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Concentration de calcium dans les épines dendritiques activées ?

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Quels sont les niveaux de calcium typiques atteints dans les épines postsynaptiques simples après l'activation des récepteurs NMDA par un EPSP ou un pic de rétropropagation ? Tout le monde semble se référer à cet article de Neuron (Sabatini et al. 2002) qui rapporte des estimations expérimentales d'environ 1 uM à la suite d'une stimulation synaptique unique dans les épines des neurones CA1. Cependant, la plupart des articles de calcul sur LTP (même des modèles biophysiquement détaillés) fonctionnent avec des valeurs beaucoup plus faibles pour les transitoires Ca2+ qui ne semblent pas avoir de support expérimental concret. J'essaie de mettre en place un modèle réaliste pour la signalisation du calcium de la colonne vertébrale de l'hippocampe, et j'apprécierais vraiment que quelqu'un puisse signaler d'autres articles expérimentaux pertinents qui fournissent des estimations pour les transitoires de calcium de la colonne vertébrale.


Une source antérieure pour une estimation de ${[Ca]_{i}}^{+2}$ dans les épines provient de tranches d'hippocampe de rats P13-P19 (Majewska et al. 2000). Le ${[Ca]_{i}}^{+2}$ au repos dans cet article était de ~80 nM et un potentiel d'action de rétro-propagation (PA) a suscité une réponse jusqu'à ~250 nM (changement de ~170 nM) . Ils ont inclus $F_{min}$ et $F_{max}$, le signal de fluorescence minimum et maximum d'un seul AP, comme paramètres dans l'équation qu'ils ont utilisée pour estimer ${[Ca]_{i}}^{+2 }$. Ce document peut être l'endroit où les modèles que vous mentionnez ont obtenu leurs numéros.

Le ${[Ca]_{i}}^{+2}$ au repos estimé dans Sabatini et al. (2002), où ils ont également utilisé des tranches d'hippocampe de rat de P14-P20, qui correspondent à celles trouvées dans Majewska et al. comme c'était ~ 70 nM. Pour l'estimation du changement évoqué de ${[Ca]_{i}}^{+2}$ après un seul PA, ils ont utilisé l'augmentation maximale de fluorescence des trains de potentiels d'action à 62,5 Hz et 83,3 Hz comme paramètre dans leur l'équation de l'estimateur, en supposant que l'indicateur de calcium était complètement saturé à ces fréquences de stimulation. Leur estimation de la variation de ${[Ca]_{i}}^{+2}$ par AP était d'environ 530 nM. Ils ont ensuite estimé que les propriétés tampons de l'indicateur de calcium lui-même pourraient réduire le changement de ${[Ca]_{i}}^{+2}$. Ainsi, ils ont chargé plusieurs indicateurs de calcium différents avec différentes affinités et à différentes concentrations, afin de manipuler le $kappa_b$, la capacité tampon, de l'indicateur de calcium. Ils ont observé une relation linéaire très forte entre $kappa _b$ et la variation de ${[Ca]_{i}}^{+2}$. En extrapolant à partir d'un ajustement linéaire sur ces données, ils ont conclu que dans le cas où il n'y avait pas d'indicateur de calcium dans la cellule, c'est-à-dire lorsque $kappa _b = 0$- le changement de ${[Ca]_{i}}^{+2}$ par AP serait d'environ 1 $mu$M.

Ainsi, la différence entre ces études est que dans Majewska et al. ils ont utilisé la fluorescence maximale observée de l'indicateur de calcium dans leurs données après des PA uniques, alors que dans Sabatini et al. ils ont tenté de saturer l'indicateur de calcium avec des trains de PA à haute fréquence. De plus, dans Sabatini et al. ils ont tenté de tenir compte de la capacité tampon de l'indicateur de calcium lui-même, arrivant ainsi à une estimation plus impartiale.

De manière rassurante, des travaux ultérieurs du laboratoire Yuste (le même laboratoire que dans l'étude Majewska et al.) pourraient reproduire les résultats de Sabatini et al. lorsqu'ils ont utilisé une méthodologie similaire (Cornelisse et al. 2007). Leur estimation de $Delta{[Ca]_{i}}^{+2}$ pour un seul AP était également de ~1 $mu$M.


Le rôle de la densité de la colonne vertébrale dendritique dans les troubles neuropsychiatriques et d'apprentissage

Photo à l'origine par MethoxyRoxy sur Wikimedia Commons. Aucun changement. Licence CC BY-SA 2.5.

Par Neha Madugala, Sciences cognitives, ‘21

Note de l'auteur: Le trimestre dernier, j'ai suivi des cours de neurobiologie (NPB100) avec Karen Zito, professeur à l'UC Davis. J'étais intéressé par ses recherches sur les épines dendritiques et sa corrélation avec mon domaine d'intérêt personnel en matière de recherche concernant les déficiences langagières et cognitives présentes dans différentes populations telles que les personnes atteintes de schizophrénie. Il semble y avoir un lien de corrélation entre la génération et la quantité d'épines dendritiques et la présence de différents troubles neurologiques. Compte tenu de la nature dynamique des épines dendritiques, les recherches actuelles étudient leur rôle exact et le potentiel de manipuler ces épines afin d'avoir un impact sur l'apprentissage et la mémoire.

Les épines dendritiques sont de petites protubérances bulbeuses qui tapissent les côtés des dendrites d'un neurone [12]. Les épines dendritiques servent de site majeur de synapses pour les neurones excitateurs, qui continuent la propagation du signal dans le cerveau. On sait relativement peu de choses sur le but et le rôle exacts des épines dendritiques, mais à l'heure actuelle, il semble y avoir une corrélation entre la concentration des épines dendritiques et la présence de différents troubles, tels que les troubles du spectre autistique (TSA), la schizophrénie et La maladie d'Alzheimer. Les scientifiques émettent l'hypothèse que les épines dendritiques sont un acteur clé dans la pathogenèse de divers troubles neuropsychiatriques [8]. Il convient de noter que d'autres changements morphologiques sont également observés lorsque l'on compare des individus présentant les troubles neuropsychiatriques mentionnés à des individus neurotypiques. Cependant, tous ces troubles partagent le fil conducteur d'une densité anormale de la colonne vertébrale dendritique.

Les principaux troubles étudiés en relation avec la densité de la colonne vertébrale dendritique sont les troubles du spectre autistique (TSA), la schizophrénie et la maladie d'Alzheimer. Les études actuelles suggèrent que ces troubles entraînent un écart du nombre d'épines dendritiques par rapport à ce qui est observé chez un individu neurotypique. Il convient de noter qu'il y a un déclin général des épines dendritiques à mesure qu'un individu vieillit. Cependant, les déficiences intellectuelles et les troubles neuropsychiatriques semblent modifier cette densité à un rythme plus extrême. Le graphique montre la tendance générale de la densité de la colonne vertébrale dendritique pour divers troubles, cependant, ces tendances peuvent légèrement varier d'une personne à l'autre avec le même trouble.

I. Rôle des épines dendritiques

Les épines dendritiques sont des protubérances trouvées sur certains types de neurones dans tout le cerveau, comme dans le cervelet et le cortex cérébral. Ils ont été identifiés pour la première fois par Ramon y Cajal, qui les a classés comme « épines ou épines courtes » situées de manière non uniforme le long de la dendrite [6].

L'ensemble du cortex cérébral humain se compose de 10 à 14 épines dendritiques. Une seule dendrite peut contenir plusieurs centaines d'épines [12]. Il y a une plus grande densité globale d'épines dendritiques sur les dendrites périphériques par rapport aux dendrites proximales et au corps cellulaire [3]. Leur rôle principal est d'aider à la formation de synapses sur les dendrites.

Les épines dendritiques se divisent en deux catégories : les épines persistantes et transitoires. Les épines persistantes sont considérées comme des épines à « mémoire », tandis que les épines transitoires sont considérées comme des épines « d'apprentissage ». Les épines transitoires sont classées comme des épines qui existent depuis quatre jours ou moins et les épines persistantes comme des épines qui existent depuis huit jours ou plus [5].

La concentration dense d'épines sur les dendrites est cruciale pour la nature fondamentale des dendrites. Au niveau d'une fente synaptique excitatrice, la libération du neurotransmetteur au niveau des récepteurs excitateurs de la cellule postsynaptique entraîne un potentiel postsynaptique excitateur (EPSP), qui amène la cellule à déclencher un potentiel d'action. Un potentiel d'action est l'endroit où un signal est transmis d'un neurone à un autre neurone. Pour qu'un neurone propage un potentiel d'action, il doit y avoir une accumulation de charge positive au niveau des synapses, atteignant un certain seuil ( Figure 2 ). La cellule doit atteindre un certain niveau de dépolarisation - une différence de charge à travers la membrane des neurones rendant l'intérieur plus positif. Un seul EPSP peut ne pas entraîner une dépolarisation suffisante pour atteindre ce seuil de potentiel d'action. En conséquence, la présence de plusieurs épines dendritiques sur la dendrite permet la formation de plusieurs synapses et la sommation de plusieurs EPSP. Avec la sommation de divers EPSP sur les dendrites des neurones, la cellule peut atteindre le seuil de potentiel d'action. La plus grande densité d'épines dendritiques le long de la cellule postsynaptique permet la formation de plus de connexions synaptiques, augmentant ainsi les chances qu'un potentiel d'action se produise.

Figure 2. Tir de Potentiel d'Action (EPSP)

  1. Le neurotransmetteur est libéré par la cellule présynaptique dans la fente synaptique.
  2. Pour un EPSP, un neurotransmetteur excitateur sera libéré, qui se liera aux récepteurs de la cellule postsynaptique.
  3. La liaison de ces neurotransmetteurs excitateurs entraînera l'ouverture des canaux sodiques, permettant au sodium de descendre son gradient électrique et chimique, dépolarisant la cellule.
  4. Les EPSP seront sommés au niveau de la butte axonale et déclencheront un potentiel d'action.
  5. Ce potentiel d'action entraînera la libération par la cellule de déclenchement d'un neurotransmetteur au niveau de son axone terminal, transmettant davantage le signal électrique à d'autres neurones.

Les dendrites sont initialement formées sans épines. Au fur et à mesure que le développement progresse, la membrane plasmique de la dendrite forme des protubérances appelées filopodes. Ces filopodes forment ensuite des synapses avec les axones et finissent par passer des filopodes aux épines dendritiques [6].

La raison derrière la création d'épines dendritiques est actuellement inconnue. Il y a quelques hypothèses potentielles. La première hypothèse suggère que la présence d'épines dendritiques peut augmenter la densité de tassement des synapses, permettant la formation de plus de synapses potentielles. La deuxième hypothèse suggère que leur présence peut aider à prévenir l'excitotoxicité, la surexcitation des récepteurs excitateurs (récepteurs NMDA et AMPA) présents sur les dendrites. Ces récepteurs se lient généralement au glutamate, un neurotransmetteur typiquement excitateur, libéré par la cellule présynaptique. Cela peut entraîner des dommages au neurone ou, si cela est plus grave, la mort neuronale. Étant donné que les épines dendritiques compartimentent la charge [3], cette caractéristique aide à empêcher la dendrite d'être surexcitée au-delà du potentiel seuil d'un potentiel d'action. Enfin, une autre hypothèse suggère que la grande variation de la morphologie de la colonne vertébrale dendritique suggère que ces différentes formes jouent un rôle dans la modulation de la façon dont les potentiels postsynaptiques peuvent être traités par la dendrite en fonction de la fonction du signal.

La création de ces épines dendritiques est rapide au début du développement, diminuant lentement à mesure que l'individu vieillit. Ce processus est principalement remplacé par l'élagage des synapses formées avec des épines dendritiques lorsque l'individu est plus âgé. L'élagage permet d'améliorer le rapport signal sur bruit des signaux envoyés dans les circuits neuronaux [3]. Le rapport signal sur bruit décrit le rapport entre les signaux envoyés par les neurones et les signaux réellement reçus par les cellules postsynaptiques. Il détermine l'efficacité de la transmission du signal. L'expérimentation a montré que la présence de glutamate et de récepteurs excitateurs (tels que NMDA et AMPA) peut entraîner la formation d'épines dendritiques en quelques secondes [3]. L'introduction du NMDA et de l'AMPA entraîne le clivage de la molécule d'adhésion intracellulaire-5 (ICAM5) des neurones de l'hippocampe. ICAM5 est une « molécule d'adhésion neuronale qui régule l'allongement dendritique et la maturation de la colonne vertébrale. [11] "En outre, grâce à une combinaison de colorant fluorescent et de microscopie confocale ou à balayage laser à deux photons, les scientifiques ont pu utiliser la technologie d'imagerie pour constater que les épines peuvent subir des changements mineurs en quelques secondes et des changements de conformation plus drastiques, disparaissant même en quelques minutes. heures [12].

La morphologie de la tête de la colonne vertébrale, une grosse tête bulbeuse reliée à un cou très mince qui s'attache à la dendrite, contribue à son rôle de cellule postsynaptique. Cette forme permet à une synapse d'une colonne vertébrale dendritique d'être activée et renforcée sans influencer les synapses voisines [12].

La forme de l'épine dendritique est extrêmement dynamique, permettant à une épine de modifier légèrement sa morphologie tout au long de sa vie [5]. Cependant, la morphologie de la colonne vertébrale dendritique semble prendre une forme prédominante qui est déterminée par la région cérébrale de son emplacement. Par exemple, les neurones présynaptiques du thalamus prennent la forme d'un champignon, tandis que le noyau latéral de l'amygdale a de fines épines sur leurs dendrites [2]. Le type de neurone et la région cérébrale d'où provient la colonne vertébrale semblent être corrélés à la morphologie observée.

