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4.11.7 : Virus à ADN double brin - Pox Virus - Biologie

4.11.7 : Virus à ADN double brin - Pox Virus - Biologie


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Les poxvirus sont une famille de grands virus à ADN complexes et enveloppés qui infectent une variété d'hôtes vertébrés et invertébrés.

Objectifs d'apprentissage

  • Examiner les virus de la variole pour leur pertinence pour les maladies humaines et la recherche

Points clés

  • Le plus célèbre des poxvirus était la variole. La variole est l'une des deux maladies infectieuses à avoir été éradiquées, l'autre étant la peste bovine, qui a été déclarée éradiquée en 2011.
  • La forme infectieuse la plus abondante et la plus simple de la particule de poxvirus, le virion mature, consiste en un génome d'ADN viral enfermé dans un noyau protéique et une membrane lipoprotéique externe.
  • Les poxvirus présentent un programme d'expression génique régulé dans le temps : les gènes précoces, intermédiaires et tardifs entraînent la réplication de l'ADN, suivie de l'expression des protéines structurelles nécessaires à l'assemblage du virion de la descendance.

Mots clés

  • recombinant: Ce terme fait référence à quelque chose formé en combinant des éléments existants dans une nouvelle combinaison. Ainsi, l'expression ADN recombinant fait référence à un organisme créé en laboratoire en ajoutant de l'ADN d'une autre espèce.
  • lipoprotéine: N'importe lequel d'un grand groupe de complexes de protéines et de lipides avec de nombreuses fonctions biochimiques.

Les poxvirus sont une famille de grands virus à ADN complexes et enveloppés qui infectent une variété d'hôtes vertébrés et invertébrés. Les poxvirus sont importants à la fois sur le plan médical et scientifique en raison de leur large distribution, de leur pathogénicité et de leur cycle de vie réplicatif cytoplasmique. Plusieurs membres éminents, dont le virus de la variole (agent causal de la variole), le virus du molluscum contagiosum (cause d'une infection cutanée courante chez les jeunes enfants et les adultes immunodéprimés) et le virus de la variole du singe (agent d'une maladie semblable à la variole dans certaines régions d'Afrique), sont de préoccupation considérable pour la santé publique et la biodéfense.

Le plus célèbre des poxvirus était la variole. La variole était une maladie infectieuse unique à l'homme, causée par l'une ou l'autre de deux variantes virales, la variole majeure et la variole mineure. La maladie est également connue sous les noms latins Variola ou Variola vera, qui est un dérivé du latin varius, signifiant « tacheté », ou varus, signifiant « bouton ». ” Le terme « variole » a été utilisé pour la première fois en Grande-Bretagne au 15e siècle pour distinguer la variole de la « grande vérole » (syphilis). Le dernier cas naturel de variole (Variola minor) a été diagnostiqué le 26 octobre 1977. Après des campagnes de vaccination tout au long du 19e et 20esiècles, l'Organisation mondiale de la santé (OMS) a certifié l'éradication de la variole en 1979. La variole est l'une des deux maladies infectieuses à avoir été éradiquée, l'autre étant la peste bovine, qui a été déclarée éradiquée en 2011.

Le poxvirus prototype et le plus étudié, le virus de la vaccine (VACV), sert de vaccin antivariolique efficace, de plate-forme pour les vaccins recombinants contre d'autres agents pathogènes et de vecteur d'expression génique efficace pour la recherche fondamentale. Le long de son génome d'ADN double brin d'environ 195 kpb, le VACV code pour environ 200 protéines, dont la fonction va de la synthèse d'ARN et d'ADN viral et de l'assemblage de virions à la modulation des défenses immunitaires de l'hôte.

La forme infectieuse la plus abondante et la plus simple de la particule de poxvirus, le virion mature (MV), consiste en un génome d'ADN viral enfermé dans un noyau protéique et une membrane lipoprotéique externe avec environ 60 et 25 protéines virales associées, respectivement. Après la fixation aux surfaces cellulaires et la fusion avec le plasma ou la membrane endosomale, la réplication du poxvirus est initiée par l'entrée du noyau viral dans le cytoplasme, où se déroulent toutes les étapes ultérieures du cycle de vie. Les noyaux de poxvirus abritent l'ARN polymérase virale dépendante de l'ADN et les facteurs de transcription nécessaires à l'expression des gènes précoces, qui constituent près de la moitié du génome viral et codent pour les protéines nécessaires à la réplication de l'ADN et à la transcription des gènes intermédiaires, ainsi qu'un grand nombre d'immunomodulateurs.

Les poxvirus présentent un programme d'expression génique régulé dans le temps, c'est-à-dire que l'expression de gènes précoces codant pour la réplication de l'ADN et de facteurs de transcription intermédiaires déclenche l'expression de gènes intermédiaires codant pour des facteurs de transcription spécifiques de gènes tardifs. Les produits géniques tardifs sont principalement constitués de protéines structurelles nécessaires à l'assemblage de virions descendants, ainsi que d'enzymes destinées à être incorporées dans des virions descendants, et utilisées pour l'expression génique précoce au cours du prochain cycle d'infection. L'assemblage du MV implique plus de 80 produits de gènes viraux. De plus, pendant le transit à travers le cytoplasme, un sous-ensemble de MV de la descendance acquiert deux bicouches membranaires supplémentaires, dont l'une est perdue lors de l'exocytose de la particule, pour donner le virion enveloppé (EV) moins abondant. Ainsi, un EV est essentiellement un MV avec une membrane supplémentaire dans laquelle au moins six protéines uniques sont associées. Les VE sont antigéniquement distincts des MV et sont importants pour une diffusion efficace du virus dans l'hôte infecté et une protection contre les défenses immunitaires. En revanche, les MV sont libérés lors de la lyse cellulaire et peuvent être importants pour la transmission d'animal à animal.


Des chercheurs découvrent comment les poxvirus tels que la variole évoluent rapidement - malgré de faibles taux de mutation

SEATTLE – 16 août 2012 – Les poxvirus, un groupe de virus contenant de l'ADN qui comprend la variole, sont responsables d'un large éventail de maladies chez les humains et les animaux. Ils sont très virulents et capables de franchir les barrières d'espèces, mais la manière dont ils le font est en grande partie un mystère en raison de leurs faibles taux de mutation.

Alors que la variole a été considérée comme officiellement éradiquée par l'Organisation mondiale de la santé en 1980, les inquiétudes concernant son utilisation comme agent de bioterrorisme - et la découverte que d'autres poxvirus, tels que le monkeypox, peuvent être transmis des animaux aux humains - ont suscité un regain d'intérêt pour comprendre comment ils reproduire. Avoir ces informations en main pourrait conduire à l'élaboration de meilleures stratégies antivirales.

De nouvelles recherches menées par des scientifiques du Fred Hutchinson Cancer Research Center et des institutions collaboratrices ont découvert comment les poxvirus évoluent pour s'adapter rapidement aux défenses de l'hôte - malgré leurs faibles taux de mutation.

