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15 : Production de protéines - Biologie

15 : Production de protéines - Biologie



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  • 15.1 : Présentation
    La technologie de l'ADN recombinant a de nombreuses utilisations dans la recherche scientifique fondamentale pour mieux comprendre la nature des êtres vivants. En tant qu'outil, la technologie de l'ADN recombinant peut être utilisée pour exprimer des protéines en vue d'applications médicales. Avant les biotechnologies, le diabète de type I (insulinodépendant) était traité par injection d'insuline isolée du pancréas de porc. Avec la capacité d'exprimer des protéines humaines à l'intérieur de bactéries, de levures et d'autres cellules, il n'est plus nécessaire de sacrifier des porcs pour de l'insuline porcine.
  • 15.2 : Purification des protéines (activité)
    Cet exercice vise à purifier la protéine fluorescente verte (GFP) ou la protéine fluorescente bleue (BFP) du lysat bactérien. Ces protéines ont une taille spécifique de 238 acides aminés et sont de 40 000 daltons (40 kD). En fonction de leur taille spécifique, ils auront un taux de migration spécifique à travers la résine d'exclusion de taille. N'oubliez pas que le lysat bactérien est plein de protéines supplémentaires qui ne sont pas votre protéine d'intérêt que nous essayons d'isoler.

Production de protéines

La technologie de l'ADN recombinant a de nombreuses utilisations dans la recherche scientifique fondamentale pour mieux comprendre la nature des êtres vivants. En tant qu'outil, la technologie de l'ADN recombinant peut être utilisée pour exprimer des protéines en vue d'applications médicales. Avant les biotechnologies, le diabète de type I (insulinodépendant) était traité par injection d'insuline isolée du pancréas de porc. Avec la capacité d'exprimer des protéines humaines à l'intérieur de bactéries, de levures et d'autres cellules, il n'est plus nécessaire de sacrifier des porcs pour de l'insuline porcine.

Vecteur d'expression bactérien pGEX-3X contient le gène AmpR, origine de réplication, le MCS en aval du promoteur hybride lac/trp (tac) et la séquence codante pour la glutathion-S-transférase (GST). GST agit comme un marqueur qui est fusionné directement avec la protéine du gène d'intérêt et utilisé pour purifier la protéine avec une résine de glutathion.

Critères de choix d'un système d'expression


Les systèmes d'expression de protéines ont des avantages et des inconvénients inhérents. Le tableau ci-dessus résume la comparaison des différents systèmes cellulaires de production (Fernandez & Hoeffler, 1999).

Bioréacteur ou fermenteur utilisé pour cultiver de grandes quantités de bactéries pour la production de protéines. Crédit : Miropiro CC-BY-SA 3.0)


Plateforme d'expression et de purification des protéines

Pour accélérer la production de protéines, nous avons adopté une stratégie d'expression parallèle d'une protéine à partir d'une variété de vecteurs contenant différents marqueurs et/ou partenaires de fusion, et une variété de souches hôtes E. coli. Cette approche devrait non seulement nous faire gagner beaucoup de temps mais aussi aboutir à un plus grand nombre de protéines exprimées avec succès.

La stratégie d'expression comprend les deux séries d'expériences suivantes :

1. L'expression d'une protéine dans une souche hôte E. coli basique à partir d'une variété de vecteurs avec différents marqueurs et/ou partenaires de fusion.

Notre premier criblage consiste à exprimer une protéine dans BL21 (DE3) à partir de vecteurs pET modifiés avec une sélection de balises et de partenaires de fusion :

Étiqueter partenaire de fusion
N-terminal His6-étiqueter
N-terminal His6-étiqueter thiorédoxine
N-terminal His6-étiqueter glutathion-S-transférase (TPS)
N-terminal His6-étiqueter protéine de liaison au maltose (MBP)
N-terminal His6-étiqueter disulfure oxydoréductase (DsbA)
N-terminal His6-étiqueter NusA
C-terminal His6-étiqueter

2. L'expression d'une protéine à partir d'un vecteur standard dans un certain nombre de E. coli souches hôtes.

Le choix des souches hôtes dépend davantage de la nature de la protéine hétérologue. Les considérations suivantes doivent être faites :

  • Si la protéine contient un nombre élevé de rare E. coli codons, il vaut la peine d'essayer de l'exprimer dans une souche qui co-exprime les ARNt de ces rares codons. Il existe plusieurs souches disponibles dans le commerce :
  • Si la protéine contient un ou plusieurs Liaisons disulfure, un bon repliement est stimulé dans la souche hôte avec un environnement cytoplasmique plus oxydant. Deux souches sont disponibles dans le commerce auprès de Novagen :

  • Si la protéine est toxique à la cellule, expression dans une souche contenant le pLyS ou pLysE vector renforce la régulation des systèmes d'expression en utilisant le Promoteur T7. Ces vecteurs expriment le lysozyme, qui se lie à l'ARN polymérase T7 et l'inactive. Les souches sont disponibles dans le commerce auprès de différents fabricants.