La colonne vertébrale contient une densité postsynaptique, constituée de récepteurs de neurotransmetteurs, de canaux ioniques, de protéines d'échafaudage et de molécules de signalisation [12]. En plus de cela, la colonne vertébrale a un réticulum endoplasmique lisse, qui forme des piles appelées appareils de la colonne vertébrale. Il possède en outre des polyribosomes, supposés être le site de la synthèse protéique locale dans ces épines, et un cytosquelette à base d'actine pour la structure [12]. Le cytosquelette à base d'actine compense le manque de microtubules et de filaments intermédiaires, qui jouent un rôle crucial dans la structure et le transport de la plupart de nos cellules animales. De plus, ces épines sont capables de compartimenter le calcium, l'ion utilisé au niveau des synapses neurales qui signalent à la cellule présynaptique de libérer son neurotransmetteur dans la fente synaptique [12]. Le calcium joue un rôle crucial dans les cascades des seconds messagers, influençant la plasticité neuronale [6]. Il joue également un rôle dans la polymérisation de l'actine, qui tient compte de la nature mobile de la morphologie de la colonne vertébrale [6].

Il existe de nombreuses formes différentes pour les épines dendritiques. Les types courants sont « tronqué » (épines courtes et épaisses sans cou), « mince » (petite tête et cou mince), « champignon » (grosse tête avec un cou resserré) et « ramifié » (deux têtes se ramifiant à partir du même cou) [12].

IV. Apprentissage et mémoire

Les épines dendritiques jouent un rôle crucial dans la mémoire et l'apprentissage par l'apparition d'une potentialisation à long terme (LTP), qui est considérée comme le niveau cellulaire d'apprentissage et de mémoire. On pense que la LTP induit la formation de la colonne vertébrale, ce qui suggère la corrélation courante selon laquelle l'apprentissage est associé à la formation d'épines dendritiques. De plus, la LTP serait capable d'altérer l'hippocampe immature et mature, communément associé à la mémoire [2]. Pour contraster la LTP, la dépression à long terme (LTD) fonctionne essentiellement à l'opposé de la LTP – en diminuant la densité et la taille de la colonne vertébrale dendritique [2].

La corrélation entre les épines dendritiques et l'apprentissage est relativement inconnue. Il semble y avoir une tendance générale suggérant que la création de ces épines est associée à l'apprentissage. Cependant, il n'est pas clair si l'apprentissage entraîne la formation de ces épines ou si la formation de ces épines entraîne l'apprentissage. L'idée générale derrière cette hypothèse est que les épines dendritiques aident à la formation de synapses, permettant au cerveau de former plus de connexions. En conséquence, un déclin de ces épines dendritiques dans les troubles neuropsychiatriques, tels que la schizophrénie, peut inhiber la capacité d'un individu à apprendre. Ceci est observé dans diverses déficiences cognitives et linguistiques observées chez les personnes atteintes de schizophrénie.

La mémoire est associée au renforcement et à l'affaiblissement des connexions dues respectivement à LTP et LTD. L'altération de ces épines par LTP et LTD est appelée plasticité dépendante de l'activité [6]. Les principales formes morphologiques associées à la mémoire sont la colonne vertébrale du champignon, une grosse tête avec un cou resserré, et la colonne vertébrale trapue, une colonne vertébrale courte et épaisse sans cou [6]. Ces deux épines sont relativement grandes, ce qui entraîne des connexions plus stables et durables. Ces épines plus grosses et plus lourdes associées à l'apprentissage sont le résultat de la PLT. En revanche, les épines transitoires (vivant quatre jours ou moins) sont généralement plus petites et plus immatures en termes de morphologie et de fonction, ce qui entraîne des connexions plus temporaires et moins stables.

LTP et LTD jouent un rôle crucial dans la modification de la morphologie de la colonne vertébrale dendritique. Les troubles neuropsychiatriques peuvent altérer ces mécanismes, entraînant une densité et une taille anormales de ces épines.

I. Qu'est-ce que la schizophrénie ?

La schizophrénie est un trouble mental qui entraîne des troubles de la pensée et des comportements, des hallucinations et des délires [9]. Les mécanismes exacts de la schizophrénie sont toujours à l'étude alors que les chercheurs tentent de déterminer les raisons biologiques sous-jacentes de ce trouble et un moyen d'aider ces personnes. Le traitement actuel est axé sur la réduction et, dans certains cas, le traitement des symptômes de ce trouble, mais des recherches et une compréhension supplémentaires sont nécessaires pour traiter pleinement ce trouble mental.

La source exacte de la schizophrénie semble se situer quelque part entre la présence de certains gènes et les effets environnementaux. Il semble y avoir une corrélation entre les événements de vie traumatisants ou stressants au cours de l'adolescence d'un individu et une susceptibilité accrue au développement de la schizophrénie [1]. Alors que la recherche est toujours en cours, certaines études indiquent que le cannabis joue un rôle dans l'augmentation de la susceptibilité à la schizophrénie ou dans l'aggravation des symptômes si un individu est déjà atteint de schizophrénie [1]. Il semble y avoir une certaine forme de corrélation génétique, étant donné une probabilité accrue de développer la schizophrénie si elle est présente chez un membre de la famille. Ce facteur semble résulter d'une combinaison de gènes, mais aucun gène n'a encore été identifié. Il semble également y avoir une composante chimique, étant donné la variation de la composition chimique et de la densité des individus neurotypiques et des individus atteints de schizophrénie. Plus précisément, les chercheurs ont observé une quantité élevée de dopamine chez les personnes atteintes de schizophrénie [1].

III. Relation entre les épines dendritiques et la schizophrénie

Un fil conducteur chez la plupart des patients schizophrènes est une altération de la morphologie dendritique des neurones pyramidaux (forme cellulaire proéminente trouvée dans le cortex cérébral), survenant dans diverses régions du cortex cérébral [7]. Observé dans des études post-mortem sur les tissus cérébraux, il semble y avoir une densité réduite d'épines dendritiques dans le cerveau des personnes atteintes de schizophrénie. Ces résultats sont cohérents avec diverses régions du cerveau qui ont été étudiées, telles que le néocortex frontal et temporal, le cortex visuel primaire et le subiculum au sein de la formation hippocampique [7].Sur sept études observant ce résultat, la diminution médiane signalée de la densité de la colonne vertébrale était de 23 %, la fourchette globale de ces diverses études étant une baisse de 6,5 % à 66 % [7].

Il convient de noter que des études ont été menées pour voir si la diminution de la densité de la colonne vertébrale était due à l'utilisation de médicaments antipsychotiques. Cependant, les essais sur les animaux et les humains n'ont montré aucune différence significative dans la densité de la colonne vertébrale dendritique des individus testés.

Ce déclin de la densité des épines dendritiques est supposé être le résultat de l'incapacité du cerveau des individus schizophrènes à produire suffisamment d'épines dendritiques à la naissance ou s'il y a un déclin plus rapide de ces épines pendant l'adolescence, où l'apparition de la schizophrénie est généralement observée. [7]. La source de ce déclin n'est pas claire, mais semble être attribuée à des déficits de taille, d'entretien ou simplement aux mécanismes de formation sous-jacente de ces épines dendritiques [7].

Cependant, les résultats sont contradictoires. Par exemple, Thompson et al. ont mené une étude qui semblait suggérer qu'un déclin de la densité de la colonne vertébrale entraînait un déclin progressif de la matière grise, typiquement observé chez les individus schizophrènes. Thompson et al. a mené une in vivo étude de ce phénomène. L'étude a utilisé des IRM pour douze individus schizophrènes et douze individus neurotypiques, trouvant un déclin progressif de la matière grise commençant dans le lobe pariétal et s'étendant aux zones motrice, temporale et préfrontale [10]. L'étude suggère que la principale attribution pour cela est une baisse de la densité de la colonne vertébrale dendritique avec la progression de la maladie. Cette étude coïncide avec l'hypothèse précédemment évoquée d'un déclin des épines à l'adolescence.

Il est également possible qu'une combinaison de ces deux facteurs se produise. La plupart des études n'ont pu observer que le tissu cérébral post mortem, créant la confusion quant à savoir s'il y a un déclin des épines ou si les épines ne sont tout simplement pas produites en premier lieu. Le manque de in vivo études, il est difficile de trouver une tendance concrète dans les données.

Alors que la recherche est toujours en cours, les preuves actuelles semblent suggérer que les épines dendritiques sont un aspect crucial de l'apprentissage et de la mémoire. Leur rôle dans ces fonctions cruciales a été reflété par leur absence dans divers troubles neuropsychiatriques tels que la schizophrénie, certains déficits d'apprentissage présents chez certaines personnes atteintes de TSA et les déficits de mémoire présents dans la maladie d'Alzheimer. Ces déficits semblent se produire lors de la création précoce de réseaux de neurones dans le cerveau au niveau des synapses. Des recherches supplémentaires comprenant le développement de ces épines et la création de différentes formes morphologiques peuvent être cruciales pour déterminer comment potentiellement guérir ou traiter ces déficiences présentes dans les troubles neuropsychiatriques et d'apprentissage.


De la forme à la fonction : compartimentation calcique dans les épines dendritiques

Les épines dendritiques compartimentent le calcium, et cela pourrait être leur fonction principale. Nous passons en revue les travaux expérimentaux sur la dynamique du calcium de la colonne vertébrale. L'afflux de calcium dans les épines est médié par les canaux calciques et par les récepteurs NMDA et AMPA et est suivi d'une équilibration diffusionnelle rapide dans la tête de la colonne vertébrale. La cinétique de désintégration du calcium est contrôlée par une diffusion plus lente à travers le cou de la colonne vertébrale et par les pompes à calcium de la colonne vertébrale. La libération de calcium se produit dans les épines, bien que son rôle soit controversé. Enfin, les tampons calciques endogènes dans les épines restent inconnus. Ainsi, les épines sont des compartiments calciques en raison de leurs morphologies et de leurs mécanismes locaux d'afflux et d'extrusion. Ces études mettent en évidence la richesse et l'hétérogénéité des voies qui régulent les accumulations de calcium dans la colonne vertébrale et la relation étroite entre la morphologie et la fonction de la colonne vertébrale.


Contrôle de la plasticité morphologique et fonctionnelle de la colonne vertébrale dendritique par les petites GTPases

La plasticité structurelle des synapses excitatrices est une composante vitale du développement neuronal, de la plasticité synaptique et du comportement. Le développement ou la régulation anormal des synapses excitatrices a également été fortement impliqué dans de nombreux troubles neurodéveloppementaux, psychiatriques et neurodégénératifs. Dans le cerveau antérieur des mammifères, la majorité des synapses excitatrices sont situées sur les épines dendritiques, des protubérances dendritiques spécialisées enrichies en actine. La recherche au cours des dernières années a commencé à élucider les complexités impliquées dans la régulation de la structure de la colonne vertébrale dendritique. La petite famille de protéines GTPase est devenue un régulateur clé de la plasticité structurelle, liant les signaux extracellulaires à la modulation des épines dendritiques, ce qui sous-tend potentiellement leur capacité à influencer la cognition. Nous passons ici en revue un certain nombre d'études qui examinent comment les petites GTPases sont activées et régulées dans les neurones et comment elles peuvent avoir un impact sur la dynamique de l'actine, et donc sur la morphologie de la colonne vertébrale dendritique. Élucider ce processus de signalisation est essentiel pour approfondir notre compréhension des mécanismes de base par lesquels l'information est codée dans les circuits neuronaux, mais peut également fournir un aperçu de nouvelles cibles pour le développement de thérapies efficaces pour traiter le dysfonctionnement cognitif observé dans une gamme de troubles neurologiques.

1. Introduction

La fonction cérébrale est une propriété émergente des connexions entre les neurones. Un câblage correct du cerveau pendant le développement est essentiel pour la cognition et la mémoire [1–3], tandis qu'à l'inverse, un câblage anormal dû à un trouble neurologique, une maladie ou une lésion cérébrale entraîne un dysfonctionnement [4–6]. Comprendre comment les circuits neuronaux sous-tendent le stockage et le traitement de l'information est un défi fondamental auquel sont confrontées les neurosciences modernes [1, 3]. Bien que de modestes incursions dans le déchiffrement du câblage cérébral aient été réalisées, on sait très peu de choses sur la façon dont ce câblage contribue à sa fonction. Un obstacle principal au progrès est la complexité stupéfiante des circuits neuronaux dans le cerveau des mammifères, des milliards de synapses empiétant sur des milliards de neurones. Une approche pour gérer cette complexité consiste à limiter l'attention aux synapses d'un seul type de neurotransmetteur. Les synapses glutamatergiques sont hautement plastiques, jouent un rôle essentiel dans l'apprentissage, la mémoire, ainsi que la cognition, et constituent la majorité des connexions entre les neurones pyramidaux du cerveau antérieur [7-9]. Une caractéristique déterminante de ces synapses est qu'elles se produisent dans des compartiments postsynaptiques spécialisés appelés épines dendritiques (figures 1 (a) à 1 (c)). Ces structures microscopiques riches en actine garnissent l'arbre dendritique et se composent généralement d'un col et d'une tête de colonne vertébrale [10, 11]. C'est dans la tête de la colonne vertébrale que se trouve la densité postsynaptique (PSD) riche en protéines (Figure 1 (c)). Intégrés dans le PSD sont

-Acide méthyl-D-aspartique (NMDA) et ??récepteurs du glutamate de type acide -amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique (AMPA) qui médient la transmission synaptique excitatrice (Figure 1(c)) [10, 12]. Les épines dendritiques présentent des durées de vie à la fois transitoires et durables, persistant de quelques minutes à plusieurs années in vivo [7, 13]. Une myriade de morphologies de la colonne vertébrale dendritique est observée dans le cerveau et la notion que la structure de la colonne vertébrale est fortement corrélée avec d'importantes propriétés synaptiques est devenue un thème récurrent au cours de la dernière décennie [14, 15]. Par exemple, les grandes épines dendritiques sont susceptibles de présenter de grandes PSD et d'établir des connexions solides, tandis que les petites épines dendritiques indiquent des connexions faibles et peuvent être très plastiques [16]. En conséquence, les épines plus grosses ont tendance à persister pendant de longues périodes, tandis que les épines plus petites et plus minces sont plus transitoires [15, 17]. Cependant, des données récentes suggèrent que ces phénomènes peuvent être différents entre le cortex et l'hippocampe, les épines sur les neurones hippocampiques CA1 démontrant un renouvellement plus rapide que ceux trouvés dans les régions corticales [18]. Néanmoins, de nombreux rapports démontrent que les épines dendritiques ne sont pas des structures statiques et peuvent se réorganiser rapidement en réponse à divers stimuli, y compris l'apprentissage dépendant de l'expérience [19-21], ainsi que des signaux neuromodulateurs et même hormonaux [22-25]. Une séquelle clé de ce dynamisme structurel est la capacité d'échantillonner le neuropile environnant pour les axones incidents [19, 26, 27].

