversé dans les ovocytes transgéniques au stade GV, comme le montrent la PCR en temps réel (D), l'immunocytochimie (F) et l'immunotransfert (G). () L'ARNm du facteur de liaison en amont (UBF), un facteur de transcription Pol I omniprésent, a été utilisé comme contrôle. (E) Les données de PCR en temps réel ont été converties en pourcentage de niveau d'ARNm de basonucline de type sauvage et tracées par rapport aux données de fertilité de C. (F) Les ovocytes ont été colorés avec des anticorps anti-basonucline (rouge) et DAPI (bleu), et les deux images sont superposées pour indiquer la position de la vésicule germinale dans les ovocytes transgéniques. Barre d'échelle : 10μm. (g) Deux échantillons en double ont été analysés pour chaque lignée transgénique. Chaque piste contient des protéines extraites de 50 ovocytes. Après avoir sondé la basonucline, la membrane a été retirée et re-sondée avec un anticorps contre la β-tubuline. TG, ovocytes transgéniques non TG, ovocytes non transgéniques.

Transgène basonucline-ARNi et son effet sur la fertilité féminine, les niveaux d'ARNm et de protéines de basonucline dans les ovocytes. (UNE) Structures des deux constructions transgéniques avec différents squelettes de vecteur, séquences d'épissage et séquences d'ADNc de basonucline. Les coordonnées nucléotidiques de l'ADNc de la basonucline de souris sont indiquées au-dessus d'une copie des répétitions inversées (flèches noires).(B,C) La fertilité des femelles transgéniques ARNi a été déduite par la taille moyenne de la portée. Des femelles transgéniques (fondateur, B, ou descendance croisée des mâles fondateurs, C) ont été accouplées avec trois mâles normaux dans une séquence randomisée. (B) Les données sont basées sur trois accouplements pour chaque fondateur transgénique, et le contrôle (non-TG) est la taille moyenne de la portée des sept femelles non transgéniques. (C) Le numéro d'accouplement/grossesse (n) est indiqué au-dessus de chaque barre. * P<0.001. L'ARNm de la basonucline a été renversé dans les ovocytes transgéniques au stade GV, comme le montrent la PCR en temps réel (D), l'immunocytochimie (F) et l'immunotransfert (G). () L'ARNm du facteur de liaison en amont (UBF), un facteur de transcription Pol I omniprésent, a été utilisé comme contrôle. (E) Les données de PCR en temps réel ont été converties en pourcentage de niveau d'ARNm de basonucline de type sauvage et tracées par rapport aux données de fertilité de C. (F) Les ovocytes ont été colorés avec des anticorps anti-basonucline (rouge) et DAPI (bleu), et les deux images sont superposées pour indiquer la position de la vésicule germinale dans les ovocytes transgéniques. Barre d'échelle : 10μm. (g) Deux échantillons en double ont été analysés pour chaque lignée transgénique. Chaque piste contient des protéines extraites de 50 ovocytes. Après avoir sondé la basonucline, la membrane a été retirée et re-sondée avec un anticorps contre la β-tubuline. TG, ovocytes transgéniques non TG, ovocytes non transgéniques.

Notre analyse a également montré une spécificité de ciblage élevée de l'approche ARNi transgénique dans les ovocytes, en accord avec les rapports précédents (Stein et al., 2003 Fedoriw et al., 2004 Yu et al., 2004). Dans les ovocytes transgéniques, aucun changement détectable n'a été observé dans la quantité d'ARNm pour l'UBF, un facteur de transcription ubiquitaire spécifique de Pol I (Fig. 2D). De plus, nous n'avons observé aucune différence dans l'abondance de l'ARNm de la basonucline 2, qui est un homologue étroitement apparenté et partage plus de 57 % de la séquence nucléotidique avec la basonucline (Romano et al., 2004 Vanhoutteghem et Djian, 2004). Cette spécificité de ciblage élevée est cohérente avec un rapport précédent selon lequel l'ARNi transgénique ciblant l'ovocyte Msy2 L'ARNm n'a aucun effet sur l'abondance des espèces étroitement apparentées Msy4 transcription (Yu et al., 2004). Ces résultats démontrent l'efficacité et la spécificité de l'approche ARNi transgénique. Ainsi, comme prévu, la perturbation de la fonction basonucline dans les ovocytes réduit la fertilité (Tian et al., 2001).