La découverte fournit de nouvelles informations sur la façon dont les grands virus à ADN double brin échappent à l'immunité de l'hôte et deviennent résistants aux médicaments, et elle a des implications particulières pour la compréhension des mécanismes de transmission des maladies infectieuses entre les animaux et les humains.

L'auteur principal Harmit S. Malik, Ph.D., membre de la division des sciences fondamentales du Hutchinson Center, et le premier auteur Nels C. Elde, Ph.D., ancien chercheur postdoctoral dans le laboratoire de Malik, décrivent leurs découvertes en ligne avant le 17 août édition imprimée de Cellule.

"Les poxvirus codent une variété de gènes qui les aident à contrer les défenses immunitaires de l'hôte et à favoriser l'infection", a déclaré Elde, maintenant professeur adjoint de génétique humaine à la faculté de médecine de l'Université de l'Utah. "Malgré de nombreuses preuves que le génome du poxvirus peut subir des changements adaptatifs pour surmonter l'évolution des défenses de l'hôte, nous ne savons toujours pas grand-chose sur les mécanismes impliqués dans cette adaptation."

Pour déterminer les mécanismes d'adaptation, Elde, Malik et leurs collègues ont mené une expérience de culture cellulaire en utilisant le virus de la vaccine, le type de poxvirus utilisé dans le vaccin contre la variole, pour imiter l'adaptation et l'évolution virales telles qu'elles se produisent dans la nature.

Des recherches antérieures avaient démontré qu'une protéine de défense de l'hôte appelée protéine kinase R (PKR) est un obstacle majeur à l'infection par le poxvirus. En réponse, les poxvirus ont évolué pour surmonter la PKR en codant deux gènes, K3L et E3L, qui contrecarrent les mécanismes de défense de l'hôte qui empêchent normalement l'infection virale.

L'équipe a étudié comment le virus de la vaccine, lorsqu'il est modifié pour supprimer le gène E3L, a évolué pour se répliquer avec succès en présence de PKR humaine.

« De manière spectaculaire, la propagation en série de ce virus » plus faible « a rapidement donné lieu à des souches qui sont devenues beaucoup plus efficaces pour se répliquer dans les cellules humaines », a déclaré Malik, qui est également un scientifique en début de carrière au Howard Hughes Medical Institute.

Un examen plus approfondi de leur mode d'adaptation a révélé que le virus était rapidement capable de vaincre la PKR en augmentant sélectivement le nombre de copies du gène K3L dans son génome.

Malik a comparé cette adaptation rapide à l'expansion du soufflet d'un accordéon musical. "Au fur et à mesure que le nombre de copies K3L augmentait au cours des cycles de réplication suivants, l'expression de la protéine K3L et l'inhibition subséquente de la réponse immunitaire augmentaient également", a-t-il déclaré. Cela a montré que les virus qui peuvent étendre rapidement leur génome ont un avantage évolutif immédiat sur ceux qui ne le peuvent pas.

Dans une extension supplémentaire de l'analogie de l'accordéon, en plus d'observer une expansion génique rapide dans la souche de vaccine déficiente en E3L, les chercheurs ont également observé que le virus s'était contracté après avoir acquis une mutation adaptative, échangeant une mutation bénéfique contre une empreinte génomique plus petite.

"Nos études suggèrent que malgré leur nature transitoire, les expansions de gènes peuvent fournir un puissant moyen d'adaptation aux poxvirus, leur permettant de survivre à des défis immunitaires ou pharmacologiques", a déclaré Malik. « Reconnaître les moyens par lesquels ils subissent cette expansion peut fournir des stratégies antivirales plus efficaces contre ces agents pathogènes importants et connexes. »

Les National Institutes of Health, la National Science Foundation, le Howard Hughes Medical Institute et la Life Sciences Research Foundation ont financé la recherche. En plus des chercheurs du Hutchinson Center et de la faculté de médecine de l'Université de l'Utah, l'étude a également impliqué des collaborateurs de la faculté de médecine de l'Université de Washington.


Des chercheurs révèlent le fonctionnement interne d'un moteur d'emballage d'ADN viral

IMAGE: Un trio d'études a révélé le fonctionnement d'un moteur d'empaquetage d'ADN viral, fournissant potentiellement des informations pour de nouvelles thérapies ou des machines moléculaires synthétiques. Chacune des cinq protéines s'assemble. voir plus

Crédit : Joshua Pajak, Duke University

DURHAM, Caroline du Nord - Un groupe de chercheurs a découvert le fonctionnement interne détaillé du moteur moléculaire qui emballe le matériel génétique dans des virus à ADN double brin. L'avancée donne un aperçu d'une étape critique dans le cycle de reproduction de virus tels que la poxherpès et les adénovirus. Cela pourrait également inspirer les chercheurs créant des machines microscopiques basées sur des biomoteurs naturels.

La recherche a été menée par des scientifiques de l'Université Duke, de l'Université du Minnesota, de l'Université du Massachusetts et de l'Université du Texas Medical Branch (UTMB). Les résultats apparaissent en ligne dans une trilogie d'articles publiés dans Avancées scientifiques, Actes de l'Académie nationale des sciences et Recherche sur les acides nucléiques.

"Il y avait plusieurs informations manquantes qui nous ont empêchés de comprendre comment fonctionnent ces types de moteurs d'emballage d'ADN, ce qui a entravé notre capacité à concevoir des thérapies ou à faire évoluer de nouvelles technologies", a déclaré Gaurav Arya, professeur de génie mécanique et de science des matériaux, génie biomédical. et la chimie à Duke. "Mais avec de nouvelles connaissances et simulations, nous avons pu reconstituer un modèle de ce mécanisme fantastique, qui est le plus détaillé jamais créé pour ce type de système."

Les virus se présentent sous de nombreuses variétés, mais leur classification dépend généralement du fait qu'ils codent leurs modèles génétiques en ARN ou en ADN simple ou double brin. La différence est importante à bien des égards et affecte la façon dont le matériel génétique est emballé dans de nouveaux virus. Alors que certains virus construisent un conteneur de protéines appelé capside autour de l'ARN ou de l'ADN nouvellement produit, d'autres créent d'abord la capside, puis la remplissent de matériel génétique.

La plupart des virus à ADN double brin empruntent cette dernière voie, ce qui présente de nombreux défis. L'ADN est chargé négativement et ne veut pas être entassé dans un petit espace. Et il est emballé dans une structure extrêmement dense, presque cristalline, qui nécessite également beaucoup de force.

"L'avantage de ceci est que, lorsque le virus est prêt à infecter une nouvelle cellule, la pression aide à injecter de l'ADN dans la cellule une fois qu'elle est perforée", a déclaré Joshua Pajak, doctorant travaillant dans le laboratoire d'Arya. "Il a été estimé que la pression dépasse 800 PSI, ce qui est près de dix fois la pression dans une bouteille de champagne bouchée."