Il est largement reconnu que les épines dendritiques font partie intégrante de la formation des circuits, mais la nature précise de leur contribution est toujours un sujet d'enquête et de débat. Les épines dendritiques présentent un large spectre de réorganisation structurelle, de la formation et de l'élimination à des changements plus subtils de taille et de forme. On estime que ces structures contiennent plus de 1000 protéines différentes [28], y compris des échafaudages, des récepteurs, des protéines d'adhésion, des protéines de signalisation, de l'actine F et des protéines du cytosquelette (Figures 2(a) et 2(b)). Les théories actuelles postulent que les épines dendritiques fournissent un domaine de signalisation chimique et électrique qui est partiellement distinct de leur dendrite parent, améliorant ainsi la capacité de calcul du neurone [3], et qu'elles sont suffisamment enrichies des composants moléculaires nécessaires aux modifications structurelles et fonctionnelles. [29]. De manière critique, le développement, le raffinement et la maintenance des circuits neuronaux télencéphaliques sont essentiels pour la perception sensorielle, le contrôle moteur, la cognition et la mémoire [1, 8, 30, 31]. Surtout, une meilleure compréhension de la dynamique des circuits peut fournir un pont entre les phénomènes de plasticité observés au niveau de la synapse et le comportement animal [8, 9, 18, 19]. Il est donc essentiel d'examiner les mécanismes qui recâblent le cerveau et la revue actuelle est dédiée à cet objectif. Au cours de la dernière décennie, d'énormes progrès ont été réalisés dans la dissection des mécanismes moléculaires qui contribuent à la plasticité structurelle des épines dendritiques [10, 12, 32, 33]. Un déterminant moléculaire clé de la plasticité de la colonne vertébrale dendritique est le cytosquelette d'actine et ses régulateurs. Nous passons ici en revue les travaux récents qui ont commencé à élucider la manière complexe dont la famille des petites protéines GTPases, leurs régulateurs et effecteurs modulent le cytosquelette d'actine pour contrôler la morphologie de la colonne vertébrale dendritique à l'appui de la fonction synaptique.

2. Actine: un déterminant clé de la morphologie de la colonne vertébrale dendritique

Il a été démontré que la malléabilité morphologique des épines dendritiques est due à un cytosquelette d'actine dynamique [34, 35]. Les épines sont de riches dépôts d'actine filamenteuse et monomère et atteignent à la fois stabilité et dynamisme grâce à un processus de rotation connu sous le nom de tapis roulant, où les monomères sont simultanément ajoutés à l'extrémité barbelée (à la périphérie de la colonne vertébrale) et retirés de l'extrémité pointue du filament (près de la noyau de la colonne vertébrale) [36, 37]. Une variété de protéines exercent un contrôle sur le cytosquelette d'actine et nombre de ces protéines sont de puissants morphogènes de la colonne vertébrale et des modulateurs synaptiques [23, 38–42].

Un contrôle strict du cytosquelette d'actine est essentiel au bon fonctionnement synaptique. En effet, le tapis roulant à l'actine contrôle la distribution des protéines dans la densité postsynaptique, dont les récepteurs AMPA, comme le révèlent des travaux utilisant la récupération de fluorescence après photoblanchiment [43]. Ainsi, la compréhension des voies de signalisation complexes empiétant sur les filaments d'actine est essentielle pour révéler les mécanismes sous-jacents à la transmission synaptique normale et pathologique. À cette fin, de nombreux efforts de recherche se sont concentrés sur l'identification et la caractérisation des protéines régulatrices de l'actine. En considérant le positionnement de ces protéines dans les cascades de signalisation par rapport à l'espace extracellulaire et au cytosquelette d'actine, elles peuvent être organisées en groupes fonctionnels hiérarchiques comprenant les protéines de liaison à l'actine, les petites GTPases et les petits régulateurs et effecteurs de la GTPase (Figure 2(b)) [ 32, 44].

3. Petites GTPases : hubs de signalisation morphologique dans les épines dendritiques

La super famille des petites GTPases est classée en 5 sous-familles : les familles Ras, Rho, Rab, Sar1/ARF et Ran. Les membres de cette superfamille régulent diverses fonctions cellulaires et sont souvent appelés commutateurs moléculaires car ils existent dans des états binaires « activé » et « désactivé » lorsqu'ils sont liés à GTP et GDP, respectivement [45, 46]. La présente revue sera limitée aux membres des familles Rho et Ras car ces protéines ont été plus directement liées au remodelage de l'actine. De plus, les voies de signalisation médiées par Rho et Ras présentent une diaphonie substantielle qui a des implications importantes pour la plasticité morphologique et fonctionnelle de la colonne vertébrale. Alors que notre compréhension du contrôle des petites GTPases du cytosquelette d'actine a été grandement améliorée par le travail dans les cellules non neuronales, la colonne vertébrale dendritique représente un microdomaine unique, avec des exigences fonctionnelles distinctes. À ce titre, nous nous concentrerons sur les études menées dans les épines dendritiques, sauf indication contraire.

Une littérature abondante relie la sous-famille Rho à la régulation de la structure et de la dynamique de l'actine synaptique [47]. Rac1 et RhoA sont peut-être les mieux étudiés parmi ces membres de la famille, qui ont des effets puissants et opposés sur la structure des épines dendritiques [48]. La surexpression de Rac1 négatif dominant entraîne une réduction de la densité de la colonne vertébrale dans les coupes d'hippocampe et les cultures dissociées [49, 50], tandis que la surexpression d'une forme constitutivement active ou RhoA entraîne une perte de la colonne vertébrale [51]. Il est généralement admis que l'activation de Rac1 stimule la polymérisation de l'actine F et stabilise les épines dendritiques grâce à l'activation des effecteurs en aval p21-activated kinase (PAK), LIM-kinase-I (LIMK-I) et la protéine de liaison à l'actine cofiline [52, 53]. À l'inverse, l'activation de RhoA stimule la polymérisation de l'actine F via sa protéine kinase ROCK en aval, qui à son tour régule directement la phosphorylation de LIMK-1 dans les cellules non neuronales et neuronales [54, 55]. Les Rho GTPases sont activées rapidement et localement dans les têtes de la colonne vertébrale à la suite de stimuli de potentialisation, comme le révèle l'imagerie à vie de fluorescence à deux photons de sondes à base de FRET [55]. Fait intéressant, Cdc42, une Rho GTPase liée à Rac, et RhoA présentaient une activité spatiale différentielle, reflétant leurs contributions uniques au blocage de la régulation de la morphologie de la colonne vertébrale de la cascade de signalisation RhoA inhibait la croissance initiale de la colonne vertébrale tandis que l'inhibition de la voie Cdc42 empêchait l'élargissement soutenu de la colonne vertébrale. Le renforcement de l'importance des Rho GTPases dans la plasticité du cerveau antérieur est une étude récente démontrant la prolifération active de la colonne vertébrale induite par Rac1 dans les neurones pyramidaux corticaux ainsi qu'une plasticité améliorée des circuits visuels chez les animaux dépourvus de monoculaires [56, 57]. En accord avec cette idée, la perturbation de la signalisation par les voies Rho/Rac est fréquemment associée à une déficience intellectuelle (DI), une condition caractérisée par des anomalies de la morphologie de la colonne vertébrale dendritique [58-60].

Bien que la plupart des recherches sur la structure neuronale se soient concentrées sur la sous-famille des Rho GTPases, il a été démontré que d'autres GTPases régulent la morphologie de la colonne vertébrale dendritique. Les membres de la sous-famille Ras des petites GTPases ont également été trouvés pour réguler la structure et la dynamique de la colonne vertébrale dendritique [61]. L'une des premières études à lier Ras au remodelage structurel des épines dendritiques a été réalisée à partir d'un modèle murin où une forme active constitutive de H-Ras était surexprimée [62]. Ces souris présentaient une complexité neuronale accrue, qui s'est reflétée dans des études ultérieures qui ont également révélé une formation et une connectivité anormales de la colonne vertébrale [63, 64]. En accord avec un rôle dans la médiation de la plasticité de la colonne vertébrale dendritique, il a également été montré que Ras est activé en même temps que l'élargissement de la colonne vertébrale induit par le déverrouillage du glutamate dans les neurones hippocampiques [65]. Fait intéressant, la dynamique spatio-temporelle de l'activation de Ras était à nouveau différente de celle des Rho GTPases, RhoA et Cdc42, renforçant l'idée que l'activation temporelle et la localisation de ces molécules sont essentielles pour déterminer leur impact sur la fonction cellulaire [55, 65 , 66]. Des travaux antérieurs sur les cellules non neuronales ont également lié Rap, un membre de la sous-famille Ras, à la dynamique du cytosquelette [67]. Dans les neurones, l'activation de Rap1 par les récepteurs NMDA dans les neurones corticaux en culture entraîne une diminution de la taille de la colonne vertébrale [41]. Un autre régulateur puissant de l'activité de la petite GTPase dans les cellules neuronales est l'hormone œstrogène, 17??-estradiol [68–70]. Fait intéressant, lorsque les neurones corticaux matures sont intensément exposés à 17??-estradiol, une augmentation rapide de Rap1 actif est observée en même temps qu'une augmentation de la densité de la colonne vertébrale [25]. De manière critique, la surexpression de RapGAP, une protéine qui inhibe l'activation de Rap, a bloqué l'effet de 17??-estradiol sur la densité de la colonne vertébrale [25]. En revanche, la surexpression de Rap2 constitutivement actif provoque une perte de densité de la colonne vertébrale dendritique et une augmentation du nombre de protubérances ressemblant à des filopodes dans les neurones hippocampiques en culture [71]. En accord avec ces observations in vitro, les souris qui expriment un Rap2 constitutivement actif présentent moins d'épines dendritiques et un apprentissage altéré [72]. Collectivement, ces données démontrent que les GTPases des familles Rho et Ras ont de puissants effets régulateurs sur les épines dendritiques qui peuvent avoir un impact sur la fonction cognitive.

4. Petits régulateurs GTPases

Les GTPases sont elles-mêmes étroitement régulées par deux classes de protéines : les facteurs d'échange de nucléotide guanine (GEF) qui facilitent la liaison du GTP par la GTPase et les protéines activatrices de GTPase (GAP) qui catalysent l'hydrolyse du GTP en GDP. Ces protéines transmettent divers signaux de l'espace extracellulaire aux GTPases et diffèrent par leurs modèles d'expression cellulaire et leurs distributions intracellulaires. Chaque GTPase peut être régulée par une variété de GEF et GAP différents, permettant à la fois une diversité de signalisation et une spécificité spatiale. En catalysant l'échange du GDP lié à la GTPase en GTP, les GEF servent à activer les GTPases. En répondant aux signaux extracellulaires, y compris les neuromodulateurs et l'activité neuronale, les GEF peuvent obtenir un contrôle bidirectionnel de la morphologie de la colonne vertébrale et de la force synaptique en agissant par l'intermédiaire de leurs GTPases cibles.