Augmentation de l'échec du développement des ovocytes dans les ovocytes déficients en basonucline

Pour caractériser la cause du phénotype de la sous-fertilité, nous avons d'abord examiné l'histologie des ovaires transgéniques. Par rapport au témoin (Fig. 3A, B), les coupes histologiques ont révélé des changements clairs dans les structures folliculaires dans les ovaires transgéniques adultes (Fig. 3C, D), qui semblaient normaux en taille et en poids. Bien que le nombre de follicules n'ait pas semblé affecté, certains follicules présentaient des morphologies anormales, qui pourraient être classées en deux catégories distinctes. Dans la première catégorie, les follicules étaient invariablement gros et les ovocytes contenaient des vésicules ou cavités cytoplasmiques (Fig. 3C, D, flèches), ce qui n'était pas observé dans les ovaires non transgéniques (Fig. 3A, B). Dans la deuxième catégorie, les follicules étaient petits et de forme irrégulière, et les ovocytes étaient apparemment dégradés et absorbés (figure 3C, pointes de flèche D). De plus, les cellules du cumulus en contact avec l'ovocyte en dégénérescence présentaient des nucléoles agrandis, qui étaient intensément colorés par l'hématoxyline (Fig. 3C, D). Les ovaires transgéniques contenaient des corps jaunes, suggérant qu'une ovulation s'était produite. Cependant, par rapport à l'ovaire non transgénique (Fig. 3A, B), les corps jaunes transgéniques contenaient plus de cellules, ce qui les faisait apparaître plus sombres en raison de la coloration nucléaire à l'hématoxyline (Fig. 3C, D). La morphologie ovarienne a suggéré une hétérogénéité dans la population d'ovocytes transgéniques, certains ovocytes ont échoué, tandis que d'autres ont réussi à atteindre la maturité.

Le transgène basonucline-ARNi a affecté la morphologie des ovaires et des ovocytes. Histologie des non transgéniques (UNE,B) et T50 transgénique (C,) les ovaires sont montrés à deux grossissements : l'ovaire entier (A,C) et une région agrandie (B,D). Les flèches indiquent les follicules qui contiennent des ovocytes anormaux. Les pointes de flèches indiquent les restes de follicules en dégénérescence. Les follicules et les ovocytes sont apparemment normaux dans l'ovaire transgénique (*). cl, corps jaune. Les ovocytes au stade GV ont été isolés et observés en contraste de phase (E,F) et le contraste interférentiel différentiel (DIC) (g,H) microscopie. Les ovocytes non transgéniques sont présentés dans E, G et les ovocytes transgéniques dans F, H. Les pointes de flèches indiquent des exemples de granules sombres dans le cytoplasme transgénique (F) et les bosses sur la surface des cellules transgéniques (H). La population transgénique est hétérogène : des ovocytes morphologiquement normaux et anormaux sont présents. Barres d'échelle : 50 m dans E 10 m dans H.

Le transgène basonucline-ARNi a affecté la morphologie des ovaires et des ovocytes. Histologie des non transgéniques (UNE,B) et T50 transgénique (C,) les ovaires sont montrés à deux grossissements : l'ovaire entier (A,C) et une région agrandie (B,D). Les flèches indiquent les follicules qui contiennent des ovocytes anormaux. Les pointes de flèches indiquent les restes de follicules en dégénérescence. Les follicules et les ovocytes sont apparemment normaux dans l'ovaire transgénique (*). cl, corps jaune. Les ovocytes au stade GV ont été isolés et observés en contraste de phase (E,F) et le contraste interférentiel différentiel (DIC) (g,H) microscopie. Les ovocytes non transgéniques sont présentés dans E, G et les ovocytes transgéniques dans F, H. Les pointes de flèches indiquent des exemples de granules sombres dans le cytoplasme transgénique (F) et les bosses sur la surface des cellules transgéniques (H). La population transgénique est hétérogène : des ovocytes morphologiquement normaux et anormaux sont présents. Barres d'échelle : 50 m dans E 10 m dans H.