Forcer l'ADN dans une minuscule capside à cette pression nécessite un moteur extrêmement puissant. Jusqu'à récemment, les chercheurs n'avaient qu'une vague idée du fonctionnement de ce moteur en raison de la difficulté à le visualiser. Le moteur ne s'assemble que sur la particule virale, ce qui est énorme par rapport au moteur.

"Essayer de voir le moteur attaché au virus, c'est comme essayer de voir les détails de la torche de la Statue de la Liberté en prenant une photo de la statue entière", a déclaré Pajak.

Mais lors d'une récente conférence, Pajak a appris que Marc Morais, professeur de biochimie et de biologie moléculaire à l'UTMB, et Paul Jardine, professeur de diagnostic et de sciences biologiques à l'Université du Minnesota, travaillaient sur ce moteur depuis des années et disposaient de l'équipement et de compétences nécessaires pour voir les détails. Certains de leurs premiers résultats semblaient correspondre aux modèles que Pajak construisait avec le peu d'informations déjà disponibles. Le groupe est devenu enthousiaste à l'idée que leurs découvertes distinctes convergeaient vers un mécanisme commun et s'est rapidement mis à résoudre ensemble le mystère du moteur viral.

Dans un article publié en Avancées scientifiques, Morais et ses collègues ont résolu les détails de l'ensemble du moteur dans l'une de ses configurations. Ils ont découvert que le moteur est composé de cinq protéines liées les unes aux autres dans une formation en forme d'anneau. Chacune de ces protéines est comme deux ventouses avec un ressort entre les deux, ce qui permet à la partie inférieure de se déplacer verticalement dans une formation hélicoïdale afin qu'elle puisse s'accrocher à l'épine dorsale hélicoïdale de l'ADN.

"Parce que vous pourriez installer environ 100 000 de ces moteurs sur une tête d'épingle et qu'ils bougent tous, il s'est avéré difficile de bien les regarder", a déclaré Morais. "Mais après que mes collègues de l'UTMB Michael Woodson et Mark White nous ont aidés à les imager avec un microscope cryoélectronique, un cadre général du mécanisme s'est mis en place."

Dans un deuxième article, publié dans Recherche sur les acides nucléiques, le groupe Morais a capturé le moteur dans une seconde configuration en utilisant la cristallographie aux rayons X. Cette fois, les ventouses inférieures du moteur ont toutes été froissées ensemble dans un anneau plan, ce qui a amené les chercheurs à imaginer que le moteur pourrait déplacer l'ADN dans le virus en oscillant entre les deux configurations.

Pour tester cette hypothèse, Pajak et Arya ont effectué des simulations intensives sur Anton 2, le supercalculateur le plus rapide actuellement disponible pour exécuter des simulations de dynamique moléculaire. Leurs résultats ont non seulement soutenu le mécanisme proposé, mais ont également fourni des informations sur la façon dont les rouages ​​du moteur se contorsionnent entre les deux configurations.

Alors que les sommets des protéines restent statiquement attachés à la particule virale, leurs moitiés inférieures se déplacent de haut en bas selon un schéma cyclique alimenté par une molécule porteuse d'énergie appelée ATP. Une fois que toutes les protéines se sont déplacées vers le haut, entraînant l'ADN avec elles, les protéines libèrent le sous-produit de la réaction chimique de l'ATP. Cela amène l'anneau inférieur à libérer l'ADN et à revenir dans son état hélicoïdal d'origine, où il s'accroche à nouveau à plus d'ATP et d'ADN pour répéter le processus.

"Joshua a rassemblé de nombreux indices et informations pour créer ce modèle", a déclaré Arya. "Mais un modèle n'est utile que s'il peut prédire de nouvelles informations que nous ne connaissions pas déjà."

À la base, le modèle est une série d'actions mécaniques qui doivent s'emboîter et se dérouler dans un ordre séquentiel pour que tout fonctionne correctement. Les simulations de Pajak ont ​​prédit une série spécifique de signaux mécaniques qui indiquent à la base des protéines si elles doivent ou non saisir l'ADN. Comme une ligne de dominos tombant, la suppression d'une des voies de signalisation du milieu devrait arrêter la réaction en chaîne et bloquer le signal.

Pour valider cette prédiction, les chercheurs se sont tournés vers Jardine et ses collègues Shelley Grimes et Dwight Anderson pour voir si la suppression de l'un des dominos de signalisation arrêtait réellement le moteur d'empaqueter l'ADN. Un troisième article, publié dans PNAS, montre que le sabotage a fonctionné. Après avoir muté un domino dans la voie de signalisation afin qu'il soit incapable de fonctionner, le moteur pouvait toujours se lier et brûler du carburant aussi bien que jamais, mais c'était bien pire pour empaqueter l'ADN.

"Le nouveau mécanisme prédit par les structures à haute résolution et les prédictions détaillées ont fourni un niveau de détail plus grand que jamais auparavant", a déclaré Jardine. "Cela nous a permis de tester le rôle des composants critiques du moteur, et donc d'évaluer la validité de ce nouveau mécanisme tel que nous le comprenons actuellement."

Le résultat est une forte indication que le modèle est très proche de décrire comment le moteur se comporte dans la nature. Le groupe prévoit de poursuivre son approche structurelle, biochimique et de simulation hautement intégrée pour tester et affiner davantage le modèle proposé. Ils espèrent que cette compréhension fondamentale pourrait un jour être utilisée pour combattre la maladie ou créer un moteur moléculaire synthétique.

"Toute la technologie est inspirée par la nature d'une manière ou d'une autre", a déclaré Arya. "Maintenant que nous savons vraiment comment fonctionne ce moteur moléculaire, nous espérons qu'il inspirera d'autres chercheurs à créer de nouvelles inventions utilisant ces mêmes mécanismes."

Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (GM118817, GM122979, GM127365) et la National Science Foundation (MCB1817338). Les données cryo-EM ont également été collectées dans des installations d'imagerie cryo-EM régionales soutenues par les NIH (1U24 GM116787-01, 1U24 GM116792-01). Les simulations ont été réalisées sur le supercalculateur Anton 2 mis à disposition par D.E. Shaw Research et hébergé au Pittsburgh Supercomputing Center via le NIH (R01GM116961) et le supercalculateur Comet hébergé au San Diego Supercomputer Center via la NSF (ACI-1053575).