Comme RhoA est associé au rétrécissement et à la déstabilisation de la colonne vertébrale, les GEF qui activent cette GTPase ont des effets similaires sur la morphologie de la colonne vertébrale dendritique. Par exemple, il a été démontré que GEF-H1 colocalise avec le complexe récepteur AMPA et régule négativement la densité et la longueur de la colonne vertébrale via une cascade de signalisation RhoA [73]. De même, l'activation du récepteur Eph A4 (EphA4) entraîne la rétraction des épines dendritiques, effet dépendant de l'activation de RhoA via son GEF, l'ephexin1 [74]. Epac2 est un autre FEM impliqué dans la déstabilisation et le rétrécissement des épines. Ce Rap1 GEF multidomaine est activé par l'AMPc et conduit à une réduction de la teneur en récepteurs AMPA de la colonne vertébrale, à une diminution de la transmission excitatrice et à une déstabilisation de la colonne vertébrale, comme le montrent les études d'imagerie en direct. À l'inverse, l'inhibition d'Epac2 entraîne une hypertrophie et une stabilisation de la colonne vertébrale [23]. Fait intéressant, rare de novo mutations de la Epac2 gène ont été trouvés associés aux personnes atteintes de troubles du spectre autistique (TSA) [75]. Les protéines mutantes Epac2 résultantes ont montré des capacités modifiées pour activer Rap et lorsqu'elles sont exprimées dans les neurones corticaux primaires, elles ont entraîné une gamme de morphologies anormales de la colonne vertébrale dendritique [23]. Analyse de Epac2 Les souris knock-out ont en outre révélé des déficits dans les comportements sociaux et de communication, alors que la mémoire et les comportements d'inclinaison ne sont apparemment pas affectés [76]. Fait intéressant, ces souris présentent également un renouvellement de la colonne vertébrale dendritique réduit in vivo, conforme à ce qui a été montré précédemment in vitro [23, 76]. Cependant, il n'est pas clair comment les altérations de la plasticité de la colonne vertébrale dendritique sont liées à des comportements sociaux et communicatifs altérés. Plus récemment, en utilisant in utero électroporation pour exprimer une construction ARNi contre Epac2 dans un sous-ensemble de neurones corticaux de couche 2/3, un rôle pour Epac2 dans le maintien des dendrites basales, mais pas apicales, a été révélé [77]. Fait intéressant, la régulation de la formation de dendrites basales par Epac2 nécessite la signalisation Ras, car une protéine Epac2 mutante associée aux TSA, qui a une capacité réduite à se lier à Ras actif, induit également des déficits dans le maintien des dendrites basales [77]. Cela démontre qu'il peut y avoir un niveau de diaphonie entre les petits systèmes GTPase.Conformément à cela, il a été récemment montré que la kinase 2 de type polo (Plk2) régule à la fois l'activité Ras et Rap en influençant directement les protéines régulatrices de l'activité de chaque petite GTPase en réponse à la plasticité homéostatique [78]. Ces études démontrent que la régulation synchronisée des petites GTPases Ras et Rap via leurs GEF et GAP joue un rôle important dans la plasticité homéostatique et dans le maintien de la morphologie neuronale [77, 78].

La régulation du Rac par ses GEF a également été bien étudiée. L'un de ces GEF est la kalirine-7, qui est particulièrement unique en raison du fait qu'il s'agit du seul GEF Rac1 connu exprimé dans le cortex de souris adultes [32]. La surexpression de cette kalirine-7 dans les cultures corticales entraîne une augmentation de la surface et de la densité de la tête de la colonne vertébrale. Parallèlement, le knockdown de la kalirine-7 par une approche ARNi réduit la surface et la densité de la colonne vertébrale [42]. Fait intéressant, les souris chez lesquelles le kalirine gène a été supprimé présentent de nombreux phénotypes rappelant la schizophrénie, notamment des déficits de la mémoire de travail ainsi qu'une densité réduite de la colonne vertébrale dendritique dans le cortex [79]. Dans l'hippocampe, le rôle de la kalirine-7 est obscurci en raison de la présence de deux autres GTPases Rac1, Tiam1 et ??-PIX [32, 52, 80]. Tiam1 est régulé par l'activation des récepteurs NMDA et a également été impliqué dans le développement de la colonne vertébrale dendritique dépendant des récepteurs EphB [80, 81]. De même, le Rac1 GEF ??-PIX, une cible en aval des récepteurs NMDA, s'est avérée être régulée par la CaM kinase kinase et la CaM kinase I [52].

Certaines GAPs ont fait l'objet d'une attention de la recherche en raison de leurs rôles putatifs dans l'identification. La perte de l'oligophrénine-1 Rho-GAP, un gène impliqué dans l'ID, perturbe la maturation synaptique et vertébrale dépendante de l'activité [82]. Un autre gène de ce type est le Ras-GAP SYNGAP1, qui peut réguler la morphologie de la colonne vertébrale via sa cible Ras ainsi que la signalisation en aval vers Rac et la cofiline [83]. Cette étude montre que la petite signalisation GTPase est souvent complexe et non linéaire et peut présenter des interférences entre les voies. mutations dans SYNGAP1 ont également été associés à la fois à la DI et au TSA [84]. Fait intéressant, un modèle animal de l'homme SYNGAP1 l'haploinsuffisance a montré une maturation accélérée de la colonne vertébrale dendritique entraînant une perturbation de l'équilibre excitateur/inhibiteur dans les réseaux de neurones [85]. De plus, ces souris ont également développé des anomalies comportementales persistantes. De manière critique, ces effets étaient les plus importants lorsque SYNGAP1 était perturbé au début du développement et minimes lorsqu'il était perturbé à l'âge adulte [85]. Plus récemment, il a été démontré que SYNGAP1 est phosphorylé par CaMKII, entraînant le trafic de cette protéine loin des synapses en réponse à la stimulation de la LTP. Il est important de noter que l'élimination de cette protéine GAP des synapses est considérée comme nécessaire pour l'activation de Ras LTP-dépendante et l'insertion ultérieure du récepteur AMPA et l'élargissement de la colonne vertébrale [86].

Un certain nombre de signaux extracellulaires sont connus pour exercer des influences profondes sur la morphologie de la colonne vertébrale dendritique, par l'activation de petites voies GTPase. Le récepteur prédominant dans la régulation de la plasticité de la colonne vertébrale dendritique en réponse à l'activité synaptique est le récepteur NMDA. Suite à l'activation des récepteurs NMDA, les épines dendritiques subissent une augmentation transitoire de la concentration en calcium [87, 88]. Cette augmentation du calcium active la calmoduline sensible au calcium (CaM) : la CaM liée au calcium active ensuite la famille CaMK de sérine/thréonine kinases comprenant CaMKI, CaMKII et CaMKIV [89]. Ces kinases vont phosphoryler une variété de cibles impliquées dans la plasticité structurelle de la colonne vertébrale, y compris le Rac-GEF kalirin-7, ainsi que d'autres protéines de signalisation et d'échafaudage impliquées dans la plasticité [42, 90]. Outre le glutamate, il a été démontré que d'autres neurotransmetteurs modulent la plasticité de la colonne vertébrale dendritique. L'activation des récepteurs 5-HT2A dans les neurones pyramidaux a augmenté la taille de la colonne vertébrale grâce à un mécanisme dépendant de la kalirine-7-Rac1-PAK [22]. Cette étude est d'une importance particulière car elle fournit un lien direct entre la signalisation sérotoninergique et la morphogenèse de la colonne vertébrale dendritique, toutes deux impliquées dans la schizophrénie. Un autre neurotransmetteur important impliqué dans la modulation des épines dendritiques et la fonction de la petite GTPase est la dopamine [91]. Par exemple, le traitement de rats avec de la 6-hydroxydopamine, une neurotoxine qui supprime sélectivement les neurones dopaminergiques et noradrénergiques, a entraîné une diminution de la densité de la colonne vertébrale dendritique dans le cortex prélimbique 3 semaines après l'administration de la toxine [92]. Curieusement, les déficits cognitifs dans la schizophrénie ont été liés à un dysfonctionnement de la dopamine [93, 94] et une réduction de la densité de la colonne vertébrale dendritique a été observée dans des tissus post-mortem prélevés sur des patients schizophrènes [95-97]. Les résultats de Solis et al. suggèrent qu'il peut en effet y avoir un lien pathologique entre le dysfonctionnement de la dopamine et la perte de densité de la colonne vertébrale dendritique. Une découverte cohérente avec cette idée est que le traitement avec l'olanzapine antipsychotique atypique, mais pas l'halopéridol antipsychotique typique, a pu sauver la perte de la colonne vertébrale induite par la 6-hydroxydopamine dans le cortex préfrontal du rat [98]. Au niveau moléculaire, l'activation des récepteurs D1/D5 avec l'agoniste sélectif SKF-38393 entraîne un rétrécissement de la colonne vertébrale par activation du Rap GEF Epac2 [23].

Des neuromodulateurs moins conventionnels ont également été impliqués dans la régulation des épines dendritiques. Classiquement définis comme une hormone, les œstrogènes sont récemment devenus un important modulateur de la plasticité de la colonne vertébrale dendritique [99]. Traitement des cultures corticales primaires avec 17??-estradiol a augmenté la densité de la colonne vertébrale tout en diminuant la teneur en récepteurs AMPA des épines. Ces « synapses silencieuses » ont été potentialisées par l'activation des récepteurs NMDA, rappelant la maturation dépendante de l'activité des synapses silencieuses au cours du développement [25]. Ces effets étaient médiés par les voies de signalisation Rap/AF-6(afadin)/ERK1/2, car l'inhibition ou l'interférence avec les actions de ces protéines était suffisante pour bloquer 17??-effets de l'estradiol sur les épines [25]. De plus, des études récentes ont démontré que le traitement aigu de cultures corticales de rat avec 17??-estradiol conduit à la phosphorylation de WAVE1 et à son ciblage ultérieur vers les épines, entraînant la polymérisation de l'actine. On pense que cela est nécessaire pour la formation de protubérances dendritiques immatures dans les jeunes neurones corticaux [100]. Des résultats similaires ont été rapportés dans des neurones en culture hippocampique. Ici, traitement chronique des cultures hippocampiques avec 17??-estradiol a entraîné une augmentation du nombre de synapses et une localisation accrue de la kalirine-7 aux épines dendritiques [101]. Cependant, ces actions du 17??-estradiol semblent être médiés par le récepteur bêta des œstrogènes (ER??) comme activation de ER?? mais pas ER?? agonistes est capable de récapituler ces effets [101-104].

5. Petits effecteurs GTPase et protéines de liaison à l'actine

En aval des petites GTPases se trouve une série de protéines effectrices qui transmettent des signaux aux régulateurs directs du cytosquelette d'actine. Une famille d'effecteurs particulièrement bien décrite des Rho GTPases Rac1 et Cdc42 sont les kinases activées par p21 (PAK) [105] et les Rho kinases (ROCK) [106]. Les PAK sont critiques pour la morphogenèse de la colonne vertébrale et la structure synaptique, en particulier dans le cortex [107]. Plus récemment, une série d'études a exploré les conséquences du knock-out PAK et ROCK dans le cerveau antérieur. La suppression de PAK1 ou ROCK-2 entraîne la perte de l'actine F des épines [108, 109]. De plus, les deux animaux knock-out ont démontré des déficits en LTP hippocampique, soulignant l'importance de ces Rho kinases pour la plasticité synaptique. Curieusement, la codélétion de PAK1 et PAK3 a entraîné un phénotype structurel et fonctionnel plus sévère. Les caractéristiques communes de ces animaux knock-out pour la Rho kinase comprennent une perturbation de la cascade de kinases en aval des Rho GTPases, une libération de cofiline par inhibition et une perte subséquente de F-actine des épines dendritiques.

Les travaux examinant la LIM-kinase (LIMK) fournissent plus de renseignements sur les effets des membres de la famille PAK et ROCK sur le cytosquelette d'actine. Active Pak1 peut phosphoryler LIMK-1 qui à son tour inhibe l'activité de la cofiline [111]. En conséquence, l'ablation génétique de LIMK-1 entraîne une activité élevée de la cofiline, une morphologie aberrante de la colonne vertébrale et une LTP améliorée [53]. Curieusement, des travaux récents ont identifié un nouveau mécanisme de régulation pour LIMK-1 via la modification des lipides [24]. La palmitoylation N-terminale de LIMK-1 cible la kinase vers les épines dendritiques et est nécessaire à la croissance de la colonne vertébrale dépendante de l'activité. La palmitoylation est en train de devenir un modulateur essentiel de la fonction synaptique épineuse [112].

Comme leur nom l'indique, les protéines de liaison à l'actine influencent directement la dynamique de l'actine en nucléant, en stabilisant ou en sectionnant les filaments d'actine. Les membres de la famille des protéines du syndrome de Wiskott-Aldrich (WASP) se lient à la fois à l'actine monomère et à l'actine filamenteuse [116] et sont soulagés de l'autoinhibition par les Rho GTPases [117]. N-WASP, un WASP enrichi en cerveau, semble être essentiel pour la formation de la colonne vertébrale et des synapses excitatrices [40]. Les petites GTPases exercent également un contrôle sur une famille de protéines homologues de la verproline (WAVE) de la famille WASP. Ces protéines jouent un rôle dans le maintien de la colonne vertébrale [118] et la formation [119] L'expression déficiente de WAVE1 s'accompagne de déficits de la mémoire spatiale chez la souris [120].

Le complexe Arp2/Arp3 est un nucléateur d'actine bien étudié et un facilitateur de la ramification de l'actine [121]. Le complexe Arp2/Arp3 est en aval des GTPases de la famille Rho, des protéines WASP et WAVE [122] et est susceptible de jouer un rôle dans le remodelage de la colonne vertébrale dendritique au cours de la croissance de la colonne vertébrale [123]. L'inhibition du complexe Arp2/Arp3 par la protéine de liaison à la protéine kinase C (PICK1) est nécessaire pour le rétrécissement de la colonne vertébrale pendant la LTD [124]. Plus récemment, il a été démontré que PICK1 signale en aval des AMPAR pour inactiver Cdc42 [125]. Comme mentionné ci-dessus, la cofiline est un autre déterminant essentiel de la dynamique squelettique de l'actine et entre en compétition avec le complexe Arp2/Arp3 en sectionnant et en déramifiant les filaments d'actine [126]. Bien que l'activation prolongée de la cofiline favorise une réduction de la taille de la colonne vertébrale [127], il semble qu'une poussée transitoire d'activité de la cofiline soit nécessaire pour la croissance de la colonne vertébrale pendant la LTP induite chimiquement [128]. Une revue récente du contrôle des petites GTPases du cytosquelette d'actine couvre ces voies plus en détail [44].