Maturation des ovocytes déficients en basonucline

Pour caractériser le défaut des ovocytes déficients en basonucline, des ovocytes GV intacts ont été isolés et observés en culture. Les ovocytes isolés appartenaient très probablement à la sous-population qui a survécu au déficit en basonucline pendant la phase de croissance. Une différence frappante entre les ovocytes intacts GV non transgéniques et transgéniques était que ∼ 60 % de ces derniers avaient un cytoplasme sombre, granuleux et même opaque (Fig. 3F, la tête de flèche montre un exemple). Ce changement cytoplasmique s'accompagnait d'une rugosité de la surface de l'ovocyte, comme l'a révélé la microscopie à contraste d'interférence différentiel (DIC) (Fig. 3G, H, pointe de flèche). Pour vérifier si les ovocytes à morphologie altérée différaient dans leur capacité à mûrir, des ovocytes transgéniques intacts GV ont été isolés et divisés en deux groupes en fonction de leur transparence cytoplasmique (transparent et opaque clair et foncé) et cultivés in vitro. Étonnamment, les deux ovocytes transgéniques intacts à GV avec un cytoplasme clair ou foncé ont atteint le MII, comme en témoigne l'émission du premier corps polaire, à une incidence similaire à celle des témoins non transgéniques (tableau 1). Ces observations suggèrent fortement que les changements cytoplasmiques et de surface cellulaire n'interfèrent pas avec la maturation de cette sous-population. Cette conclusion a été confirmée lorsque les nombres d'œufs MII isolés à partir de souris transgéniques amorcées par PMSG/hCG se sont avérés être les mêmes par rapport aux témoins (tableau 1).

Propriétés des ovocytes et embryons transgéniques basonucline-ARNi

. Non transgénique. Transgénique (T50) . P valeur .
Ovulation(m=3) * 27.5±3.3 26.1±2.4 0.70
Maturation nucléaire (%)(m=3) †
GVBD 88.5±6.7 93.0±1.2 0.58
MII 57.9±10.3 61.5±6.3 0.79
Synthèse des protéines(m=3) ‡ 5012±155 4846±224 0.53
Diamètre max des pronuclei mâles (unités arbitraires à 12 hpc) § 3.63±0.06 (m=37) 2.95±0.12 (m=34) <0.001
Polyspermie pénétrée à 12 hpc(%) ¶ 2.8±2.8 (m=37) 41.1±12.5 (m=36) 0.04
. Non transgénique. Transgénique (T50) . P valeur .
Ovulation(m=3) * 27.5±3.3 26.1±2.4 0.70
Maturation nucléaire (%)(m=3) †
GVBD 88.5±6.7 93.0±1.2 0.58
MII 57.9±10.3 61.5±6.3 0.79
Synthèse des protéines(m=3) ‡ 5012±155 4846±224 0.53
Diamètre max des pronuclei mâles (unités arbitraires à 12 hpc) § 3.63±0.06 (m=37) 2.95±0.12 (m=34) <0.001
Polyspermie pénétrée à 12 hpc(%) ¶ 2.8±2.8 (m=37) 41.1±12.5 (m=36) 0.04

Le nombre moyen d'ovocytes matures isolés des oviductes de trois souris après super-ovulation

Pourcentage d'ovocytes cultivés à un stade de maturation particulier

Incorporation de la méthionine [ 35 S] précipitable à l'acide (cpm/ovocyte) d'ovocytes intacts à GV isolés de souris de 6 semaines

La moyenne de trois séries de 12 embryons hpc : deux observées avec épi-fluorescence et une avec confocal. Les pronoyaux colorés au DAPI ont été mesurés à leur diamètre maximal. m est le nombre total d'embryons analysés

Les poly-pronuclei ont été utilisés comme indicateur pour évaluer la polyspermie. Les moyennes de trois ensembles d'embryons sont indiquées. m est le nombre total d'embryons analysés

La transcription médiée par Pol I est altérée dans les ovocytes déficients en basonucline