"Les ATPases d'emballage viral utilisent un commutateur de glutamate pour coupler l'activité ATPase et la translocation d'ADN." Joshua Pajak, Rockney Atz, Brendan J. Hilbert, Marc C. Morais, Brian A. Kelch, Paul Jardine et Gaurav Arya. PNAS, 27 avril 2021 118 (17) e2024928118. DOI : 10.1073/pnas.2024928118

"Un moteur d'emballage de génome viral passe d'une symétrie cyclique à une symétrie hélicoïdale pour transférer l'ADNdb", Michael Woodson, Joshua Pajak, Bryon P. Mahler, Wei Zhao, Wei Zhang, Gaurav Arya, Mark A. White, Paul J. Jardine et Marc C. Morais. Avancées scientifiques, 07 mai 2021 : Vol. 7, non. 19, eabc1955. DOI : 10.1126/sciadv.abc1955

"Base atomistique de la génération de force, de la translocation et de la coordination dans un moteur d'emballage du génome viral", Joshua Pajak, Erik Dill2, Emilio Reyes-Aldrete, Mark A. White, Brian A.Kelch, Paul J. Jardine, Gaurav Arya1 et Marc C. Morais. Recherche sur les acides nucléiques, 2021. DOI : 10.1093/nar/gkab372

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Des chercheurs révèlent le fonctionnement interne d'un moteur d'emballage d'ADN viral

Modèle 3D de l'ADN. Crédit : Michael Ströck/Wikimedia/ Licence de documentation libre GNU

Un groupe de chercheurs a découvert le fonctionnement interne détaillé du moteur moléculaire qui emballe le matériel génétique dans des virus à ADN double brin. Cette avancée donne un aperçu d'une étape critique du cycle de reproduction de virus tels que les virus de la variole, de l'herpès et des adénovirus. Cela pourrait également inspirer les chercheurs créant des machines microscopiques basées sur des biomoteurs naturels.

La recherche a été menée par des scientifiques de l'Université Duke, de l'Université du Minnesota, de l'Université du Massachusetts et de l'Université du Texas Medical Branch (UTMB). Les résultats apparaissent en ligne dans une trilogie d'articles publiés dans Avancées scientifiques, Actes de l'Académie nationale des sciences et Recherche sur les acides nucléiques.

"Il y avait plusieurs informations manquantes qui nous ont empêchés de comprendre comment fonctionnent ces types de moteurs d'emballage d'ADN, ce qui a entravé notre capacité à concevoir des thérapies ou à faire évoluer de nouvelles technologies", a déclaré Gaurav Arya, professeur de génie mécanique et de science des matériaux, génie biomédical. et la chimie à Duke. "Mais avec de nouvelles connaissances et simulations, nous avons pu reconstituer un modèle de ce mécanisme fantastique, qui est le plus détaillé jamais créé pour ce type de système."

Les virus se présentent sous de nombreuses variétés, mais leur classification dépend généralement du fait qu'ils codent leurs modèles génétiques en ARN ou en ADN simple ou double brin. La différence est importante à bien des égards et affecte la façon dont le matériel génétique est emballé dans de nouveaux virus. Alors que certains virus construisent un conteneur de protéines appelé capside autour de l'ARN ou de l'ADN nouvellement produit, d'autres créent d'abord la capside, puis la remplissent de matériel génétique.

Un trio d'études a révélé le fonctionnement d'un moteur d'empaquetage d'ADN viral, fournissant potentiellement des informations pour de nouvelles thérapies ou des machines moléculaires synthétiques. Chacune des cinq protéines se froisse à son tour, entraînant l'ADN avec elles, avant de se relâcher dans leur motif hélicoïdal d'origine. Crédit : Joshua Pajak, Duke University

La plupart des virus à ADN double brin empruntent cette dernière voie, ce qui présente de nombreux défis. L'ADN est chargé négativement et ne veut pas être entassé dans un petit espace. Et il est emballé dans une structure extrêmement dense, presque cristalline, qui nécessite également beaucoup de force.

"L'avantage de ceci est que, lorsque le virus est prêt à infecter une nouvelle cellule, la pression aide à injecter de l'ADN dans la cellule une fois qu'elle est perforée", a déclaré Joshua Pajak, doctorant travaillant dans le laboratoire d'Arya. "Il a été estimé que la pression dépasse 800 PSI, ce qui est près de dix fois la pression dans une bouteille de champagne bouchée."

Forcer l'ADN dans une minuscule capside à cette pression nécessite un moteur extrêmement puissant. Jusqu'à récemment, les chercheurs n'avaient qu'une vague idée du fonctionnement de ce moteur en raison de la difficulté à le visualiser. Le moteur ne s'assemble que sur la particule virale, ce qui est énorme par rapport au moteur.

"Essayer de voir le moteur attaché au virus, c'est comme essayer de voir les détails de la torche de la Statue de la Liberté en prenant une photo de la statue entière", a déclaré Pajak.

Mais lors d'une récente conférence, Pajak a appris que Marc Morais, professeur de biochimie et de biologie moléculaire à l'UTMB, et Paul Jardine, professeur de diagnostic et de sciences biologiques à l'Université du Minnesota, travaillaient sur ce moteur depuis des années et disposaient de l'équipement et de compétences nécessaires pour voir les détails. Certains de leurs premiers résultats semblaient correspondre aux modèles que Pajak construisait avec le peu d'informations déjà disponibles. Le groupe est devenu enthousiaste à l'idée que leurs découvertes distinctes convergeaient vers un mécanisme commun et s'est rapidement mis à résoudre ensemble le mystère du moteur viral.

Dans un article publié en Avancées scientifiques, Morais et ses collègues ont résolu les détails de l'ensemble du moteur dans l'une de ses configurations. Ils ont découvert que le moteur est composé de cinq protéines liées les unes aux autres dans une formation en forme d'anneau. Chacune de ces protéines est comme deux ventouses avec un ressort entre les deux, ce qui permet à la partie inférieure de se déplacer verticalement dans une formation hélicoïdale afin qu'elle puisse s'accrocher à l'épine dorsale hélicoïdale de l'ADN.

"Parce que vous pourriez installer environ 100 000 de ces moteurs sur une tête d'épingle et qu'ils bougent tous, il s'est avéré difficile de bien les regarder", a déclaré Morais. "Mais après que mes collègues de l'UTMB Michael Woodson et Mark White nous ont aidés à les imager avec un microscope cryoélectronique, un cadre général du mécanisme s'est mis en place."

Dans un deuxième article, publié dans Recherche sur les acides nucléiques, le groupe Morais a capturé le moteur dans une seconde configuration en utilisant la cristallographie aux rayons X. Cette fois, les ventouses inférieures du moteur ont toutes été froissées ensemble dans un anneau plan, ce qui a amené les chercheurs à imaginer que le moteur pourrait déplacer l'ADN dans le virus en oscillant entre les deux configurations.

Pour tester cette hypothèse, Pajak et Arya ont effectué des simulations intensives sur Anton 2, le supercalculateur le plus rapide actuellement disponible pour exécuter des simulations de dynamique moléculaire. Leurs résultats ont non seulement soutenu le mécanisme proposé, mais ont également fourni des informations sur la façon dont les rouages ​​du moteur se contorsionnent entre les deux configurations.

Alors que les sommets des protéines restent statiquement attachés à la particule virale, leurs moitiés inférieures se déplacent de haut en bas selon un schéma cyclique alimenté par une molécule porteuse d'énergie appelée ATP. Une fois que toutes les protéines se sont déplacées, entraînant l'ADN avec elles, les protéines libèrent le sous-produit de la réaction chimique de l'ATP. Cela amène l'anneau inférieur à libérer l'ADN et à revenir dans son état hélicoïdal d'origine, où il s'accroche à nouveau à plus d'ATP et d'ADN pour répéter le processus.