Parmi la liste des effecteurs Rap se trouvent un certain nombre de régulateurs du cytosquelette d'actine. Rap1 se lie directement à l'afadine, également connue sous le nom d'AF-6 [129], qui est une protéine d'échafaudage multidomaine jouant un rôle dans l'adhésion cellule-cellule [130]. En effet, le Rap actif était responsable du ciblage subcellulaire de l'afadine dans les neurones sous basal et après activation des récepteurs NMDA [41, 131]. Curieusement, suite à l'activation des récepteurs NMDA, l'afadine se transloque à la fois dans les synapses et le noyau d'une manière dépendante du temps. Au niveau des synapses, l'afadine est nécessaire pour les modifications de la colonne vertébrale dépendantes de l'activité et de Rap [41], tandis que dans le noyau, l'afadine est nécessaire pour la phosphorylation dépendante du temps des histones H3, suggérant un rôle potentiel dans la régulation de la transcription génique dépendante de l'activité [ 131]. L'afadine interagit également directement avec la profiline de la protéine polymérisant l'actine [129] et avec la protéine d'adhésion, la N-cadhérine [132], et la sous-unité du récepteur AMPA, GluA2 [133]. Conformément à ces interactions, l'afadine est nécessaire pour lier la N-cadhérine à la kalirine-7, permettant ainsi la régulation de l'activation de Rac et lier la N-cadhérine à la modulation dynamique de la morphologie de la colonne vertébrale dendritique [132]. De plus, le knockdown de l'afadine à l'aide d'une approche ARNi entraîne une perte de l'architecture dendritique, de la densité de la colonne vertébrale dendritique et de la transmission médiée par les récepteurs AMPA [133]. Il a également été démontré que Rap interagit avec et active les Rac-GEF Vav2 et Tiam1 [134], fournissant un autre exemple de petite diaphonie de la voie GTPase.

Ainsi, une cascade de signalisation morphogénique de la colonne vertébrale stéréotypée commence par un signal extracellulaire qui est transmis aux GEF ou aux GAP qui contrôlent la petite activité GTPase, qui à son tour influence les protéines de liaison à l'actine par le biais de petits effecteurs GTPase. Il apparaît maintenant qu'en plus de la signalisation dépendante de l'activité via les récepteurs NMDA, d'autres signaux extracellulaires, y compris les neuromodulateurs [22, 23] et les neurostéroïdes, peuvent agir via des voies similaires.

6. Conclusions

Comprendre comment les neurones codent les informations est un défi fondamental pour déterminer comment nous stockons et récupérons les informations sur notre environnement, ce qui nous permet de nous adapter au niveau comportemental. De plus en plus de preuves indiquent qu'un corrélat cellulaire clé du codage de l'information est la régulation des épines dendritiques et donc des connexions synaptiques excitatrices [1, 3]. Dans cette revue, nous avons présenté des preuves récentes qui placent les petites protéines GTPase comme un intermédiaire important entre les signaux extracellulaires et le cytosquelette d'actine, permettant la régulation de la structure et de la fonction des synapses. Des progrès importants ont été réalisés dans notre compréhension des molécules qui exercent une régulation étroite de la fonction de la petite GTPase dans les neurones [32, 61], et il apparaît également que ces molécules ont une dynamique spatio-temporelle unique qui est essentielle à leurs fonctions cellulaires [55, 65, 66]. Notre compréhension actuelle suggère que les petites GTPases peuvent agir indépendamment, via leurs effecteurs, en régulant directement le cytosquelette d'actine, pour exercer des effets sur la structure et le nombre de la colonne vertébrale dendritique, ainsi que sur la fonction synaptique. Cependant, plusieurs études ont maintenant démontré que plusieurs petites GTPases peuvent agir en coopération pour provoquer des changements dans la colonne vertébrale dendritique, ou sur le maintien de la morphologie neuronale globale [77, 78]. De plus, il apparaît également qu'un large éventail de signaux extracellulaires signalent également via de petites GTPases pour exercer des actions morphogènes [22, 25, 42, 47, 50, 65, 74, 80, 81]. Beaucoup de ces signaux extracellulaires peuvent activer les mêmes petites GTPases, ce qui suggère qu'au sein d'un même neurone, plusieurs facteurs peuvent moduler l'activité d'une seule sous-famille de petites GTPases. Élucider comment les neurones intègrent plusieurs signaux et comment ils résument à leur tour l'impact sur la fonction de la cellule et affectent finalement la cognition est en train de devenir un autre défi. Il est probable qu'une meilleure compréhension de la dynamique spatio-temporelle de la petite signalisation GTPase fournira un aperçu de la façon dont les neurones gèrent cette quantité d'informations. En outre, déterminer davantage la manière complexe dont les régulateurs de la petite signalisation GTPase interagissent et déterminer la manière non linéaire dont plusieurs voies sont activées par les mêmes signaux fournira une compréhension plus complète de la façon dont plusieurs facteurs régulent la plasticité de la colonne vertébrale.

Il est également à noter que de multiples troubles neurodéveloppementaux, psychiatriques et neurodégénératifs ont été fortement associés à des perturbations des circuits neuronaux [6, 135]. En effet, de nombreuses études post-mortem neuropathologiques ont fortement lié la morphologie anormale de la colonne vertébrale à la pathogenèse d'un certain nombre de troubles neuropsychiatriques, neurodéveloppementaux et neurodégénératifs [135, 136], tels que l'ID [137], le X fragile [138], le syndrome de Down [139 ], les troubles du spectre autistique (TSA) [140–142], la schizophrénie [96, 143], la dépression [144] et la maladie d'Alzheimer [145, 146]. Il est actuellement avancé que la dysmorphogénèse de la colonne vertébrale dendritique peut entraîner une fonction et une connectivité synaptiques défectueuses ou excessives, entraînant des perturbations des circuits neuronaux. Ce sujet a récemment été examiné en profondeur [2, 6, 135]. Le dérèglement des mécanismes complexes qui contrôlent la structure et la fonction de la colonne vertébrale dendritique peut contribuer à ces irrégularités synaptiques. La compréhension des mécanismes cellulaires par lesquels se produit la morphogenèse de la colonne vertébrale dendritique élargira non seulement notre connaissance du fonctionnement normal du cerveau, mais également celle du fonctionnement anormal du cerveau. Bien qu'une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires qui sous-tendent la plasticité corticale soit nécessaire, l'exploitation de la plasticité structurelle peut offrir une puissante avenue thérapeutique future pour les neuropathologies.

Conflit d'interêts

Les auteurs déclarent qu'il n'y a pas de conflit d'intérêts concernant la publication de cet article.

Remerciements

La recherche décrite dans le texte a été financée par des subventions du Medical Research Council (MRC), du Royaume-Uni, de la Royal Society, du Royaume-Uni, de la Brain and Behavior Foundation (anciennement NARSAD), du Psychiatric Research Trust à Deepak P. Srivastava et de l'American Heart Association (AHA ) à Deepak P. Srivastava et Kevin M. Woolfrey.

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Droits d'auteur

Copyright © 2016 Kevin M. Woolfrey et Deepak P. Srivastava. Il s'agit d'un article en libre accès distribué sous la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation, une distribution et une reproduction sans restriction sur n'importe quel support, à condition que l'œuvre originale soit correctement citée.


2. Le modèle

Un modèle compartimental basé sur une cellule pyramidale CA1 de rat adulte reconstruite est développé comme une extension du modèle de Migliore (Migliore, Ferrante, & Ascoli, 2005 : numéro de cellule 5038804 voir figure 1a). Les détails complets du modèle sont donnés en annexe. La morphologie est divisée en 337 compartiments électriques (sans compter les épines). Les canaux ioniques répartis dans l'espace se composent des familles suivantes : sodium rapide (Na), potassium à redressement retardé (K), type A K, courant h, HVA (putativement de type R) calcium (Ca) et Ca-activated, mAHP K. Na et KRD sont distribués dans toute la cellule, mais Na a une densité plus élevée dans l'axone et une densité plus faible dans les dendrites, il a également une récupération plus lente de l'inactivation dans les dendrites. KUNE et les canaux h augmentent tous les deux en densité avec la distance du soma, avec une densité saturante au-delà de 350 m. Les canaux calciques voltage-dépendants (VGCC : HVA R-type Ca) sont distribués dans les dendrites et les épines avec une densité fixe. Les détails du modèle de canal ionique sont donnés en annexe.

Il s'agit d'un ensemble restreint de tous les canaux ioniques identifiés dans la membrane CA1 PC, mais il est suffisant pour capturer les caractéristiques clés de l'excitabilité électrique de la cellule. Deux caractéristiques distinctes sont la facilité de propagation des signaux dans les dendrites (la compacité électrique) et la capacité de générer des signaux non linéaires à seuil, à savoir des pointes de sodium et de calcium dans les dendrites. Les deux caractéristiques peuvent être sous le contrôle de l'inhibition et de la neuromodulation dans un seul neurone de sorte qu'une excitabilité cellulaire différente puisse être obtenue dans différentes conditions comportementales. Différentes configurations cellulaires, en termes d'excitabilité membranaire, sont considérées. Ceux-ci sont obtenus en modifiant soit les propriétés de la membrane passive, soit les densités des canaux actifs. Les configurations spécifiques sont détaillées dans la section 3. La configuration de base (à partir de laquelle les paramètres individuels peuvent être modifiés) comprend les propriétés passives : Rm=28 K .cm 2 , Rune=150 .cm, Cm=1 F/cm 2 . Les propriétés actives de base sont répertoriées en annexe.

Les contrôleurs particulièrement puissants de la propagation de la tension dans les dendrites sont les canaux K de type A et les canaux h du redresseur anormal. Les deux types de canaux augmentent en densité loin du soma et peuvent fortement atténuer l'excitabilité électrique de la membrane (voir Figure 1b), restreignant la propagation des potentiels d'action de rétropropagation (bAP) et la génération et la propagation de pointes dendritiques. Abaisser le KUNE La densité donne une cellule beaucoup plus compacte sur le plan électrique dans laquelle les bAP se propagent avec peu d'atténuation (voir la figure 1c). Le courant h est également connu pour avoir un rôle de contrôle dans la génération de pointes de calcium dans les dendrites distales (Tsay, Dudman, & Siegelbaum, 2007).

La concentration en calcium est modélisée dans tous les compartiments. L'entrée du calcium se fait via les VGCC et, dans les têtes du rachis, via les canaux NMDA. La décroissance du calcium est modélisée comme un tampon instantané, ce qui limite le pic de calcium libre obtenu, et une décroissance exponentielle par rapport à la ligne de base en raison d'un tamponnage et d'une extrusion plus lents à travers la membrane par les pompes à calcium. L'amplitude et l'évolution temporelle des transitoires typiques du calcium de la tête de la colonne vertébrale sont basées sur les données de Sabatini, Oertner et Svoboda (2002). Selon ces données, l'extrusion du calcium est assez rapide, de sorte que les transitoires de calcium suivent approximativement les courants d'entraînement à travers les canaux NMDA et les VGCC.

Les synapses excitatrices sont formées sur des épines à deux compartiments (cou + tête) qui sont ajoutées aux branches dendritiques à des emplacements aléatoires. Pour minimiser les temps de calcul, seul le nombre maximal d'épines activées pour une simulation est ajouté dans une couche, qui est considéré comme étant de 500 dans chacun des stratum radiatum (SR), stratum oriens (SO) et stratum lacunosum-moleculare (SLM) . Un exemple de distribution aléatoire d'épines (et de synapses associées) dans chaque couche est illustré à la figure 1a.

L'excitation est médiée par des courants AMPA et NMDA colocalisés dans la tête de la colonne vertébrale. La conductance AMPA est modélisée sous la forme d'une double forme d'onde exponentielle, avec un temps de montée de 0,5 ms et un temps de descente de 3 ms. La conductance AMPA maximale est définie pour donner des EPSP isolées de la tête de la colonne vertébrale de l'ordre de 10 mV (Palmer & Stuart, 2009). La conductance NMDA est également modélisée sous la forme d'une double forme d'onde exponentielle, avec un temps de montée de 3 ms et un temps de descente de 100 ms. La conductance de crête NMDA est sensible à la tension en raison du bloc de magnésium. Un pourcentage (10 %) du courant NMDA est transporté par des ions calcium (Bloodgood & Sabatini, 2007). Le potentiel d'inversion des courants AMPA et NMDA est de 0 mV. Le rapport de la conductance de crête NMDA à AMPA est réglé légèrement plus grand dans SLM pour refléter la plus grande contribution connue des courants NMDA là-bas (Otmakhova & amp Lisman, 1998).

Le modèle a été simulé à l'aide de l'environnement logiciel NEURON (Carnevale & Hines, 2006) et le code source est disponible sur ModelDB (senselab.med.yale.edu/senselab/modeldb, numéro d'accession 154732).


Discussion

Les expériences présentées ici fournissent les premières observations de l'activation des canaux SK dans les épines et les dendrites des neurones pyramidaux corticaux au cours des bAP. Nous constatons que pendant bAP, les canaux SK régulent l'afflux de calcium dans les épines et les dendrites d'une manière dépendante de la distance, avec un impact plus important aux emplacements dendritiques distaux. En outre, nous montrons que les VDCC de type R présentent un contrôle étroit et spécifique de l'activation des canaux SK dans les épines pendant les bAP. En revanche, le couplage des canaux SK au niveau du soma aux VDCC est beaucoup moins spécifique, tous les VDCC connus, à l'exception des canaux de type R, jouant un rôle dans l'activation de SK pendant le mAHP.