Notre premier criblage consiste à exprimer une protéine à partir d'un vecteur pET modifié avec un N-terminal His6-étiqueter dans les souches hôtes suivantes :

Souche hôte
BL21 (DE3)
BL21 (DE3) pLyse
BL21 (DE3) CodonPlus-RIL (-RP) ou Rosetta (DE3)
Origamis (DE3)

Pour le criblage rapide des niveaux d'expression et de la solubilité des protéines à partir des différents vecteurs et dans les différentes souches, nous avons développé une méthode à petite échelle utilisant la chromatographie sur billes magnétiques.

Les résultats du premier criblage seront un point de départ pour d'autres expériences au cas où aucune condition d'expression satisfaisante n'aurait été trouvée. Comment optimiser les niveaux d'expression, améliorer la solubilité des protéines, améliorer la stabilité des protéines et réduire la toxicité des protéines sera abordé dans les autres chapitres de ce site Web.

Méthode d'expression

Une expérience d'expression typique comprend l'étape suivante :

  • La cueillette d'un une seule colonie à partir d'une plaque fraîchement striée de l'hôte d'expression contenant le vecteur recombinant. Lorsque la protéine hétérologue est toxique pour les cellules, des niveaux d'expression plus élevés sont obtenus en utilisant la méthode dite de "placage".
  • croissance d'un culture de départ. Inoculer avec la colonie cueillie jusqu'à 50 ml de milieu riche (tel que KG ou 2xYT) contenant l'antibiotique approprié. Lorsqu'une culture de démarrage plus importante est requise, inoculer 4 ml de milieu riche avec la croissance de la seule colonie pendant 4 à 8 heures à 37 ° C et l'utiliser pour ensemencer la culture de démarrage.

Ne laissez pas les cultures pousser à 37°C pendant la nuit ! Il est préférable de faire pousser des cultures pendant la nuit à 30°C ou moins. Alternativement, la culture peut être incubée à 37°C jusqu'à la DO600 est d'env. 1. Stocker ensuite la culture à 4°C pendant la nuit. Le lendemain matin, recueillir les cellules par centrifugation, les remettre en suspension dans du milieu frais et l'utiliser pour ensemencer la culture principale.

L'utilisation de l'ampicilline nécessite des précautions particulières. Le marqueur sélectionnable, la b-lactamase, est sécrété dans le milieu où il hydrolyse la totalité de l'ampicilline. Ce point est déjà atteint lorsque la culture est à peine trouble. À partir de là, les cellules dépourvues du plasmide ne seront pas tuées et pourraient envahir la culture (qui peut être testée à l'aide d'un test de stabilité du plasmide). Certaines solutions possibles sont :

  • cultiver des cultures d'une nuit à 30°C ou moins.
  • faire tourner les cultures pendant la nuit et remettre le culot en suspension dans un milieu frais pour éliminer la b-lactamase.
  • utiliser le plus stable carbénicilline au lieu de l'ampicilline.
  • Inoculation de la culture principale et incubation jusqu'à OD600 atteint 0,4-1. La valeur de DO optimale dépend de la méthode de culture et du milieu. Pour les cultures en flacon utilisant LB-moyen un OD600de 0.6 est recommandé. Pour augmenter la vitesse de croissance, nous réalisons les cultures à 37°C jusqu'à atteindre la DO d'induction. Ensuite, les cultures sont refroidies à la température d'induction dans de l'eau glacée.

Remarque : Pour une bonne aération, ne pas utiliser plus de médium que 20% du volume total du ballon.

  • Induction de l'expression des protéines. L'expression des protéines est induite par l'ajout de l'inducteur approprié ou par la modification des conditions de croissance. À partir de ce moment, les cellules utiliseront la plupart de leurs ressources pour la production de la protéine cible et ne se développeront plus beaucoup.