"Joshua a rassemblé de nombreux indices et informations pour créer ce modèle", a déclaré Arya. "Mais un modèle n'est utile que s'il peut prédire de nouvelles informations que nous ne connaissions pas déjà."

À la base, le modèle est une série d'actions mécaniques qui doivent s'emboîter et se dérouler dans un ordre séquentiel pour que tout fonctionne correctement. Les simulations de Pajak ont ​​prédit une série spécifique de signaux mécaniques qui indiquent à la base des protéines si elles doivent ou non saisir l'ADN. Comme une ligne de dominos tombant, la suppression d'une des voies de signalisation du milieu devrait arrêter la réaction en chaîne et bloquer le signal.

Pour valider cette prédiction, les chercheurs se sont tournés vers Jardine et ses collègues Shelley Grimes et Dwight Anderson pour voir si la suppression de l'un des dominos de signalisation arrêtait réellement le moteur d'empaqueter l'ADN. Un troisième article, publié dans PNAS, montre que le sabotage a fonctionné. Après avoir muté un domino dans la voie de signalisation afin qu'il soit incapable de fonctionner, le moteur pouvait toujours se lier et brûler du carburant aussi bien que jamais, mais c'était bien pire pour empaqueter l'ADN.

"Le nouveau mécanisme prédit par les structures à haute résolution et les prédictions détaillées ont fourni un niveau de détail plus grand que jamais auparavant", a déclaré Jardine. "Cela nous a permis de tester le rôle des composants critiques du moteur, et donc d'évaluer la validité de ce nouveau mécanisme tel que nous le comprenons actuellement."

Le résultat est une forte indication que le modèle est très proche de décrire comment le moteur se comporte dans la nature. Le groupe prévoit de poursuivre son approche structurelle, biochimique et de simulation hautement intégrée pour tester et affiner davantage le modèle proposé. Ils espèrent que cette compréhension fondamentale pourrait un jour être utilisée pour combattre la maladie ou créer un moteur moléculaire synthétique.

"Toute la technologie est inspirée par la nature d'une manière ou d'une autre", a déclaré Arya. "Maintenant que nous savons vraiment comment fonctionne ce moteur moléculaire, nous espérons qu'il inspirera d'autres chercheurs à créer de nouvelles inventions utilisant ces mêmes mécanismes."


Pathogénèse

Transmission de la grippe et mécanismes de la maladie

Les virus de la grippe sont transmis par de grosses gouttelettes respiratoires en toussant, en éternuant ou en parlant ou par contact avec des surfaces infectées [54]. Les virus de la grippe se lient aux fragments de sucre à la surface des cellules épithéliales des voies respiratoires où la réplication, la propagation et l'excrétion virales précoces se produisent au cours d'une période d'incubation moyenne de 1 jour [55 jours ». Le pic de réplication virale se produit généralement dans les 4 jours suivant l'apparition des symptômes et se résout en 7 jours, ce qui dure plus longtemps chez les enfants et les hôtes immunodéprimés [58 ». En moyenne une personne infecte —une à deux personnes supplémentaires cependant, ce nombre reproducteur (R0) varie selon la souche virale et les facteurs sociaux et environnementaux [61]. L'infection virale altère la barrière muqueuse des voies respiratoires et perturbe la membrane alvéolo-capillaire, ce qui contribue à la fuite de liquide et de cellules inflammatoires dans l'espace alvéolaire, ce qui altère les échanges gazeux entraînant une hypoxémie [62, 63]. La co-infection bactérienne complique souvent les cas graves contribuant à une insuffisance respiratoire et à la mort, avec Staphylococcus aureus et Espèces de streptocoques comme copathogènes prédominants [64]. L'infection par le virus de la grippe saisonnière est largement limitée aux voies respiratoires, cependant, les virus H5 et H7 HPAI ont un site de clivage polybasique au sein de l'hémagglutinine permettant une réplication en dehors des voies respiratoires [65, 66]. L'infection par une souche de grippe ne confère pas une immunité complète aux autres souches ou sous-types [67].

Transmission de la rougeole et mécanismes de la maladie

La rougeole fait partie des infections respiratoires les plus contagieuses, se propageant par exposition à de grosses gouttelettes respiratoires par la toux, les éternuements ou la parole par contact indirect avec des surfaces infectées ou par de petites gouttelettes infectieuses qui peuvent rester en suspension dans l'air jusqu'à 2 heures [10, 68 ]. Les cellules dendritiques des voies respiratoires, les lymphocytes et les macrophages alvéolaires sont des cibles précoces de l'infection où, pendant une période d'incubation moyenne de 8 à 12 jours, la rougeole se réplique et se propage aux lymphatiques locaux et à l'épithélium respiratoire, puis se dissémine dans le sang via les lymphocytes infectés vers les cellules épithéliales et endothéliales dans la plupart des organes [69&# x0201371]. La période infectieuse débute par l'apparition de la fièvre et se prolonge plusieurs jours après l'apparition de l'éruption cutanée [72]. Le R estimé0 de la rougeole dépend de la sensibilité de l'hôte et de facteurs sociaux et environnementaux [73]. La rougeole infecte et perturbe les tissus dans tout le corps. Cependant, la maladie grave est principalement due aux voies respiratoires inférieures et aux complications neurologiques [72]. L'infection naturelle de la rougeole confère une immunité à vie et le transfert passif d'anticorps maternels protège les nouveau-nés pendant la période postnatale précoce [74]. Les personnes qui se rétablissent d'une infection rougeoleuse courent un risque accru d'infection secondaire [75, 76].

Transmission du SRAS et du MERS-CoV et mécanismes de la maladie

Le SRAS-CoV est transmis par de grosses gouttelettes respiratoires et par contact avec des surfaces infectées. Les données épidémiologiques soutiennent également la transmission aéroportée de petites gouttelettes du SRAS-CoV bien que le R estimé0 de 0.86𠄱.83 s'oppose à ce qu'il s'agisse d'une voie de propagation prédominante [77, 78]. Le SRAS-CoV se lie aux récepteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACE)-2 sur les cellules épithéliales respiratoires, les pneumocytes et les macrophages alvéolaires, entraînant des lésions alvéolaires diffuses et une insuffisance respiratoire [79, 80]. Le SRAS est une infection systémique avec une virémie détectée dans la plupart des cas affectant plusieurs types de cellules et organes [81, 82]. L'insuffisance rénale aiguë est multifactorielle avec des signes de nécrose tubulaire aiguë, de vascularite et de fibrose glomérulaire, et les manifestations du système nerveux central sont au moins en partie attribuables à une infection directe des neurones entraînant un œdème et une dégénérescence [83].