Activation du canal SK dans les dendrites et les épines pendant les potentiels d'action

L'augmentation observée de l'afflux de calcium évoqué par bAP pendant le blocage des canaux SK est probablement due à une activation accrue des VDCC dans les épines et les dendrites suite à une augmentation de l'amplitude ou à un élargissement des bAP. Conformément à cette idée, il a récemment été observé que les canaux SK peuvent contrôler l'amplitude de la bAP dans les neurones cérébelleux de Purkinje (Ohtsuki et al., 2012). L'observation selon laquelle les canaux SK dendritiques peuvent influencer les bAP est surprenante étant donné que l'apamine n'a eu aucun impact sur la forme d'onde somatique AP, mais peut être due au couplage plus étroit des canaux SK dans les épines et les dendrites à leur source de calcium, accélérant leur activation par rapport aux canaux SK au soma. Des études antérieures indiquent que les canaux SK peuvent s'activer en une milliseconde lors de changements rapides du calcium intracellulaire à température ambiante (Xia et al., 1998), et devraient s'activer encore plus rapidement à des températures physiologiques. De plus, on pourrait s'attendre à ce que les canaux SK aient un impact plus important sur les bAP en raison de leur durée accrue par rapport aux AP somatiques (Stuart et al., 1997). Conformément à cette idée, l'impact des canaux SK sur les transitoires calciques évoqués par la bAP était le plus important aux emplacements dendritiques basaux distaux où la durée de la bAP est la plus longue (Kampa et Stuart, 2006 mais voir Antic, 2003). L'impact dépendant de la distance de l'apamine sur les transitoires calciques évoqués par bAP pourrait également être dû à des différences dans l'expression des canaux calciques de type SK ou R. Enfin, nous avons observé que le blocage des canaux SK provoquait une augmentation plus importante de l'afflux de calcium évoqué par bAP dans les épines par rapport aux dendrites. Bien que cet effet puisse également être dû à des différences dans l'expression des canaux calciques de type SK ou R, le rapport surface/volume plus important des épines par rapport aux dendrites est également susceptible d'y contribuer (Sabatini et al., 2002).

Quelle fonction possible les canaux SK dans les épines et les dendrites pourraient-ils remplir lorsqu'ils sont activés par les bAP ? La capacité des canaux SK dans les épines et les dendrites à contraindre l'amplitude et/ou la largeur des bAP devrait influencer l'activation des récepteurs NMDA pendant l'appariement EPSP-AP. Cet effet serait le plus important aux emplacements dendritiques distaux, où l'activation des récepteurs NMDA pendant les événements synaptiques est la plus prononcée (Branco et Häusser, 2011). Étant donné que les changements de force synaptique pendant la plasticité dépendante du temps de pointe (STDP) dépendent de l'activation du récepteur NMDA (Markram et al., 1997), l'impact des canaux SK sur l'évolution temporelle de la bAP peut jouer un rôle dans la définition de la fenêtre temporelle STDP ( Froemke et al., 2005 Letzkus et al., 2006), augmentant peut-être la fidélité de la détection de coïncidence pendant le STDP, en particulier aux emplacements dendritiques distaux.

Comme les canaux SK jouent un rôle important dans la régulation de la dynamique du calcium dendritique, on s'attendrait à ce que la modulation de ces canaux modifie l'excitabilité neuronale et la plasticité synaptique. Conformément à cette idée, la régulation à la baisse des canaux SK suite à l'activation des récepteurs muscariniques ou β-adrénergiques M1 dans les neurones pyramidaux CA1 (Buchanan et al., 2010 Giessel et Sabatini, 2010) et latéraux de l'amygdale (Faber et al., 2008), respectivement, augmente la force synaptique. Inversement, il a été démontré que les changements de force synaptique au cours de la plasticité synaptique sont associés à des changements dans la fonction du canal SK (Lin et al., 2008 Ohtsuki et al., 2012). Compte tenu du couplage spécifique des VDCC de type R aux canaux SK dans les épines, comme indiqué ici et précédemment (Bloodgood et Sabatini, 2007), la modulation des VDCC de type R suite à l'activation de D2 les récepteurs de la dopamine (Higley et Sabatini, 2010) pourraient fournir un autre mécanisme dans lequel l'activation des canaux SK dans les épines peut être régulée. Des preuves récentes indiquent que l'inhibition des épines dendritiques individuelles peut moduler l'afflux de calcium de la colonne vertébrale pendant les bAP de manière sélective (Chiu et al., 2013). Ces données suggèrent que la modulation des canaux SK dans les épines individuelles pourrait influencer sélectivement l'afflux de calcium dans ces épines uniquement pendant les bAP, bien que cet effet puisse être dominé par le recrutement progressif des canaux SK répartis sur toute la longueur d'une branche dendritique. Conformément à cette idée, l'impact de l'activation des canaux SK sur l'influx de calcium bAP augmentait avec la distance du soma (Fig. 1E,F).

Sources de calcium pour l'activation des canaux SK dans les épines dendritiques

Bien qu'il existe des preuves que les VDCC de type R contrôlent l'activation des canaux SK dans les épines lors d'événements de type EPSP évoqués par le déverrouillage du glutamate (Bloodgood et Sabatini, 2007), d'autres études ont suggéré que l'afflux de calcium via les récepteurs NMDA contribue à l'activation des canaux SK pendant les EPSP ( Faber et al., 2005 Ngo-Anh et al., 2005 Faber, 2010). Conformément à cette dernière idée, les récepteurs NMDA et les canaux SK sont colocalisés au sein de la densité postsynaptique dans les neurones pyramidaux CA1 (Lin et al., 2008). Parce que les canaux SK dans les épines modulent l'activation du récepteur NMDA (Faber et al., 2005 Ngo-Anh et al., 2005 Faber, 2010), qui fournit la principale source de calcium lors de l'activation synaptique (Kovalchuk et al., 2000 Sabatini et al., 2002), l'identification de la source de calcium entraînant l'activation des canaux SK dans les épines au cours des EPSP est compliquée. Cette complication n'existe pas dans nos expériences car l'activation des récepteurs NMDA au cours des bAP est négligeable (Koester et Sakmann, 2000 Sabatini et Svoboda, 2000 Bloodgood et Sabatini, 2007). Au cours des bAP, nous constatons que l'inhibition des VDCC de type R uniquement est suffisante pour bloquer l'activation des canaux SK. De plus, l'inhibition des VDCC de type N et P/Q, qui sont exprimés dans les épines avec les VDCC de type R et ont conduit à un afflux de calcium similaire pendant les bAP, n'a pas influencé l'activation des canaux SK. Cela indique un couplage étroit et spécifique entre les VDCC de type R et les canaux SK dans la tête de la colonne vertébrale. Cette conclusion est similaire à celle faite précédemment lors d'événements de type EPSP évoqués par le déverrouillage du glutamate dans les épines des neurones pyramidaux CA1 (Bloodgood et Sabatini, 2007). Ces données suggèrent que les VDCC de type R et les canaux SK dans la tête de la colonne vertébrale sont couplés dans des « nanodomaines », conformément aux observations précédentes montrant que seules des concentrations élevées du tampon calcique rapide et de haute affinité BAPTA sont capables d'interférer avec l'activation des canaux SK dans épines pendant les EPSP (Ngo-Anh et al., 2005).

Sources de calcium pour l'activation du canal SK pendant le mAHP

Les canaux SK contribuent au mAHP dans de nombreux types de cellules neuronales, y compris les neurones pyramidaux L5 (Schwindt et al., 1988 Sah et McLachlan, 1991 Faber et Sah, 2002 Womack et Khodakhah, 2003), bien que cela soit controversé dans les neurones pyramidaux CA1 (Stocker et al., 1999 Gu et al., 2008). La capacité de faibles concentrations de tampons calciques rapides (OGB-1) et lents (EGTA) à inhiber le mAHP dans les neurones pyramidaux corticaux L5 suggère que l'influx de calcium entraînant l'activation des canaux SK somatiques fonctionne dans un microdomaine plutôt que dans un nanodomaine ( Neher, 1998 Augustine et al., 2003 Eggermann et al., 2012), avec une distance de couplage supérieure à ∼150 nm. Conformément à cette idée, nous montrons que la composante dépendante du canal SK du mAHP dans les neurones L5 est contrôlée par tous les sous-types de VDCC connus, à l'exception des VDCC de type R, qui ne sont pas exprimés au niveau du soma. Le couplage entre les canaux SK somatiques et leur source de calcium dans les neurones L5 diffère de celui d'autres types de cellules, où la source de calcium pour l'activation des canaux SK pendant le mAHP a été liée à des sous-types VDCC spécifiques. Par exemple, dans le mésencéphale, l'activation des neurones dopaminergiques des canaux SK pendant le mAHP dépend uniquement des VDCC de type T (Wolfart et Roeper, 2002), alors que seuls les canaux de type L sont couplés aux canaux SK somatiques dans les neurones pyramidaux de l'hippocampe (Marrion et Tavalin , 1998). Les raisons de cette différence entre les types de cellules neuronales et pourquoi les canaux SK sont faiblement couplés à de multiples sources de calcium dans les neurones L5 ne sont pas claires. Enfin, il convient de noter que notre observation selon laquelle de faibles concentrations de l'indicateur de calcium OGB-1 bloquent le mAHP, augmentant le taux de décharge et favorisant le déclenchement en rafale, soulève la préoccupation que l'utilisation d'indicateurs de calcium de haute affinité pour étudier l'activité du réseau (Garaschuk et al., 2006) peut influencer par inadvertance l'excitabilité neuronale et donc la dynamique du réseau.

En conclusion, nous montrons que les canaux SK dans les épines et les dendrites sont activés par les bAP et agissent pour restreindre l'afflux de calcium dendritique et de la colonne vertébrale d'une manière dépendante de la distance. Cet effet des canaux SK devrait influencer le STDP, en particulier aux emplacements dendritiques distaux. De plus, nous fournissons des preuves que les canaux SK dans les épines et les dendrites sont fortement couplés à leur source de calcium, formant des nanodomaines avec des VDCC de type R. En revanche, les canaux SK au niveau du soma des neurones pyramidaux corticaux L5 sont faiblement couplés à de multiples sources de calcium, formant des microdomaines avec tous les VDCC connus à l'exception des canaux de type R. Ces résultats fournissent des preuves d'un couplage hétérogène et dépendant de l'emplacement des canaux SK aux VDCC au sein du même type de cellule neuronale. Une telle compartimentation exquise illustre le rôle contrasté que joue le calcium dans la régulation de l'excitabilité neuronale à différents emplacements cellulaires, même au sein du même neurone.


Conclusion

En résumé, nous avons créé une série de modèles incorporant la biochimie et l'électrophysiologie qui unifient les observations dans divers SCA. Ces modèles emploient plusieurs concepts et approches novateurs et fournissent un cadre pour l'étude non seulement des problèmes associés à IP3R1 ataxies, mais de divers SCA impliquant des mutations d'autres molécules du modèle, comme les canaux potassiques [65, 79, 101, 102] et calciques [29, 76, 77, 103].

Les résultats du modèle indiquent que, dans les modèles murins de divers ataxies associés à l'activité du canal calcique IP3R1, les peptides IC peuvent être utilisés pour stabiliser la concentration en calcium intracellulaire. De plus, la restauration de la libération normale de calcium dans le modèle ne modifie pas le réglage fin de la détection de coïncidence suggéré par Brown et al. [42]. L'hypothèse de la supersensibilité IP3R1 dans SCA1 est soutenue par des résultats de simulation. De plus, la régulation négative IP3R1 observée expérimentalement chez les souris SCA1 peut partiellement compenser la supersensibilité du récepteur. La régulation à la baisse par Homer et MyoVa est en outre compensatoire.Cependant, la régulation négative des protéines tampons calciques accélère la pathologie. Le modèle démontre que la libération de calcium médiée par IP3 dans le neurone de Purkinje pourrait activer le K voltage-dépendantCalifornie canaux, à savoir BK et IK, et donne un aperçu de l'interaction entre la sensibilité et l'abondance IP3R1 dans la fonction et le dysfonctionnement de la cellule de Purkinje. Les résultats aident à expliquer les découvertes expérimentales chez la souris et peuvent être utilisés pour faire des prédictions pour d'autres expériences, qui peuvent finalement être traduites en individus ataxiques avec des niveaux de protéine IP3R1 réduits ou une sensibilité accrue. L'abondance et la sensibilité d'IP3R1 sont des composants impliqués dans la signalisation calcique, mais en aucun cas les seuls facteurs impliqués dans les systèmes de signalisation de ces SCA.