Pour les promoteurs les plus utilisés, les conditions d'induction sont énumérées ci-dessous.

Promoteur induction état typique gamme
trc (hybride) ajout d'IPTG 0,2 mm 0,05 - 2,0 mM
araBAD ajout de l-arabinose 0.2% 0.002 - 0.4 %
PL changer la température de 37 à 42°C
T7-lac opérateur ajout d'IPTG 0,2 mm 0,05 -2,0 mM

Après induction les cultures sont incubées de 3 heures à une nuit en fonction de la température d'induction. Les lignes directrices sont données ci-dessous.


Le rôle émergent de la biologie des systèmes pour l'ingénierie de la production de protéines dans les cellules CHO

Pour répondre à la demande toujours croissante de protéines thérapeutiques efficaces, sûres et abordables, des décennies d'efforts intenses ont visé à maximiser la quantité et la qualité des protéines recombinantes produites dans les cellules CHO. Les innovations en matière de biotraitement et les efforts d'ingénierie cellulaire ont amélioré le titre du produit, mais des processus cellulaires non caractérisés et des mécanismes de régulation des gènes entravent toujours la croissance cellulaire, la productivité spécifique et la qualité des protéines. Ici, nous résumons les progrès récents de la biologie des systèmes et des approches axées sur les données visant à comprendre comment les voies moléculaires, les processus cellulaires et les facteurs extrinsèques (par exemple, la supplémentation en milieu) influencent la production de protéines recombinantes. En particulier, à mesure que les données omiques disponibles pour les cellules CHO continuent de croître, les modèles prédictifs et les criblages seront de plus en plus utilisés pour démêler les moteurs biologiques de la production de protéines, qui peuvent être utilisés avec les technologies émergentes d'édition du génome pour concevoir rationnellement les cellules afin de contrôler davantage la quantité , la qualité et l'abordabilité de nombreux médicaments biologiques.

Copyright © 2017 Elsevier Ltd. Tous droits réservés.

Les figures

Fig 1. Trois vagues de technologies différentes…

Fig 1. Trois vagues de technologies différentes ont permis une amélioration continue de la production de protéines recombinantes…

Fig. 2. Productivité spécifique publiée, densité cellulaire…

Fig. 2. La productivité spécifique publiée, la densité cellulaire et le titre total du produit se sont régulièrement améliorés au cours de…


1 réponse 1

Je pose cette question pour comprendre si les cellules qui sont utilisées pour créer des protéines de pointe sont attaquées par le système immunitaire.

Oui, c'est le but des vaccinations ARN !

Mais ne vous inquiétez pas, c'est une bonne chose, comme on peut le conclure à partir de cet article de synthèse, qui souligne l'avantage des vaccinations à l'ARN pour invoquer la réponse immunitaire cellulaire :

Bien que les vaccins sous-unitaires aient été utilisés avec succès pour susciter une immunité humorale contre une grande variété d'agents pathogènes, ils ne parviennent pas à induire l'immunité cellulaire qui est nécessaire pour éradiquer le réservoir pathogène intracellulaire de nombreuses maladies chroniques, y compris les infections virales telles que le VIH ou l'hépatite C.

Fondamentalement, l'idée est que les antigènes présentés à partir de vaccins traditionnels sont enclins à être présentés via MHC2, provoquant plutôt une immunité humorale, tandis qu'après la transfection d'ARN, des peptides produits cellulairement peuvent également être présentés sur MHC1, provoquant une immunité cellulaire.