Le MERS-CoV est transmis par de grosses gouttelettes respiratoires et par contact avec des surfaces infectées avec un R0 estimé de ρ à ϡ à l'extérieur et à l'intérieur des établissements de santé, respectivement [84]. Le MERS-CoV se lie à la dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) sur les cellules épithéliales respiratoires et les pneumocytes où il subit une réplication productive pendant une période d'incubation de 2 jours [16]. L'excrétion virale des voies respiratoires inférieures peut persister pendant des semaines [85, 86]. La virémie, bien que non documentée dans tous les cas, est associée à une maladie grave et à une infection productive des CD, et on pense que les macrophages facilitent la dérégulation immunitaire [87, 88]. DPP4 est largement exprimé sur les cellules en dehors du poumon, cependant, peu de données d'autopsie sont disponibles pour définir la distribution virale [16, 89].

Transmission du virus variolique et mécanismes de la maladie

Le VARV est principalement transmis par de grosses gouttelettes respiratoires et dans une moindre mesure par contact avec des objets contaminés tels que des croûtes, de la literie ou des vêtements ou par de petites gouttelettes respiratoires en suspension dans l'air [90, 91]. On pense que le VARV se réplique dans l'épithélium des voies aériennes et se propage aux ganglions lymphatiques régionaux [92, 93]. Le VARV se réplique dans les ganglions lymphatiques et se dissémine par la circulation sanguine en semant des vues distantes, notamment la peau, la rate, la moelle osseuse, le foie, les reins et d'autres organes [94]. La fièvre se manifeste après une incubation moyenne de 12 jours et une éruption cutanée suit la fièvre de 3 jours, parallèlement à une excrétion virale de haut niveau des sécrétions oropharyngées [95, 96]. Le R estimé0 de la variole est compris entre 3,5 et 6 [97]. La virémie de haut niveau est détectée plus souvent avec la variole hémorragique par rapport à la variole de type ordinaire, bien que les mécanismes exacts de la défaillance d'organe observé dans les cas mortels ne soient pas bien définis [98�].


Des chercheurs révèlent le fonctionnement interne d'un moteur d'emballage d'ADN viral

Un groupe de chercheurs a découvert le fonctionnement interne détaillé du moteur moléculaire qui emballe le matériel génétique dans des virus à ADN double brin. L'avancée donne un aperçu d'une étape critique dans le cycle de reproduction de virus tels que la poxherpès et les adénovirus. Cela pourrait également inspirer les chercheurs créant des machines microscopiques basées sur des biomoteurs naturels.

La recherche a été menée par des scientifiques de l'Université Duke, de l'Université du Minnesota, de l'Université du Massachusetts et de l'Université du Texas Medical Branch (UTMB). Les résultats apparaissent en ligne dans une trilogie d'articles publiés dans Science Advances, Proceedings of the National Academy of Sciences et Nucleic Acids Research.

« Il manquait plusieurs éléments d'information qui nous empêchaient de comprendre le fonctionnement de ces types de moteurs d'emballage d'ADN, ce qui entravait notre capacité à concevoir des thérapies ou à faire évoluer de nouvelles technologies », a déclaré Gaurav Arya, professeur de génie mécanique et de science des matériaux, génie biomédical. et la chimie à Duke. "Mais avec de nouvelles connaissances et simulations, nous avons pu reconstituer un modèle de ce mécanisme fantastique, qui est le plus détaillé jamais créé pour ce type de système."

Les virus se présentent sous de nombreuses variétés, mais leur classification dépend généralement du fait qu'ils codent leurs modèles génétiques en ARN ou en ADN simple ou double brin. La différence est importante à bien des égards et affecte la façon dont le matériel génétique est emballé dans de nouveaux virus. Alors que certains virus construisent un conteneur de protéines appelé capside autour de l'ARN ou de l'ADN nouvellement produit, d'autres créent d'abord la capside, puis la remplissent de matériel génétique.

"Essayer de voir le moteur attaché au virus, c'est comme essayer de voir les détails de la torche de la Statue de la Liberté en prenant une photo de la statue entière."

Josué Pyjak.

La plupart des virus à ADN double brin empruntent cette dernière voie, ce qui présente de nombreux défis. L'ADN est chargé négativement et ne veut pas être entassé dans un petit espace. Et il est emballé dans une structure extrêmement dense, presque cristalline, qui nécessite également beaucoup de force.

"L'avantage de cela est que, lorsque le virus est prêt à infecter une nouvelle cellule, la pression aide à injecter de l'ADN dans la cellule une fois qu'elle est perforée", a déclaré Joshua Pajak, doctorant travaillant dans le laboratoire d'Arya. « Il a été estimé que la pression dépasse 800 PSI, soit près de dix fois la pression dans une bouteille de champagne bouchée. »

Forcer l'ADN dans une minuscule capside à cette pression nécessite un moteur extrêmement puissant. Jusqu'à récemment, les chercheurs n'avaient qu'une vague idée du fonctionnement de ce moteur en raison de la difficulté à le visualiser. Le moteur ne s'assemble que sur la particule virale, ce qui est énorme par rapport au moteur.

"Essayer de voir le moteur attaché au virus, c'est comme essayer de voir les détails de la torche de la Statue de la Liberté en prenant une photo de la statue entière", a déclaré Pajak.

Mais lors d'une récente conférence, Pajak a appris que Marc Morais, professeur de biochimie et de biologie moléculaire à l'UTMB, et Paul Jardine, professeur de diagnostic et de sciences biologiques à l'Université du Minnesota, travaillaient sur ce moteur depuis des années et disposaient de l'équipement et de compétences nécessaires pour voir les détails. Certains de leurs premiers résultats semblaient correspondre aux modèles que Pajak construisait avec le peu d'informations déjà disponibles. Le groupe est devenu enthousiaste à l'idée que leurs découvertes distinctes convergeaient vers un mécanisme commun et s'est rapidement mis à résoudre ensemble le mystère du moteur viral.

Dans un article publié dans Science Advances, Morais et ses collègues ont résolu les détails de l'ensemble du moteur dans l'une de ses configurations. Ils ont découvert que le moteur est composé de cinq protéines liées les unes aux autres dans une formation en forme d'anneau. Chacune de ces protéines est comme deux ventouses avec un ressort entre les deux, ce qui permet à la partie inférieure de se déplacer verticalement dans une formation hélicoïdale afin qu'elle puisse s'accrocher à l'épine dorsale hélicoïdale de l'ADN.

« Parce que vous pourriez installer environ 100 000 de ces moteurs sur la tête d'une épingle et qu'ils bougent tous, il s'est avéré difficile de les regarder de près », a déclaré Morais."Mais après que mes collègues de l'UTMB Michael Woodson et Mark White nous ont aidés à les imager avec un microscope cryoélectronique, un cadre général du mécanisme s'est mis en place."

Dans un deuxième article, publié dans Nucleic Acids Research, le groupe Morais a capturé le moteur dans une deuxième configuration en utilisant la cristallographie aux rayons X. Cette fois, les ventouses inférieures du moteur ont toutes été froissées ensemble dans un anneau plan, ce qui a amené les chercheurs à imaginer que le moteur pourrait déplacer l'ADN dans le virus en oscillant entre les deux configurations.