En raison du rôle suspecté de la basonucline dans la transcription de l'ARNr, nous avons utilisé un test avec BrUTP pour évaluer la transcription de Pol I dans des ovocytes en croissance déficients en basonucline, qui étaient transcriptionnellement actifs (Fig. 4), comme le montre l'incorporation de BrdU dans les deux nucléoplasmes. et nucléole (Fig. 4A, B). En présence d'une concentration élevée de -amanitine, l'incorporation de BrU dans le nucléoplasme a été abolie, suggérant que la transcription de Pol II a été inhibée (Fig. 4C,D). Dans ces conditions, l'intensité de fluorescence dans les ovocytes déficients en basonucline a été réduite de ∼38% (Fig. 4E). Le nombre de foyers de transcription était également réduit, où la fluorescence est plus brillante que d'autres régions du nucléole, suggérant une incorporation intensive de BrUTP, c'est-à-dire un site de transcription Pol I. Étant donné que l'ADNr est un gène multicopie, ces foyers représentent probablement les copies d'ADNr qui sont activement transcrites lors du marquage continu. La notation du nombre de loci de transcription en sectionnant optiquement le nucléole (Fig. 4F, G) a indiqué que le nombre de foyers était réduit de ∼ 25 % dans les ovocytes transgéniques T50 par rapport aux témoins (P<0.001) (Fig. 4H). Néanmoins, nous n'avons détecté ni un changement significatif du niveau d'ARNr 28S et 18S matures par un test de protection contre la RNase (données non présentées), ni un changement apparent du taux de synthèse des protéines dans les ovocytes transgéniques en croissance et entièrement développés (tableau 1).

Transcription de Pol II perturbée dans les ovocytes déficients en basonucline

En raison du potentiel de la basonucline en tant que régulateur de la transcription Pol II, nous avons étudié l'effet de la déficience en basonucline sur la transcription Pol II en analysant le modèle global d'expression génique dans des ovocytes entièrement développés et intacts GV par analyse de puces à ADN. Après une période active de transcription au cours des deux premiers tiers de la croissance de l'ovocyte, la transcription diminue de telle sorte que l'ovocyte complètement développé est essentiellement transcriptionnellement quiescent, ce qui le reste pendant la maturation de l'ovocyte jusqu'à ce que l'expression du gène zygotique s'initie dans l'embryon unicellulaire tardif (Hamatani et al., 2004 Zeng et Schultz, 2005). Par conséquent, la composition de l'ARNm au stade GV-intact reflète non seulement l'effet cumulatif de la transcription Pol II pendant la croissance des ovocytes, mais est également la source de l'ARNm au début de la maturation des ovocytes et peut donc avoir des incidences importantes sur le développement embryonnaire précoce.

Les ARN des ovocytes de quatre souris non transgéniques et de six souris transgéniques ont été analysés individuellement sur des puces à gènes Affymetrix MOE 430 2.0, qui contiennent plus de 34 000 transcrits. Les données résultantes des puces à ADN avaient une forte tendance à se regrouper au sein des groupes témoins et transgéniques (Fig. 5A), par rapport à une liste de gènes non biaisée. Il y avait 772 et 253 gènes, dont les niveaux d'ARNm étaient respectivement régulés à la hausse ou à la baisse de plus de deux fois. Comme prévu, le niveau d'ARNm de la basonucline a été réduit de 210 fois, la plus grande amplitude de changement parmi les gènes régulés à la hausse et à la baisse, le niveau d'ARNm de la basonucline 2 associée n'a pas été affecté. Une analyse EASE (Hosack et al., 2003) (Fig. 5B) a montré que les gènes dont l'expression était régulée positivement appartenaient à quatre processus : la transcription et la liaison à l'ADN (39,1 %), le développement (17,5 %), la jonction intercellulaire/ l'espace extracellulaire (11,3 %) et la liaison aux ions métalliques (6,5 %), tandis que les gènes régulés négativement plus de deux fois étaient principalement liés à la motilité/adhésion cellulaire (37,8 %), au transport intracellulaire (30,0 %) et à la liaison aux protéines (17,8 %). Bien qu'il reste à voir comment ces perturbations de l'expression des gènes ont contribué au phénotype, il est clair que : (1) notre approche ARNi était efficace et hautement spécifique (2) les transcrits Pol II étaient manifestement affectés par une déficience en basonucline et (3) une partie de la régulation positive du transcrit était probablement une réponse secondaire au déficit en basonucline (voir aussi Discussion). De plus, ces résultats soutiennent la proposition selon laquelle la basonucline régule la transcription de Pol II, en plus de sa fonction de régulateur de transcription de Pol I.