Article de recherche original

Nadide Altincekic 1,2 † , Sophie Marianne Korn 2,3 † , Nusrat Shahin Qureshi 1,2 † , Marie Dujardin 4 † , Martí Ninot-Pedrosa 4† , Rupert Abele 5 , Marie José Abi Saad 6 , Catherine Alfano 7 , Fabio C. L. Almeida 8,9 , Islam Alshamleh 1,2 , Gisèle Cardoso de Amorim 8,10 , Thomas K. Anderson 11 , Cristiane D. Anobom 8,12 , Chelsea Anorma 13 , Jasleen Kaur Bains 1,2 , Adriaan Bax 14 , Martin Blackledge 15 , Julius Bléchar 1,2 , Anja Bཬkmann 4 * ‡ , Louis Brigandat 4 , Anna Bula 16 , Matthias Bütikofer 6 , Aldo R. Camacho-Zarco 15 , Teresa Carlomagno 17,18 , Icaro Poutinhon Caruso 8,9,19 , Pariül Ceylan 1,2 , Apirat Chaikuad 20,21 , Feixia Chu 22 , Laura Cole 4 , Marquise G. Crosby 23 , Vanessa de Jésus 1,2 , Karthikeyan Dhamotharan 2,3 , Isabelle C. Felli 24,25 , Jan Ferner 1,2 , Yanick Fleischmann 6 , Marie-Laure Fogeron 4 , Nikolaos K. Fourkiotis 26 , Christin Fuks 1 , Boris F&# x000fcrtig 1,2 , Angelo Gallo 26 , Santosh L. Gande 1,2 , Juan Atilio Gerez 6 , Dhiman Ghosh 6 , Francisco Gomes-Neto 8,27 , Oksana Gorbatiouk 28 , Serafima Guseva 15 , Caroline Hacker 29 , Sabine H๏ner 30 , Bing Hao 28 , Bruno Hargittay 1,2 , K. Henzler-Wildman 11 , Jeffrey C. Hoch 28 , Katharina F. Hohmann 1,2 , Marie T. Hutchison 1,2 , Kristaps Jaudzems 16 , Katarina Jovi&# x00107 22 , Janina Kaderli 6 , Gints Kalniņš 31 , Iveta Kaᑮpe 16 , Robert N. Kirchdoerfer 11 , John Kirkpatrick 17,18 , Stefan Knapp 20,21 , Robin Krishnathas 1,2 , Felicitas Kutz 1,2 , Susanne zur Lage 18 , Roderick Lambertz 3 , Andras Lang 30 , Douglas Laurent 32 , Lauriane Lecoq 4 , Verena Linhard 1,2 , Frank Löhr ​​2,33 , Anas Malki 15 , Luiza Mamigonian Bessa 15 , Rachel W. Martin 13,23 , Tobias Matzel 1,2 , Damien Maurin 15 , Seth W. McNutt 22 , Nathane Cunha Mebus-Antunes 8,9 , Battre H. Meier 6 , Nathalie Meiser 1 , Miguel Mompeán 32 , Elisa Monaca 7 , Roland Montserret 4 , Laura Mariño Perez 15 , Céline Moser 34 , Claudia Muhle Goll 34 , Thaïs Cristtina Neves-Martins 8,9 , Xiamonine Ni 20,21 , Brenna Norton Baker 13 , Roberta Pierattelli 24,25 , Letizia Pontoriero 24,25 , Ioulia Pustovalova 28 , Oliver Ohlenschl&# x000e4ger 30 , Julien Orts 6 , Andrea T. Da Poian 9 , Dennis J. Pyper 1,2 , Christian Richter 1,2 , Roland Riek 6 , Tchad M. Rienstra 35 , Angus Robertson 14 , Anderson S. Pinheiro 8,12 , Raffaele Sabbatella 7 , Nicola Salvi 15 , Krishna Saxena 1,2 , Linda Schulte 1,2 , Marco Schiavina 24,25 , Harald Schwalbe 1,2 * ‡ , Mara Silber 34 , Marcius da Silva Almeida 8,9 , Marc A. Sprague-Piercy 23 , Georgios A. Spyroulias 26 , Sridhar Sreeramulu 1,2 , Jan-Niklas Tants 2,3 , Kaspars T&# x00101rs 31 , Félix Torres 6 , Sabrina Töws 3 , Miguel Á. Tréviño 32 , Camions Sven 1 , Aikaterini C. Tsika 26 , Krisztina Varga 22 , Ying Wang 17 , Marco E. Weber 6 , Julia E. Weigand 36 , Christoph Wiedemann 37 , Julia Wirmer-Bartoschek 1,2 , Maria Alexandra Wirtz Martin 1,2 , Johannes Zehnder 6 , Martin Hengesbach 1 * ‡ et Andreas Schlundt 2,3 * ‡
  • 1 Institut de chimie organique et de biologie chimique, Université Goethe de Francfort, Francfort-sur-le-Main, Allemagne
  • 2 Centre de résonance magnétique biomoléculaire (BMRZ), Université Goethe de Francfort, Francfort-sur-le-Main, Allemagne
  • 3 Institut des biosciences moléculaires, Université Goethe de Francfort, Francfort-sur-le-Main, Allemagne
  • 4 Microbiologie moléculaire et biochimie structurale, UMR 5086, CNRS/Université de Lyon, Lyon, France
  • 5 Institut de biochimie, Université Goethe de Francfort, Francfort-sur-le-Main, Allemagne
  • 6 Ecole polytechnique fédérale de Suisse, Laboratoire de chimie physique, ETH Zurich, Zurich, Suisse
  • 7 Unité de biologie structurale et biophysique, Fondazione Ri.MED, Palerme, Italie
  • 8 Centre national de résonance magnétique nucléaire (CNRMN, CENABIO), Université fédérale de Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brésil
  • 9 Institut de biochimie médicale, Université fédérale de Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brésil
  • 10 Centre multidisciplinaire de recherche en biologie (NUMPEX), Campus Duque de Caxias Université fédérale de Rio de Janeiro, Duque de Caxias, Brésil
  • 11 Institut de virologie moléculaire, Université du Wisconsin-Madison, Madison, WI, États-Unis
  • 12 Institut de chimie, Université fédérale de Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brésil
  • 13 Département de chimie, Université de Californie, Irvine, CA, États-Unis
  • 14 LCP, NIDDK, NIH, Bethesda, Maryland, États-Unis
  • 15 Univ. Grenoble Alpes, CNRS, CEA, IBS, Grenoble, France
  • 16 Institut letton de synthèse organique, Riga, Lettonie
  • 17 BMWZ et Institut de chimie organique, Université Leibniz de Hanovre, Hanovre, Allemagne
  • 18 Groupe de chimie structurelle basée sur la RMN, Helmholtz Center for Infection Research, Braunschweig, Allemagne
  • 19 Centre multi-utilisateurs pour l'innovation biomoléculaire (CMIB), Département de physique, Université d'État de São Paulo (UNESP), São José do Rio Preto, Brésil
  • 20 Institut de chimie pharmaceutique, Université Goethe de Francfort, Francfort-sur-le-Main, Allemagne
  • 21 Structural Genomics Consortium, Buchmann Institute for Molecular Life Sciences, Francfort-sur-le-Main, Allemagne
  • 22 Département des sciences moléculaires, cellulaires et biomédicales, Université du New Hampshire, Durham, NH, États-Unis
  • 23 Département de biologie moléculaire et de biochimie, Université de Californie, Irvine, CA, États-Unis
  • 24 Centre de Résonance Magnétique (CERM), Université de Florence, Sesto Fiorentino, Italie
  • 25 Département de chimie “Ugo Schiff”, Université de Florence, Sesto Fiorentino, Italie
  • 26 Département de pharmacie, Université de Patras, Patras, Grèce
  • 27 Laboratoire de Toxinologie, Fondation Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brésil
  • 28 Département de biologie moléculaire et de biophysique, UConn Health, Farmington, CT, États-Unis
  • 29 Signals GmbH & Co. KG, Francfort-sur-le-Main, Allemagne
  • 30 Institut Leibniz sur le vieillissement&# x02014Institut Fritz Lipmann (FLI), Iéna, Allemagne
  • 31 Centre letton de recherche et d'études biomédicales, Riga, Lettonie
  • 32 Institut de chimie physique “Rocasolano” (IQFR), Conseil national espagnol de la recherche (CSIC), Madrid, Espagne
  • 33 Institut de chimie biophysique, Université Goethe de Francfort, Francfort-sur-le-Main, Allemagne
  • 34 IBG-4, Institut de technologie de Karlsruhe, Karlsruhe, Allemagne
  • 35 Département de biochimie et installation nationale de résonance magnétique à Madison, Université du Wisconsin-Madison, Madison, WI, États-Unis
  • 36 Département de biologie, Université technique de Darmstadt, Darmstadt, Allemagne
  • 37 Institut de biochimie et de biotechnologie, Charles Tanford Protein Centre, Université Martin Luther Halle-Wittenberg, Halle/Saale, Allemagne