« Joshua a rassemblé de nombreux indices et informations pour créer ce modèle. Mais un modèle n'est utile que s'il peut prédire de nouvelles informations que nous ne connaissions pas déjà. »

gaurav arya

Pour tester cette hypothèse, Pajak et Arya ont effectué des simulations intensives sur Anton 2, le supercalculateur le plus rapide actuellement disponible pour exécuter des simulations de dynamique moléculaire. Leurs résultats ont non seulement soutenu le mécanisme proposé, mais ont également fourni des informations sur la façon dont les rouages ​​du moteur se contorsionnent exactement entre les deux configurations.

Alors que les sommets des protéines restent statiquement attachés à la particule virale, leurs moitiés inférieures se déplacent de haut en bas selon un schéma cyclique alimenté par une molécule porteuse d'énergie appelée ATP. Une fois que toutes les protéines se sont déplacées, entraînant l'ADN avec elles, les protéines libèrent le sous-produit de la réaction chimique de l'ATP. Cela amène l'anneau inférieur à libérer l'ADN et à revenir dans son état hélicoïdal d'origine, où il s'accroche à nouveau à plus d'ATP et d'ADN pour répéter le processus.

"Joshua a rassemblé de nombreux indices et informations pour créer ce modèle", a déclaré Arya. "Mais un modèle n'est utile que s'il peut prédire de nouvelles informations que nous ne connaissions pas déjà."

À la base, le modèle est une série d'actions mécaniques qui doivent s'emboîter et se dérouler dans un ordre séquentiel pour que tout fonctionne correctement. Les simulations de Pajak ont ​​prédit une série spécifique de signaux mécaniques qui indiquent à la base des protéines si elles doivent ou non saisir l'ADN. Comme une ligne de dominos tombant, la suppression d'une des voies de signalisation du milieu devrait arrêter la réaction en chaîne et bloquer le signal.

"Toute la technologie s'inspire de la nature d'une manière ou d'une autre. Maintenant que nous savons vraiment comment fonctionne ce moteur moléculaire, nous espérons qu'il inspirera d'autres chercheurs à créer de nouvelles inventions utilisant ces mêmes mécanismes."

gaurav arya

Pour valider cette prédiction, les chercheurs se sont tournés vers Jardine et ses collègues Shelley Grimes et Dwight Anderson pour voir si la suppression de l'un des dominos de signalisation arrêtait réellement le moteur d'empaqueter l'ADN. Un troisième article, publié dans PNAS, montre que le sabotage a fonctionné. Après avoir muté un domino dans la voie de signalisation afin qu'il soit incapable de fonctionner, le moteur pouvait toujours se lier et brûler du carburant aussi bien que jamais, mais c'était bien pire pour empaqueter l'ADN.

"Le nouveau mécanisme prédit par les structures à haute résolution et les prédictions détaillées ont fourni un niveau de détail plus grand que jamais auparavant", a déclaré Jardine. "Cela nous a permis de tester le rôle des composants critiques du moteur, et donc d'évaluer la validité de ce nouveau mécanisme tel que nous le comprenons actuellement."

Le résultat est une forte indication que le modèle est très proche de décrire comment le moteur se comporte dans la nature. Le groupe prévoit de poursuivre son approche structurelle, biochimique et de simulation hautement intégrée pour tester et affiner davantage le modèle proposé. Ils espèrent que cette compréhension fondamentale pourrait un jour être utilisée pour combattre la maladie ou créer un moteur moléculaire synthétique.

"Toute la technologie est inspirée par la nature d'une manière ou d'une autre", a déclaré Arya. "Maintenant que nous savons vraiment comment fonctionne ce moteur moléculaire, nous espérons qu'il inspirera d'autres chercheurs à créer de nouvelles inventions utilisant ces mêmes mécanismes."

Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (GM118817, GM122979, GM127365) et la National Science Foundation (MCB1817338). Les données cryo-EM ont également été collectées dans des installations d'imagerie cryo-EM régionales soutenues par les NIH (1U24 GM116787-01, 1U24 GM116792-01). Les simulations ont été réalisées sur le supercalculateur Anton 2 mis à disposition par D.E. Shaw Research et hébergé au Pittsburgh Supercomputing Center via le NIH (R01GM116961) et le supercalculateur Comet hébergé au San Diego Supercomputer Center via la NSF (ACI-1053575).

"Les ATPases d'emballage viral utilisent un commutateur de glutamate pour coupler l'activité ATPase et la translocation d'ADN." Joshua Pajak, Rockney Atz, Brendan J. Hilbert, Marc C. Morais, Brian A. Kelch, Paul Jardine et Gaurav Arya. PNAS, 27 avril 2021 118 (17) e2024928118. DOI : 10.1073/pnas.2024928118


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4.11.7 : Virus à ADN double brin - Pox Virus - Biologie

Bienvenue sur ma page Pox Virus ! Ce site Web a été créé pour un cours à l'Université de Stanford intitulé Human Biology 115: Humans and Viruses, enseigné par le Dr Robert Siegel. Cliquez ici pour des liens vers des sites Web sur d'autres familles de virus humains.

Cette page se concentre sur la variole, qui, depuis le début de l'histoire, a provoqué des épidémies dévastatrices dans le monde entier. Cependant, en octobre 1977, après de vigoureux efforts de l'Organisation mondiale de la santé, cette maladie est devenue la première à être complètement éradiquée.

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Les virus de la variole sont les plus gros et les plus complexes de tous les virus. En fait, ils sont assez grands, avec une taille de virion de 220-350 x 115-260 nm, pour être vus au microscope optique. Ils infectent un large éventail d'hôtes et sont divisés en deux sous-familles : les Chordopoxvirinae et les Entomopoxviridae. Tous les poxvirus humains appartiennent à la sous-famille des Chordopoxovirinae et la plupart d'entre eux appartiennent soit au genre Orthopoxvirus (variole, vaccine, cow pox) soit au genre Parapoxvirus (virus Orf). Le virus de la varicelle n'appartient pas à cette famille ! - C'est un herpèsvirus.

  • génome: ADN double brin, monopartite, linéaire, non infectieux code pour plus de 100 gènes, y compris la transcripase d'ARN dépendante de l'ADN
  • morphologie: nucléocapside "complexe", ovoïde ou en brique
  • enveloppe: les orthopox sont enveloppés, les parapox ne sont pas
  • réplication: a lieu dans le cytoplasme
  • gamme d'hôtes: la gamme d'hôtes varie selon les virus spécifiques les zoonoses sont courantes, mais la variole n'infecte que les humains
  • oncogénicité: peut provoquer des tumeurs bénignes
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Les virus de la variole se propagent le plus souvent par contact direct. Dans le cas de la variole, le virus se trouve dans les lésions des voies respiratoires supérieures, qui peuvent être transmises à d'autres dans les sécrétions de gouttelettes et dans les lésions cutanées. Bien que le virus soit considéré comme hautement contagieux, cette voie de transmission rend sa propagation relativement lente.