La géométrie des épines dendritiques affecte la dynamique du calcium dans les neurones de l'hippocampe : théorie et expériences

Le rôle de la morphologie du rachis dendritique dans la régulation de la distribution spatio-temporelle de la concentration de calcium intracellulaire libre ([Ca 2+ ]je) a été examiné dans un modèle unique à symétrie axiale qui se concentre sur les interactions colonne vertébrale-dendrite, et les simulations du modèle ont été comparées au comportement de vraies épines dendritiques dans des neurones hippocampiques en culture. Un ensemble d'équations différentielles non linéaires décrit le comportement d'une tête d'épine dendritique sphérique, liée à une dendrite via un col d'épine cylindrique. Les mécanismes de manipulation du calcium (y compris les réserves internes, les tampons et les voies d'efflux) sont placés à la fois dans les dendrites et les épines. En réponse à une poussée de calcium, l'amplitude et l'évolution dans le temps de la réponse à la fois dans la colonne vertébrale et dans la dendrite mère varient en fonction de la longueur du cou de la colonne vertébrale, de sorte qu'un cou court augmente l'amplitude de la réponse dans la dendrite et les vitesses jusqu'à la récupération dans la tête de la colonne vertébrale. La généralité du modèle, construit à l'origine pour un cas de libération de calcium des réserves, a été testée dans des simulations d'afflux rapide de calcium à travers les canaux membranaires et a vérifié l'impact du cou de la colonne vertébrale sur la dynamique du calcium. Distributions spatiotemporelles de [Ca 2+ ]je, mesurés dans des épines dendritiques individuelles de neurones hippocampiques en culture injectés avec du Calcium Green-1, ont été surveillés avec un microscope confocal à balayage laser. Les balayages linéaires des épines et des dendrites à une résolution temporelle de <1 ms révèlent des augmentations transitoires simultanées de [Ca 2+ ]je dans les épines et leurs dendrites parentales après application de caféine ou lors de transitoires calciques spontanés associés à des décharges synaptiques ou potentielles d'action. L'ampleur des réponses dans les compartiments individuels, la disparité entre la colonne vertébrale et les dendrites et la distribution temporelle de [Ca 2+ ]je étaient différentes pour les épines à cou court et long, ce dernier étant plus indépendant de la dendrite, en accord avec la prédiction du modèle.


MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Isolation PBMC et génération de courant continu

Après consentement écrit des donneurs de plaquettes, des chambres de déleucocytation d'aphérèse, réalisées dans la banque de sang de l'hôpital Oswaldo Cruz (São Paulo, SP, Brésil), ont été collectées. Le comité d'éthique institutionnel de l'Institut des sciences biomédicales a approuvé le protocole. Les PBMC de ces chambres ont été séparées par centrifugation sur Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Suède). Les PBMC ont été remises en suspension dans du milieu AIM V (Gibco, Grand Island, NY, USA), ensemencées dans des flacons de culture cellulaire de 75 cm 2 et incubées une nuit à 37°C et 5% de CO2. Après une nuit d'incubation, les cellules non adhérentes ont été retirées, le milieu a été remplacé et du GM-CSF (50 ng/ml PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA) et de l'IL-4 (50 ng/ml PeproTech) ont été ajoutés. Après 5 jours, les cellules ont reçu un stimulus de maturation avec du TNF-α (50 ng/ml PeproTech). Les mDC ont été obtenues 48 h après activation. Pour la caractérisation phénotypique des cellules pendant la culture, Mo ont été récoltés après élimination des cellules non adhérentes au jour 0, et les iDC ont été récoltés avant le stimulus de maturation, au jour 5.

Détermination du phénotype membranaire des CD

Le phénotype membranaire des cellules au cours de la différenciation et de la maturation des CD a été déterminé par cytométrie en flux. Pour chaque condition, 2 × 10 5 cellules ont été marquées avec des anticorps marqués par fluorescence spécifiques des différentes molécules membranaires (HLA-DR, CD14, CD83, CD80, CD86, CD11c BD Biosciences, San Jose, CA, USA) et analysées dans un Cytomètre FACSCalibur (BD Biosciences) utilisant le logiciel FlowJo (Version 7.2.4 Tree Star, Ashland, OR, USA). Les cellules mortes ont été exclues de l'analyse en utilisant le kit LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Le RFI des marqueurs de surface a été calculé en divisant le MFI du groupe marqué par le MFI du groupe non marqué.

Transfection d'iDC avec siRNA

Pour chaque groupe, 5 µl d'iMAX (Invitrogen) ont été dilués dans 95 µl de milieu Opti-MEM (Invitrogen) et 1,5 µl d'une solution de siRNA 50 mM ont été dilués dans 98,5 µl d'Opti-MEM. Ensuite, les deux solutions ont été mélangées, incubées à température ambiante pendant 30 min et placées dans une plaque à six puits. Les iDC ont été récoltés et remis en suspension dans du milieu AIM V, complété par de l'IL-4 et du GM-CSF. Pour chaque traitement, 1 × 10 6 cellules (qui ont été remises en suspension dans 1,3 mL de milieu) ont été ensemencées dans une plaque à six puits, prétraitées avec 200 µl de complexe siRNA. Les cellules ont été activées avec du TNF-α, 4 h après transfection et analysées après 48 h.

Blocage CD83

Pour bloquer le CD83 membranaire dans les mDC, 100 ng de mAb CD83 (clone HB15e BD Biosciences) ont été ajoutés à 5 × 104 cellules. Après 20 min d'incubation à 4°C, les CD ont été lavées deux fois pour éliminer l'excès d'anticorps. Des anticorps IgG ont été utilisés comme contrôle.

Coloration mDC

Les mDC ont été récoltées et remises en suspension à une concentration de 1 × 10 6 cellules/mL dans du PBS, complétées avec 0,5 % de BSA et 5 mM de CellTracker Red CMPTX (Invitrogen). Les cellules ont été incubées à 37°C pendant 15 min, lavées deux fois et remises en suspension dans le tampon de dosage du calcium (composé de 1 mM de CaCl2, 130 mM NaCl, 4,6 mM KCl, 5 mM glucose et 20 mM HEPES) ou une solution de KEGTA (composée de 10 mM NaCl, 130 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM EGTA et 10 mM Na2CO3 Sigma, Saint-Louis, MO, États-Unis).

Chargement Fluo-4-AM

Les cellules T ont été isolées des PBMC non adhérentes par sélection négative avec des billes magnétiques du kit d'isolement des cellules Pan T (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne), selon les instructions du fabricant. Après purification, les cellules T ont été remises en suspension à 1 × 10 7 cellules/mL dans du PBS, additionnées de 0,5 % de BSA, incubées avec 1 M de Fluo-4-AM (Invitrogen) pendant 30 min à 28°C, lavées deux fois et remises en suspension dans le tampon de dosage du calcium à 1 × 10 6 cellules/mL.

Dosage de la mobilisation du calcium par cytométrie en flux

La fluorescence des cellules T colorées avec Fluo-4-AM a été acquise par cytométrie en flux pendant 60 s sans stimulus. Ensuite, des DC allogéniques colorées avec CellTracker Red CMPTX ont été ajoutées et les cellules ont été acquises pendant 240 s supplémentaires. L'ionomycine (Invitrogen) a été utilisée comme témoin positif. En utilisant le logiciel FlowJo (Version 7.2.4 Tree Star), les changements dans la médiane de fluorescence Fluo-4-AM dans les cellules T ont été calculés.

Dosage de mobilisation du calcium par fluorescence et microscopie confocale

Les DC colorées avec CellTracker Red CMPTX (Invitrogen) ont été ensemencées dans une boîte de Pétri, et des cellules T allogéniques ont été ajoutées lors de l'acquisition de la vidéo dans le microscope à fluorescence Nikon Eclipse Ti-S (Nikon, Melville, NY, USA) avec le logiciel NIS-Elements AR (Nikon) ou dans le microscope multifoton Zeiss LSM 780 (Zeiss, Oberkochen, Allemagne) avec le logiciel confocal ZEN (Zeiss). Les images ont été acquises pendant au moins 10 min.

Test de prolifération des lymphocytes T

Les cellules T purifiées ont été marquées avec 5 M de CFSE (Invitrogen) et cultivées en culture dans une plaque à fond en U à 96 puits, avec des mDC allogéniques à un rapport lymphocyte:DC de 10:1. Après 5 jours, les cellules ont été récoltées, colorées avec un anticorps anti-CD3 (BD ​​Biosciences), et analysées par cytométrie en flux. La prolifération des lymphocytes T a été évaluée par dilution CFSE.

Analyses statistiques

Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide de GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). L'effet de l'anticorps anti-CD83 a été analysé par paires t-test (*P<0.05 **P<0.01). Les comparaisons entre les résultats obtenus à partir de l'état de différenciation des DC et des expériences de knockdown CD83 ont été effectuées par ANOVA à sens unique avec le post-test de Tukey (*P<0.05 **P<0.01). Tous les graphiques montrent la moyenne ± sem.


RÉSULTATS ET DISCUSSION

Les DC expriment principalement STIM2 et non STIM1

Auparavant, nous avons démontré SOCE via les canaux CRAC dans des DC matures et immatures [1]. Pour déterminer les composants moléculaires de ICRAC dans ces cellules, nous avons analysé des DC purifiées (Fig. 1UNE et B) pour l'expression des protéines STIM et Orai. À l'aide de la RT-PCR, nous avons détecté des transcrits pour STIM1, STIM2 et Orai1–3 (données non présentées). Pour confirmer l'expression de la protéine, nous avons utilisé des lysats de DC pour effectuer une analyse Western blot (Figues. 1 et 2). Étonnamment, nous avons constaté que par rapport aux cellules T spléniques, les DC expriment de faibles niveaux de STIM1 (détectés comme une seule bande dans les DC et le cerveau et un doublet dans les cellules T à ∼ 85 kDa Fig. 1C). En revanche, nous avons trouvé une expression robuste de STIM2 (détectée comme une seule bande à ∼100 kDa Fig. 1C) dans ces cellules.

Expression des protéines STIM dans les DC murines. (A) Image en fond clair de DC dérivées de BM avec des processus dendritiques typiques (barre d'échelle d'origine, 20 m). (B) L'analyse par cytométrie en flux montre que les cultures enrichies étaient >90% positives pour le marqueur DC, CD11c. (C) Western blots montrant l'expression de STIM1 et (D) STIM2 dans les DC. Des lysats de cellules entières (30 g) ont été utilisés pour chaque échantillon. Un cerveau entier de souris et des cellules T de souris ont été utilisés comme témoins positifs. (E) Les transferts ont été dépouillés et sondés avec de la -actine comme contrôle de charge. BMDC, DC dérivé de BM.

Expression des protéines Orai dans les DC. Western blots montrant l'expression de (A) Orai1, (B) Orai2 et (C) Orai3 dans les CD et les cellules T. Des lysats de cellules entières (30 g) ont été utilisés pour chaque échantillon. Le cerveau entier de souris, les lymphocytes T et les lymphocytes T Jurkat ont été utilisés comme témoins positifs. Les transferts ont été dépouillés et sondés avec de la -actine comme témoin de charge. *Monomère et dimère de protéines Orai.

De même, nous avons trouvé une expression protéique différentielle des isoformes d'Orai (Fig. 2A-C). Notamment, les DC expriment des niveaux significativement inférieurs d'Orai1 et Orai3 par rapport aux cellules T. Pour Orai1, une seule bande immunoréactive a été détectée à ∼45 kDa (Fig. 2A), qui est probablement une forme glycosylée de la protéine monomère Orai1, comme démontré par Gwack et ses collègues [18]. Pour confirmer ce résultat, nous avons effectué un immunotransfert sur des lysats de cellules HEK293 exprimant myc-Orai-1 (Fig. 1A supplémentaire). Cette analyse a révélé une bande importante de 45 kDa. Orai3 a été détecté comme un monomère à 30 kDa et une bande plus importante à ∼60 kDa, ce qui représente probablement un dimère (Fig. 2C). Cette interprétation est étayée par notre analyse des cellules HEK293 exprimant Orai3 (Fig. 1C supplémentaire), dans lesquelles le traitement avec le DTT a produit une augmentation marquée de la bande monomère ∼30-kDa.

Contrairement aux autres protéines Orai, les DC expriment des niveaux relativement élevés d'Orai2 (Fig. 2B), détectée en tant que monomère à 28 kDa et une bande plus importante à ∼56 kDa représentant un dimère. L'analyse des cellules HEK293 exprimant Orai2 a révélé un modèle d'immunotransfert similaire (Fig. 1C supplémentaire). En outre, nous avons vu des bandes similaires avec un anticorps commercial anti-Orai2 différent (données d'Alomone Labs non présentées). Nous avons également confirmé l'expression d'Orai2 par immunocytochimie (Fig. 2B supplémentaire). Une étude précédente a identifié deux variants d'épissage d'Orai2 murin associés à des canaux CRAC fonctionnels [22]. À l'aide d'amorces spécifiques, nous avons détecté ces deux variantes d'épissage - Orai2 small et Orai2 large - dans les DC dérivées de la BM et spléniques (Fig. 2A supplémentaire).

En tant que support fonctionnel pour Orai2 dans les DC, nous avons exploré la sensibilité de SOCE au 2-APB. Des études récentes ont démontré que le 2-APB bloque de manière différentielle SOCE et ICRAC médiée par les différentes isoformes d'Orai 2-APB (50 M) inhibe complètement Orai1 et Orai2 mais n'affecte pas Orai3 [23, 24]. Bien que ces études aient été réalisées avec des canaux exprimés de manière hétérologue, cette sensibilité différentielle au 2-APB, néanmoins, peut s'avérer utile pour distinguer le rôle des isoformes d'Orai dans les tissus natifs. Nous avons constaté que le 2-APB (50 M) produisait une inhibition de près de 100 % de la SOCE (m=250) et un bloc ∼90% de ICRAC (–100mV m=8 Fig. 3 supplémentaire). De plus, en l'absence d'épuisement des réserves, le 2-APB produit une faible activation d'Orai1 et une activation robuste d'Orai3 mais n'a aucun effet sur Orai2 [24]. Fait intéressant, dans les DC, l'application 2-APB n'a pas réussi à produire une augmentation de Ca 2+ (Fig. 3C supplémentaire m=30). De plus, nous n'avons détecté aucun courant de cellule entière suite à l'application de 2-APB (Fig. 3D supplémentaire m=5). Ces données sont cohérentes avec un rôle primordial pour Orai2 dans SOCE et ICRAC dans les DC.