La transcription de Pol I est réduite dans les ovocytes transgéniques basonucline-ARNi. Des essais de run-on ont été effectués sur des ovocytes en croissance (14 jours) à partir du contrôle (A,C,F) et de la lignée T50 (B,D,G) en l'absence (UNE,B) et présence (C,) de 100 µg/ml d'-amanitine. Le BrdU incorporé a été visualisé par un anticorps anti-BrdU marqué AlexFluor-488. La coloration du nucléoplasme est indiquée par des pointes de flèche et celle du nucléole par des flèches. L'intensité de fluorescence du nucléole dans le run-on avec la α-amanitine a été mesurée à partir de micrographies avec ImageJ (non-T, m=14 T50, m=10), et la moyenne en unités arbitraires est affichée (E). Les nucléoles de 20 ovocytes de chaque groupe ont été sectionnés optiquement (F, contrôle non T g, T50), et les foyers de transcription (taches marquées de manière claire) ont été notés. Le nombre moyen de foyers par ovocyte est indiqué (H). * P<0.05 ** P<0.001.

La transcription de Pol I est réduite dans les ovocytes transgéniques basonucline-ARNi. Des essais de run-on ont été effectués sur des ovocytes en croissance (14 jours) à partir du contrôle (A,C,F) et de la lignée T50 (B,D,G) en l'absence (UNE,B) et présence (C,) de 100 µg/ml d'-amanitine. Le BrdU incorporé a été visualisé par un anticorps anti-BrdU marqué AlexFluor-488. La coloration du nucléoplasme est indiquée par des pointes de flèche et celle du nucléole par des flèches. L'intensité de fluorescence du nucléole dans le run-on avec la α-amanitine a été mesurée à partir de micrographies avec ImageJ (non-T, m=14 T50, m=10), et la moyenne en unités arbitraires est affichée (E). Les nucléoles de 20 ovocytes de chaque groupe ont été sectionnés optiquement (F, contrôle non T g, T50), et les foyers de transcription (taches marquées de manière claire) ont été notés. Le nombre moyen de foyers par ovocyte est indiqué (H). * P<0.05 ** P<0.001.

Analyse par microarray d'ovocytes déficients en basonucline. Les ARN d'ovocytes de quatre souris non transgéniques et de six souris transgéniques ont été analysés à l'aide d'Affymetrix Mouse Genome GeneChip MOE 430 v2. Les données brutes des puces à ADN ont été traitées par le programme GC-RMA ou MAS 5 et analysées avec les logiciels SAM, GeneSpring et EASE. (UNE) Une analyse de regroupement d'échantillons a montré un degré élevé d'association au sein des groupes témoins et transgéniques. (B) L'analyse des voies a regroupé les gènes régulés à la hausse en quatre processus et celle des gènes régulés à la baisse en trois. Le pourcentage de chaque groupe dans la catégorie régulée à la hausse ou à la baisse est indiqué par la longueur de la barre (noir pour régulé à la hausse et blanc pour régulé à la baisse).

Analyse par microarray d'ovocytes déficients en basonucline. Les ARN d'ovocytes de quatre souris non transgéniques et de six souris transgéniques ont été analysés à l'aide d'Affymetrix Mouse Genome GeneChip MOE 430 v2. Les données brutes des puces à ADN ont été traitées par le programme GC-RMA ou MAS 5 et analysées avec les logiciels SAM, GeneSpring et EASE. (UNE) Une analyse de regroupement d'échantillons a montré un degré élevé d'association au sein des groupes témoins et transgéniques. (B) L'analyse des voies a regroupé les gènes régulés à la hausse en quatre processus et celle des gènes régulés à la baisse en trois. Le pourcentage de chaque groupe dans la catégorie régulée à la hausse ou à la baisse est indiqué par la longueur de la barre (noir pour régulé à la hausse et blanc pour régulé à la baisse).