La maladie hautement contagieuse COVID-19 causée par le Bêtacoronavirus Le SRAS-CoV-2 constitue une grave menace pour l'humanité et exige la réorientation des efforts et des critères scientifiques vers des projets de recherche organisés. L'international COVID19-RMN consortium cherche à fournir ces nouvelles approches en rassemblant une expertise scientifique dans le monde entier. En particulier, la mise à disposition de protéines virales et d'ARN ouvrira la voie à une compréhension détaillée des composants moléculaires du SRAS-CoV-2. La recherche en COVID19-RMN et les ressources fournies par le consortium sont entièrement divulguées pour accélérer l'accès et l'exploitation. Les investigations RMN des composants moléculaires viraux sont conçues pour fournir la base essentielle pour des travaux ultérieurs, y compris les études d'interaction macromoléculaire et le criblage de médicaments à haut débit. Ici, nous présentons le catalogue complet d'une approche holistique de préparation de protéines SARS-CoV-2 basée sur les efforts collectifs du consortium. Nous fournissons des protocoles pour la production à grande échelle de plus de 80% de toutes les protéines du SRAS-CoV-2 ou de parties essentielles de celles-ci. Plusieurs des protéines ont été produites dans plus d'un laboratoire, démontrant la grande interopérabilité entre les groupes RMN du monde entier. Pour la majorité des protéines, nous pouvons produire des échantillons marqués aux isotopes de qualité HSQC. Avec plusieurs affectations de déplacement chimique RMN rendues publiques sur covid19-nmr.com, nous fournissons ici des ressources très précieuses pour la production de protéines SARS-CoV-2 sous forme isotopique.