L'épuisement des réserves induit par la Tg favorise l'oligomérisation de STIM2

Des preuves récentes ont montré que l'agrégation de STIM1 est essentielle pour l'activation des canaux CRAC dans les cellules T Jurkat [9]. Nous avons donc testé s'il y a une agrégation de STIM1 ou, alternativement, STIM2 dans les DC en réponse à l'épuisement des magasins. 3UNE montre que les DC présentent une immunocoloration diffuse pour STIM1 (cohérente avec la faible expression de STIM1 dans ces cellules), et cela n'a pas été modifié par le traitement avec la Tg (2 M pendant 10 min). Nous avons trouvé que le même anticorps anti-STIM1 produisait une immunocoloration marquée des cellules T, confirmant la fonctionnalité de l'anticorps (Fig. 4A supplémentaire). Contrairement à STIM1, Tg a produit un motif ponctué d'immunocoloration STIM2 (Fig. 4B). Ainsi, STIM2 plutôt que STIM1 s'agrège lors de l'épuisement des magasins dans les DC.

Tg induit l'agrégation de STIM2. (A) Marquage par immunofluorescence des CD pour (A) STIM1 et (B) STIM2 dans des conditions de contrôle (non stimulées) et après traitement Tg (Tg stimulée 2 M pendant 10 min). Les cellules fixées ont été perméabilisées et colorées avec les anticorps STIM1 et STIM2 suivis d'un anticorps secondaire (conjugué au FITC), qui, à lui seul, a produit une coloration négligeable (voir la figure 2B supplémentaire).

Stim2 et Orai2 interagissent lors de l'épuisement du magasin

L'épuisement des réserves est connu pour produire des interactions physiques entre STIM1 et Orai1 natifs et exprimés de manière hétérologue [10–12]. Nos résultats montrant l'oligomérisation de STIM2 et l'expression prédominante d'Orai2 dans les CD nous ont amenés à examiner plus avant la possibilité d'interactions entre STIM2 et Orai2 en réponse à l'épuisement des réserves. Nous avons constaté que dans des conditions basales, STIM2 co-immunoprécipitait avec Orai2, et cette association augmentait nettement après un traitement avec Tg (4UNE et B). Étonnamment, nous n'avons détecté aucun STIM1 lorsque nous avons immunoprécipité avec un anticorps anti-Orai2 (Fig. 4A) ou anti-STIM2 (Fig. 4B). De manière significative, STIM2 et Orai2 n'ont pas co-immunoprécipité avec STIM1 (en utilisant l'anticorps anti-STIM1 Fig. 4C). Bien qu'Orai1 soit présent dans le complexe d'immunoprécipitation, ses niveaux n'ont pas été modifiés par le traitement par Tg (Fig. 4C). Ces résultats excluent donc la possibilité que STIM1 participe à l'augmentation robuste de l'association STIM2 et Orai2 suite à l'épuisement des magasins. De plus, peu d'Orai1 ou d'Orai3 s'associent à Orai2 dans les CD témoins et traités par Tg. Prises ensemble, ces données soutiennent l'hypothèse selon laquelle l'épuisement des réserves dans les CD déclenche l'oligomérisation de STIM2, qui à son tour, interagit avec Orai2.

Tg induit l'association de STIM2 et Orai2 mais pas STIM1. (A et B) Coimmunoprécipitation montrant l'association renforcée entre STIM2 et Orai2 lors du traitement par Tg. Bien que détectés dans le complexe d'immunoprécipitation (IP), les niveaux d'Orai1 ne sont pas augmentés par le traitement par Tg. (C) STIM2 et Orai2 ne sont pas présents dans la co-immunoprécipitation utilisant un anticorps STIM1. De plus, le traitement par Tg ne modifie pas les niveaux d'Orai1 dans ce complexe d'immunoprécipitation.

STIM2 et Orai2 en CD sont recrutés au SI

La présentation de l'antigène, la fonction principale des CD, se produit à une jonction spécialisée entre les CD et les cellules T - l'IS - qui facilite l'agrégation des complexes peptide-CMH de classe II et des TCR apparentés, ainsi que des molécules de costimulation, pour améliorer la stimulation des cellules T [ 25]. [Ca 2+ ]je la signalisation, qui joue un rôle important dans la présentation de l'antigène et l'activation des lymphocytes T, peut également être facilitée au niveau du SI. Récemment, Lioudyno et al. [14] ont décrit le mouvement d'Orai1 et STIM1 vers le SI dans les cellules T lors d'une stimulation avec des DC autologues pulsées par un superantigène (entérotoxine staphylococcique B). Nous avons donc demandé si STIM2 et Orai2 sont recrutés de manière similaire aux SI dans les CD. 5 montre que les DC pulsées avec des billes recouvertes d'ICAM1 ont déclenché la polymérisation de l'actine (coloration à la phalloïdine verte) et l'agrégation de STIM2 (rouge, figure 5B) et Orai2 (rouge, figure 5C) dirigée vers le site de contact. La co-agrégation de F-actine et STIM2/Orai2 apparaît comme une coloration jaune intense et était évidente dans la majorité des cellules étudiées (m>30). En revanche, l'actine et STIM2 ne se sont pas polarisés en billes recouvertes d'IgG seules (Fig. 5A, m>30), démontrant la spécificité du contact synaptique osseux. Nous avons également observé des concentrations plus faibles d'Orai-actine à distance de l'IS (Fig. 5C). Le mécanisme sous-jacent de ce schéma d'agrégation n'est pas clair, mais il est intéressant de noter que le CMH de classe II dans les CD s'agrège de manière similaire au SI et au pôle opposé [26, 27]. À titre de comparaison, nous avons exploré le trafic de STIM1 dans les cellules T. Comme indiqué précédemment, des cellules T pulsées avec des billes revêtues d'anti-CD3/CD28 ont produit une immunocoloration STIM1 marquée et une agrégation d'actine F au niveau de la zone de contact (Fig. 3B supplémentaire). Ensemble, nos données montrent que STIM2 et Orai2 sont recrutés dans le SI des DC.

Orai2 et STIM2 sont localisés au SI. Images confocales représentatives de l'immunomarquage STIM2 et ORAI2 dans les DC stimulées avec des billes enrobées d'IgG (A) ou d'ICAM-1 (B et C). Les cercles indiquent les positions des billes regroupées avec les DC (barres d'échelle d'origine, 15 um). Les cellules ont été comarquées avec de la F-actine [phalloidine (PL), verte] pour révéler la polarisation de l'actine vers les sites de contact. STIM2 (rouge) et ORAI2 (rouge) sont polarisés avec la F-actine sur la bille recouverte d'ICAM1, comme en témoigne la coloration fusionnée (jaune). L'immunocoloration a été évaluée par une notation en aveugle de >40 conjugués aléatoires provenant de trois expériences indépendantes.

Signification de la signalisation STIM2 et Orai2 dans les DC

La signalisation Ca 2+ est critique pour la maturation et la fonction des DC [2, 3]. Auparavant, nous avons montré que l'entrée de Ca 2+ dans les DC est principalement médiée par SOCE [1]. Ici, nous identifions les composants moléculaires pour la signalisation SOCE dans les DC : STIM2 et Orai2. De manière significative, cela représente le premier rapport de la signalisation SOCE indépendante de STIM1 dans les cellules immunitaires. Des études antérieures utilisant des lymphocytes T primaires, des cellules T Jurkat, des mastocytes RBL-2H3 et des systèmes d'expression ont rapporté que STIM1 était nécessaire et suffisant pour signaler l'épuisement des réserves du RE conduisant à SOCE [4, 5, 9, 13].En revanche, nous présentons plusieurs éléments de preuve plaidant contre le rôle de STIM1 dans les CD SOCE. Notamment, nous avons constaté que par rapport aux cellules T, les DC expriment des niveaux élevés de STIM2 et seulement de faibles niveaux de STIM1. On pourrait soutenir que même de faibles niveaux de STIM1 pourraient être suffisants pour déclencher SOCE. Cependant, nos données fonctionnelles et biochimiques ne supportent pas cette position. Premièrement, nous avons constaté que l'épuisement de la réserve ER Ca 2+ déclenche l'agrégation de STIM2 et non de STIM1. Deuxièmement, nous constatons que l'épuisement des réserves n'augmente pas les associations physiques entre les protéines STIM1 et Orai. De plus, STIM1 ne s'associe pas à Orai2 dans des conditions contrôlées ou stimulées. Au lieu de cela, nous constatons que l'épuisement des magasins augmente considérablement l'association entre STIM2 et Orai2. Ainsi, nos données indiquent que SOCE dans les DC est probablement déclenché par STIM2, qui à son tour, interagit avec Orai2.

Des études récentes sur les systèmes d'expression [15, 24, 28] indiquent que STIM2 possède la capacité de déclencher SOCE. De plus, la surexpression de STIM2 peut restaurer la SOCE dans les lymphocytes T [29] ou les fibroblastes [13], qui sont déficients en STIM1. La pertinence biologique de la SOCE déclenchée par STIM2 dans les cellules immunitaires n'est cependant pas claire, car le knockdown de STIM2 ne produit qu'une réduction mineure de la SOCE mesurée dans les cellules T et les fibroblastes [13]. Dans d'autres tissus, STIM2 semble jouer un rôle plus important dans SOCE. Par exemple, STIM2 semble être le déclencheur dominant de SOCE dans la délétion génétique cérébrale de STIM2 abolissant pratiquement SOCE dans les neurones [30]. De plus, STIM2 contribue à environ 50 % du SOCE dans les myoblastes et les myotubes humains [31]. Ces données et nos résultats actuels indiquent que STIM1 et STIM2 fonctionnent probablement de manière spécifique au tissu. On ne sait pas si ces protéines ont des propriétés fonctionnellement distinctes. Darbellay et al. [31] montrent que STIM1 et STIM2 sont fonctionnellement équivalents (au moins pour l'activation de SOCE), les effets de knockdown de l'une ou l'autre isoforme peuvent être sauvés par la surexpression de l'autre. D'autre part, Brandman et ses collègues [15] rapportent que STIM2 a une affinité globale réduite pour ER Ca 2+ par rapport à celle de STIM1. L'implication de cette découverte est qu'une diminution plus faible de ER Ca 2+ pourrait être suffisante pour activer STIM2 et déclencher SOCE. Dans les CD, cela pourrait conduire à une entrée de Ca 2+ améliorée, même en réponse à de faibles stimuli externes, une propriété qui pourrait aider la fonction immunitaire innée des CD. En plus de déclencher SOCE, STIM1 peut lier et activer divers canaux TRPC [32]. On ne sait pas si STIM2 partage cette propriété, bien que STIM1 et STIM2 contiennent une terminaison polylysine C impliquée dans l'activation électrostatique des canaux TRPC. Enfin, STIM1 natif, mais pas STIM2, peut s'insérer dans la membrane plasmique [33, 34], ce qui, bien que non essentiel pour la SOCE, peut contribuer à d'autres fonctions cellulaires telles que l'adhésion cellulaire. Ainsi, l'expression sélective de STIM2 dans les DC peut conduire à des propriétés cellulaires altérées indépendamment de SOCE.

Plusieurs études ont montré qu'Orai1 était la sous-unité essentielle du canal CRAC [6, 10, 17]. En revanche, nous montrons qu'Orai2 constitue l'isoforme majeure d'Orai dans les CD, et cela est basé sur l'expression d'Orai2, les interactions physiques avec STIM2 et la sensibilité caractéristique 2-APB. L'importance de la SOCE médiée par Orai2 dans les CD n'est pas claire. Bien que Orai1-3 possède des propriétés de canal similaires, y compris la conductance et la sélectivité ionique, ils présentent des propriétés de déclenchement différentes. Orai1-médié ICRAC montre une inactivation rapide induite par le Ca 2+ [35], non observée dans Orai2 [22]. En supposant que ces propriétés soient reproduites dans les tissus natifs, alors la SOCE médiée par Orai2 dans les CD peut être en mesure de maintenir une augmentation plus soutenue de [Ca 2+ ]je. En effet, les DC présentent des transitoires Ca 2+ prolongés en réponse à la stimulation des GPCR [1, 36], plutôt que le schéma oscillatoire, qui exprime Orai1, couramment observé dans les cellules T. De plus, les sous-unités Orai1 et Orai3 médient le courant dépendant de l'arachidonate observé dans de nombreuses cellules non excitables [37]. La rareté de ces protéines dans les CD suggère donc une sensibilité réduite à l'acide arachidonique inflammatoire.

De manière significative, nous montrons que STIM2 et Orai2 sont recrutés dans la synapse immunitaire DC lors de la stimulation avec ICAM-1. L'IS prend en charge le regroupement des molécules d'adhésion, du peptide-CMH de classe II et des molécules de costimulation et facilite les rencontres productives avec les cellules T [26, 38-40]. La formation du SI dans les DC s'accompagne d'une augmentation de [Ca 2+ ]je [41], ainsi que la polarisation de l'actine vers le site de contact des cellules T [26, 39]. Ca 2+ est probablement important pour ce réarrangement du cytosquelette. En effet, l'expression en surface du CMH de classe II et du CD86 dans les CD est inhibée par la chélation du Ca 2+ [3]. Nos données, montrant que les composants clés du cluster SOCE au SI, suggèrent que SOCE peut participer à l'initiation ou à la maintenance du SI et/ou de la signalisation SI. De futures études, espérons-le, aborderont ces questions.

En conclusion, nos données indiquent que STIM2 et Orai2 sont des molécules clés sous-jacentes à la SOCE dans les DC. De plus, nous montrons que STIM2 et Orai2 se regroupent au SI, suggérant que l'entrée focale de Ca 2+ régule les propriétés des synapses DC.


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