Les ovocytes déficients en basonucline entraînent un échec embryonnaire précoce

Notre analyse d'ovocytes isolés a suggéré que la sous-fertilité s'est produite après la maturation des ovocytes et l'ovulation. En conséquence, nous avons examiné la capacité des ovocytes transgéniques à être fécondés et à soutenir le développement préimplantatoire. Des œufs fertilisés transgéniques et témoins ont été collectés à ∼10 hpc, cultivés et notés pour les stades de développement à 36, 60 et 84 hpc. La progression du développement des embryons transgéniques était clairement retardée ou arrêtée (Fig. 6A). À 36 hpc, pratiquement tous les embryons non transgéniques ont atteint le stade de deux cellules, alors que seulement 75 % et 40 % des embryons T8 et T50, respectivement, l'ont atteint (figure 6B). À ce stade, 60 % des embryons T50 étaient au stade unicellulaire et, au cours des 48 heures suivantes, peu d'entre eux se sont clivés et ont dépassé le stade de deux cellules. Dans l'ensemble, très peu d'embryons T50 pourraient se développer au-delà du stade à deux cellules (Fig. 6A, B). Bien que le développement des embryons T8 ait été meilleur, ∼ 60 % d'entre eux ont atteint le stade de blastocyste, le taux de développement était néanmoins plus lent que celui des témoins. Une fois que les embryons transgéniques T8 ont atteint le stade de huit cellules, lorsqu'un nombre croissant de gènes zygotiques sont activés (Hamatani et al., 2004 Wang et al., 2004 Zeng et al., 2004), ils se sont rapidement développés jusqu'au stade de blastocyste sans perte supplémentaire (Fig. 6B). Nous avons noté que, globalement, à la fin de cette période de culture (84 hpc ou 3,5 jours), 63 ± 11 % et 10 ± 3 % des embryons T8 et T50, respectivement, se sont développés au-delà des stades de quatre à huit cellules, ce qui pourrait expliquer la fertilité de ces deux lignées transgéniques (respectivement 53 % et 10 %). Ainsi, l'échec embryonnaire précoce a causé la sous-fertilité des femelles transgéniques.

Étant donné que la plupart des pertes d'embryons se sont produites au cours des stades à une et deux cellules, nous nous sommes concentrés sur le développement pendant cette période. Nous avons d'abord évalué si l'activation du génome, qui est nécessaire pour le développement au-delà du stade bicellulaire, se produisait dans des embryons bicellulaires déficients en basonucline (Schultz, 2002). L'activation du génome, évaluée par l'expression du complexe nécessitant une transcription (TRC), un ensemble de protéines structurellement apparentées qui sont des marqueurs acceptés de l'activation du génome (Conover et al., 1991), s'est produite dans les embryons transgéniques dans la même mesure que dans commandes (Fig. 7M). Ainsi, il est peu probable que l'échec d'activation du génome embryonnaire ait été à la base de l'échec du développement et nous avons donc examiné les périodes antérieures. Nous avons noté une variété d'anomalies dans les embryons transgéniques à une cellule. Tout d'abord, et rappelant les ovocytes transgéniques (Fig. 4G), les embryons monocellulaires transgéniques sont apparus « rugueux » sous l'optique de Normaski (Fig. 7A-D). La morphologie nucléaire des embryons transgéniques a également été modifiée de manière plus notable, les pronuclei mâles avaient un diamètre de 18,7% plus petit que celui du contrôle (Fig. 7E-H, Tableau 1), suggérant un échec de la décondensation de la chromatine. La distribution de la chromatine/ADN entourant le nucléole dans les pronoyaux transgéniques différait également clairement de celle des témoins (Fig. 7Farrow). Le défaut le plus frappant, cependant, était la fragmentation de la chromatine, considérée comme des morceaux supplémentaires de matériaux DAPI positifs, ainsi que les pronuclei diminutifs (Fig. 7G, H, J). La polyspermie pourrait être une source de chromatine supplémentaire, car la fréquence des poly-pronuclei observés dans les embryons monocellulaires transgéniques (12 hpc) a plus que décuplé (tableau 1). Une autre cause de fragmentation de l'ADN était probablement due au stress sur la ségrégation de la chromatine pendant la division mitotique, ce qui a conduit à une distribution inégale de l'ADN entre les cellules filles (Fig. 7K, L). La fragmentation du cytoplasme était tout aussi fréquente que la fragmentation nucléaire (Fig. 7L). Il n'y avait, cependant, aucun défaut commun unique observé dans les embryons transgéniques. Malgré ces échecs, la voie apoptotique n'a pas été activée lorsqu'elle a été testée par TUNEL (non montré). Il est très probable que cette gamme d'anomalies sous-tend la compétence développementale réduite des embryons dérivés d'ovocytes déficients en basonucline et, en particulier, la régulation du cycle cellulaire. Conformément à cela, dans les embryons monocellulaires transgéniques, notre résultat a indiqué une réduction ou un blocage de la réplication de l'ADN (Fig. 7M), qui, dans les embryons non transgéniques, a été observée entre 8 et 16 heures après la fécondation, comme indiqué précédemment (Moore et al., 1996).