Production et purification de protéines

Le rendement et l'activité des protéines peuvent être maximisés en sélectionnant les bons réactifs de lyse et la résine de purification appropriée. La plupart des protéines recombinantes sont exprimées sous forme de protéines de fusion avec des étiquettes d'affinité courtes, telles que la polyhistidine ou la glutathion S-transférase, qui permettent une purification sélective de la protéine d'intérêt.

La production de protéines est un système complexe de biotechnologies dont chaque étape influence les uns avec les autres. La méthode de purification de la protéine recombinante dépend principalement des caractéristiques de la protéine recombinante et du système d'expression appliqué. Sino Biological offre un service à guichet unique allant du gène à la protéine purifiée avec de nombreuses années d'expérience dans l'expression de protéines et de multiples technologies de purification et de repliement des protéines. Nous disposons de plusieurs systèmes d'expression de protéines tels que des systèmes d'expression bactériens, de levure, de baculovirus-insectes et de mammifères et plus de 30 systèmes de purification pour gérer de 2 à 1 000 L pour répondre à l'expression et à la production de protéines à haut débit et à grande échelle.

Plateforme de production de protéines

La production de protéines est le processus biotechnologique de génération d'une protéine spécifique. Les systèmes de production de protéines couramment utilisés comprennent ceux dérivés de bactéries, de cellules de baculovirus/insectes, de cellules de mammifères et de levure.

Utiliser le bon système d'expression pour votre application spécifique est la clé du succès. La solubilité, la fonctionnalité, la vitesse de purification et le rendement des protéines sont souvent des facteurs cruciaux à prendre en compte lors du choix d'un système d'expression. De plus, chaque système a ses propres forces et défis, qui sont importants lors du choix d'un système d'expression.

Méthodes de purification des protéines

La purification des protéines signifie le fractionnement des protéines, également appelé traitement en aval. La purification des protéines implique un certain nombre de processus, y compris le pompage et l'ultrafiltration, qui impliquent des environnements de cisaillement importants. Plus important encore, les étiquettes de protéines sont un outil utile et pratique pour améliorer la solubilité des protéines recombinantes, rationaliser la purification des protéines et permettre un moyen facile de suivre les protéines pendant l'expression et la purification des protéines.

Une grande variété de méthodes de purification de protéines qui peuvent être combinées pour générer un schéma de purification approprié sont disponibles. Habituellement, on exécute une série d'étapes de purification, et seulement rarement les protéines peuvent être purifiées en une seule étape.

Les premières étapes combinent des méthodes à faible résolution et à haute capacité aux étapes ultérieures du schéma de purification. Pour la purification des protéines à faible résolution, des méthodes telles que la précipitation fractionnée et les systèmes de partition à deux phases sont généralement utilisées. Pour les applications nécessitant la plus grande pureté et relativement petites Purification des protéines quantités de protéines, la chromatographie peut être choisie pour purifier sélectivement la protéine cible.

Principales méthodes de chromatographie utilisées dans la purification des protéines


Nos projets

Projets de recherche et développement technologique (TR&D)

Grâce à des partenariats établis avec les laboratoires Driving Biomedical Project (DBP), le Center on Membrane Protein Production and Analysis (COMPPÅ) développera de nouvelles méthodologies dans les domaines de la recherche et du développement technologiques (TR&D) décrits ci-dessous. Une fois ces technologies suffisamment établies, elles seront mises à la disposition de la communauté de recherche sur les protéines membranaires dans son ensemble.

TR&D 1 est engagé dans le développement d'une technologie pour une production efficace de protéines membranaires recombinantes.

TR&D 2 développe une technologie d'optimisation d'échantillons de protéines membranaires pour l'analyse structurelle.

TR&D 3 est engagé dans le développement de tests fonctionnels génériques – applicables à une large gamme de protéines membranaires.

TR&D 4 développe une technologie pour la détermination de la structure.

Composante Service et Collaboration

COMPPÅ développe des réactifs et des méthodes pour la production d'échantillons, la préparation, les analyses fonctionnelles et la détermination de la structure des protéines membranaires. Les applications de ces méthodes aux projets des utilisateurs sont disponibles en tant que services pour les groupes de recherche collaborateurs. Plus précisément, COMPPÅ accepte de nouvelles candidatures dans le cadre de ses projets de conduite de projets biomédicaux (DBP) et de projets de collaboration et de service (C&S).

COMPPÅ est ouvert à la communauté de recherche dans son ensemble, y compris les collaborateurs actuels.

Composante formation et diffusion

Les technologies développées par COMPPÅ sont distribuées à la communauté des protéines membranaires, et nous assurerons également une formation sur ces technologies.


Production et purification de GFP

Différentes méthodes d'isolement peuvent être appliquées en fonction des propriétés de la protéine. Chromatographie d'échange d'ions est utile si la protéine d'intérêt a une charge spécifique qui va interagir avec une résine chargée de la charge opposée.

Immunoprécipitation

Immunopréciation : la colonne est remplie d'agarose protéine-A qui se lie aux anticorps. Les lysats cellulaires sont ensuite chargés sur les colonnes où ils s'écoulent et sont autorisés à interagir avec l'anticorps. Des lavages sont effectués pour éliminer les protéines non spécifiquement liées. Un tampon d'élution est utilisé pour interrompre l'interaction de l'anticorps avec la protéine cible.

Purification par affinité

Purification par affinité emploie l'utilisation d'anticorps spécifiques qui se lient très étroitement à la protéine d'intérêt pour la retenir sur une colonne. Avec ces techniques, la protéine retenue sur la résine est lavée de nombreuses fois pour éliminer d'autres protéines qui ne collent pas spécifiquement. Un changement de pH ou de conditions ioniques est alors utilisé pour perturber l'interaction avec la résine et éluer les protéines de la colonne. Les protéines qui sont conçues pour contenir des étiquettes peuvent être purifiées par des anticorps spécifiques à ces étiquettes. De plus, l'ajout de 6 résidus histidine consécutifs ou plus à l'extrémité d'une protéine les rend susceptibles d'être purifiés avec une résine Nickel-NTA ou une purification au cobalt. Dans ces cas, l'étiquette 6XHis s'associe à ces ions métalliques sur la résine et adhère sélectivement.

Résine Nickel NTA coordonnant la capture d'une protéine marquée 6His

Exclusion de taille

Crédit : Takomètre (CC-BY 2.5)
La plupart d'entre vous sont familiers avec les filtres de purification d'eau. Avant d'utiliser ces filtres, vous les faites tremper dans de l'eau et des résidus sombres s'échappent. Ce résidu sombre est du charbon activé. Le charbon actif a de minuscules pores microscopiques qui piègent de petits objets comme des ions et d'autres particules. L'objectif principal de ces filtres est d'éliminer les métaux et le chlore qui se trouvent dans l'eau du robinet. La nature poreuse du charbon actif le rend utile pour piéger les molécules dans les systèmes de purification d'eau.

Le processus utilisé pour piéger ces petites particules est appelé exclusion de taille . Contrairement à l'électrophorèse sur gel d'agarose où les plus petites particules traversent la matrice plus rapidement, les résines d'exclusion stérique piègent les plus petites molécules.

Plus la molécule est petite, plus elle passe de temps dans les pores lorsqu'elle traverse la matrice.