Développement préimplantatoire d'embryons transgéniques basonucline-ARNi.Les œufs fécondés in vivo ont été collectés et cultivés in vitro pendant 84 heures (3,5 jours). (UNE) Le développement des embryons transgéniques (T50) a été arrêté au stade de deux cellules. (B) À 36, 60 et 84 heures après le coït, les stades de développement des embryons ont été notés et exprimés en pourcentage (± s.d.) de la population. Les données sont la moyenne de trois expériences, dans lesquelles un total de 40 à 60 embryons pour chaque lignée transgénique ont été notés. La catégorie des morts comprend les embryons effondrés, dégénérés ou fragmentés 1C, une cellule, 2C, deux cellules (etc.) M/B, morula/blastocyste.

Développement préimplantatoire d'embryons transgéniques basonucline-ARNi.Les œufs fécondés in vivo ont été collectés et cultivés in vitro pendant 84 heures (3,5 jours). (UNE) Le développement des embryons transgéniques (T50) a été arrêté au stade de deux cellules. (B) À 36, 60 et 84 heures après le coït, les stades de développement des embryons ont été notés et exprimés en pourcentage (± s.d.) de la population. Les données sont la moyenne de trois expériences, dans lesquelles un total de 40 à 60 embryons pour chaque lignée transgénique ont été notés. La catégorie des morts comprend les embryons effondrés, dégénérés ou fragmentés 1C, une cellule, 2C, deux cellules (etc.) M/B, morula/blastocyste.


Rôles polyvalents des protéines MEIS dans la maladie

Les gènes MEIS ont également des fonctions importantes dans les maladies congénitales (Encadré 2), les leucémies et les cancers solides. En effet, Meis1, le membre fondateur de la famille, a été découvert lorsque son locus génique a été identifié pour la première fois comme un site d'intégration virale néoplasique dans un modèle murin de leucémie myéloïde aiguë (LAM), et MEIS1 la dérégulation a ensuite été reconnue comme un moteur essentiel de la progression de la maladie dans plusieurs types de leucémie humaine (Imamura et al., 2002 Kawagoe et al., 1999 Moskow et al., 1995 Nakamura et al., 1996 Rozovskaia et al., 2001). En particulier, dans la leucémie avec réarrangements du gène MLL [aberrations chromosomiques, y compris l'histone méthyltransférase KMT2A (« leucémie à lignée mixte »), représentant des formes agressives de la maladie], de nombreuses preuves publiées soutiennent un rôle de promotion tumorale pour les protéines de la famille MEIS, ce a fait l'objet d'un examen approfondi (Argiropoulos et al., 2007 Collins et Hess, 2016a,b Eklund, 2011). Les rapports sur la contribution des gènes MEIS aux tumeurs solides, en revanche, sont pour la plupart fortuits. Aggravant cette situation, l'expression du même gène MEIS peut être élevée dans certains types de cancer, mais diminuée dans d'autres. Même au sein d'une entité tumorale, des rôles présumés oncogènes et suppresseurs de tumeurs ont été attribués au même facteur de transcription MEIS (tableau 2).

MEIS1 La mutation est un facteur de risque important du syndrome des jambes sans repos (SJSR), une affection neurologique caractérisée par des sensations douloureuses nocturnes et avec une composante neuro-développementale (Hammerschlag et al., 2017 Lane et al., 2017 Schormair et al., 2017 Spieler et al., 2014 Winkelmann et al., 2007). Supplémentaire MEIS1 des mutations ont été liées à la fibrillation auriculaire, tandis que des mutations dans le MEIS2 gène impliquent des anomalies cardiaques, une dysmorphie faciale et une déficience intellectuelle (Crowley et al., 2010 Douglas et al., 2018 Erdogan et al., 2007 Fujita et al., 2016 Giliberti et al., 2019 Johansson et al., 2014 Louw et al. ., 2015 Pfeufer et al., 2010). Ainsi, les malformations congénitales humaines associées aux mutations MEIS reflètent l'expression développementale de MOI, CE EST membres de la famille dans le cœur, le cerveau et la crête neurale (Frank et Schulte, 2014 Maeda et al., 2001 Stankunas et al., 2008 Toresson et al., 2000).

Aperçu de la littérature sur les gènes MEIS dans le cancer solide chez l'homme


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