Technologies de production de protéines : de nouvelles façons de nourrir la population mondiale

Crédit : CC0 Domaine public

Les protéines font partie intégrante de l'alimentation humaine. Les sources les plus courantes sont la viande, les produits d'origine animale tels que le lait et les œufs, et même les plantes. La production, notamment via l'élevage, exige d'immenses ressources et pose de graves problèmes environnementaux. Une équipe de recherche de l'Université de Tübingen dirigée par le biotechnologue de l'environnement, le professeur Lars Angenent du Center for Applied Geosciences, a maintenant mené une enquête théorique sur la façon dont la population mondiale croissante pourrait être approvisionnée en protéines sans agriculture conventionnelle. En utilisant l'approche "pouvoir-protéine" dans laquelle les protéines sont produites directement avec des ingrédients de base récupérés, tels que le dioxyde de carbone et l'ammoniac, via la biotechnologie, l'équipe discute de considérations théoriques, de méthodes industrielles de production de protéines existantes et d'estimations pour atteindre cet objectif. . Dans son article de synthèse publié dans la revue scientifique Joule, l'équipe conclut qu'un système électrochimique et biotechnologique combiné pourrait être en mesure de fournir des quantités considérables de protéines pour la consommation humaine avec une consommation d'énergie comparativement faible.

"Nous sommes dans une crise complexe avec la production alimentaire actuelle", explique Lars Angenent. "L'élevage pour la production de protéines animales en particulier consomme beaucoup de terres, de combustibles fossiles, de phosphore et d'eau. Il génère également d'énormes quantités d'émissions néfastes pour le climat." La production de protéines animales est chère et inabordable pour de nombreuses personnes, notamment dans les pays très pauvres. Par conséquent, l'objectif d'Angenent est de rendre la production de protéines bon marché et de l'intégrer dans une économie de recyclage durable qui ne nécessite pas de combustibles fossiles.

Des êtres vivants polyvalents

Les protéines sont principalement constituées des éléments chimiques carbone, oxygène, hydrogène et azote. Cependant, le corps humain lui-même n'est pas capable de former tous les composants protéiques à partir de composés simples, nous devons donc les absorber avec notre nourriture. La synthèse chimique serait très complexe. Cependant, il existe des microbes unicellulaires qui produisent naturellement de grandes quantités de protéines avec une composition nutritive pour les humains, en particulier les levures et les champignons. Angenent souligne que des chercheurs, dont lui-même et le chef du groupe de recherche de Tübingen, le Dr Bastian Molitor, ont lié les processus électrochimiques et biologiques de différentes manières dans les processus de puissance en protéines. Mais il dit que l'accent est mis à Tübingen sur l'efficacité des processus individuels et s'ils sont adaptés à nos objectifs. L'équipe de Tübingen se concentre sur des processus qui ne nécessitent pas d'énergie lumineuse ou impliquent des microbes génétiquement modifiés. Par exemple, l'énergie de l'électricité peut être utilisée électrochimiquement pour diviser l'eau en hydrogène et oxygène. Certaines bactéries peuvent alors oxyder l'hydrogène en eau et utiliser l'énergie libérée pour convertir le dioxyde de carbone et l'ammoniac en d'autres substances organiques qui forment les éléments constitutifs des protéines. Certains des producteurs de protéines, comme la levure et certains champignons, peuvent être consommés directement par les humains.

Idées et approches recueillies

Dans les années 1960, les chercheurs ont commencé à réfléchir à la façon dont les protéines sous forme de dioxyde de carbone et d'ammoniac pourraient être produites à partir des excrétions humaines. "Là-bas, l'idée était de créer une économie de recyclage en boucle fermée à petite échelle afin d'envoyer des gens sur une longue mission spatiale", explique Angenent. La première expérience industrielle de production de protéines à partir de substances simples et d'énergie est venue de la production de substituts de viande. "Nous avons testé des idées et des approches pour un développement pratique rapide et y voyons un grand potentiel. Selon une étude, seulement environ 2,5% de toute l'énergie générée est nécessaire pour nourrir les gens dans le monde avec des protéines produites à l'aide de méthodes power-to-protein", a-t-il déclaré. dit.

Cependant, une telle stratégie nécessiterait une refonte radicale des processus de production. Sur la voie d'une économie de recyclage durable, le scientifique affirme que l'humanité a besoin de plus d'opportunités pour générer de l'énergie renouvelable et d'une infrastructure pour capturer et stocker le dioxyde de carbone, le gaz qui est maintenant plus communément connu comme un déchet nocif. Plus important encore, les agriculteurs devraient être renforcés économiquement pour se concentrer sur la production durable de blé, de légumes, de fruits, de noix et d'autres produits de remplacement des protéines, tout en préservant la nature.


Voir la vidéo: MOOC côté cours: Synthèse des protéines (Août 2022).