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L'infection par un poxvirus entraîne une immunité à médiation cellulaire. Les personnes infectées par la variole sont généralement immunisées contre la maladie pour le reste de leur vie.

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  • Poxvirus, avec des diagrammes impressionnants du génome et du processus de réplication.
  • Virus POX humains, avec des photographies en gros plan de la variole.
  • Famille : Poxviridae
  • VIRUS POX
  • Edouard Jenner (1749-1823)
  • Les Pocke

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  • Dulbecco R et Ginsberg HS. Virologie (2e éd.), Philadelphie : J.B. Lippincott Company, 1988, pp. 179-191.
  • Leland DS. Virologie clinique, Philadelphie : W.B. Société Saunders, 1996, p. 152-3.
  • Metselaar D et Simpson DIH. Virologie pratique pour étudiants et praticiens en médecine dans les pays tropicaux, Oxford : Oxford University Press, 1982, p. 37, 173-83.
  • Siegel R, M.D., Ph.D.
  • Blanc DO et Fenner FJ. Virologie médicale (3e éd.), Orlando : Academic Press, 1986, pp. 278-280, 433-443.

Créé par Jennifer Yuan, Biologie humaine, promotion 1998
Université de Stanford, Stanford, Californie
Dernière modification : 17 février 1999


Reconnaissance par anticorps des protéines d'enveloppe du virus de la vaccine immunodominantes

Le virus de la vaccination (VACV) est un virus à ADN double brin enveloppé et l'ingrédient actif du vaccin antivariolique. L'administration systématique de ce vaccin a permis d'éradiquer la variole circulante (virus variolique, VARV) de la population humaine. En hommage à son succès, la vaccination mondiale a pris fin à la fin des années 1970. L'efficacité du vaccin est attribuée à une production robuste d'anticorps protecteurs contre plusieurs protéines d'enveloppe du VACV, qui assurent une protection croisée contre l'infection par le VARV pathogène. Depuis la fin de la vaccination mondiale, la plupart des enfants et des jeunes adultes ne possèdent pas d'immunité contre la variole. C'est une préoccupation, car la variole est considérée comme une arme biologique potentielle. Bien que le vaccin antivariolique soit considéré comme le gold standard de tous les vaccins et que les antigènes ciblés aient été largement étudiés, les épitopes ciblés par les anticorps protecteurs et leur mécanisme de liaison étaient, jusqu'à récemment, mal caractérisés. Comprendre l'interaction précise entre les anticorps et leurs épitopes sera utile dans la conception de meilleurs vaccins contre d'autres maladies. Dans cette revue, nous discuterons de la base structurelle de la reconnaissance des antigènes VACV immunodominants A27, A33, D8 et L1 par des anticorps protecteurs et discuterons des implications potentielles concernant leur capacité de protection.

Mots clés: Anticorps Complexes anticorps-antigène Vaccination Cristallographie aux rayons X du virus de la vaccination.


RÉSULTATS

La variole recombinante K7L est une protéase dimère

Le K7L marqué GST a été exprimé en E. coli sous forme de protéine soluble (1 mg/litre de culture bactérienne), purifiée et clivée avec de la thrombine comme décrit sous « Procédures expérimentales » (voir Fig. 1). K7L a migré sur SDS-PAGE avec la taille attendue de 45 kDa ( Fig. 1 B). La chromatographie d'exclusion stérique a suggéré une masse moléculaire de 75&# x0201380 kDa, plus compatible avec l'homodimérisation en solution ( Fig. 1 C). Ceci a été corroboré par des expériences de réticulation, qui ont démontré un dimère mais pas de polymères d'ordre supérieur (Fig. 1 B). L'ultracentrifugation analytique (qui n'est pas affectée par la forme moléculaire) a confirmé que le K7L existe sous la forme d'un dimère assez fort soit en l'absence soit en présence de 25 % de glycérol (Fig. 2 supplémentaire), avec K valeurs de 0,4 ± 0,2 μ m (pas de glycérol) et 0,2 ± 0,1 μ m (25 % de glycérol). Aux concentrations utilisées dans nos tests d'activité, K7L devrait donc être principalement dimérique. K7L pourrait être stocké pendant plusieurs mois dans du glycérol à 50 % à � ଌ ou � ଌ sans perte d'activité protéolytique. Cependant, l'enzyme a perdu son activité à des températures plus élevées, avec une demi-vie de 𢏅 h à 23 ଌ et � min à 37 ଌ. Les mesures d'activité ont donc été effectuées à 20� ଌ.

Les cibles signalées de K7L sont P25K, P4a et P4b. Pour déterminer l'activité de la K7L recombinante, nous l'avons incubée avec in vitro les protéines P25K, P4a et P4b traduites exprimées à partir de constructions codant pour les protéines de la vaccine hautement similaires (parce que l'ADN variolique n'était pas disponible). La variole et la vaccine P25K, P4a et P4b diffèrent d'entre 1𠄳%, et toutes les différences de séquence sont éloignées des sites de clivage voir alignements supplémentaires. Étant donné que les séquences présentent un degré d'identité si élevé, il est très probable que l'activité de la variole K7L envers les protéines de la vaccine serait essentiellement identique au clivage des protéines de la variole correspondantes. Les tests d'activité ont été effectués en présence de 40 % de glycérol (Fig. 2). Il existe un site de clivage putatif dans P4b (Gly 60 ↓Ser 61 ) et deux dans P25K (Gly 18 ↓Ser 19 et Gly 32 𡤺la 33 ). En accord, nous avons observé deux produits de clivage de la masse moléculaire attendue pour P25K (32 et 30 kDa Fig. 2 C) et un pour P4b (64 kDa Fig. 2 ). Le clivage de l'un des sites P25K était particulièrement rapide, et nous avons observé un clivage plus lent de l'autre site et de P4b par K7L. En revanche, P4a n'a pas été clivé par K7L dans nos conditions expérimentales (Fig. 2 E).

Cibles virales présumées de K7L et leurs in vitro modèles de clivage. UNE, P4a, P4b, P25K et P17K sont des protéines de noyau viral, tandis que P21K est la protéine membranaire d'enveloppe. Noms alternatifs basés sur les gènes (en parenthèses) sont donnés ainsi que les sites de clivage putatifs et leurs numéros de résidus. B, l'alignement des sites de clivage est montré. Les résidus acides qui ont amélioré le clivage sont dans gras. C, , et E, les plasmides codant pour les protéines indiquées ont été transcrits et traduits in vitro. Le recombinant GST-K7L a été ajouté pendant les durées indiquées, et la réaction a été interrompue par ébullition dans du tampon d'échantillon SDS. Des gels SDS-PAGE ont été développés avec de la streptavidine-HRP pour révéler les protéines substrats traitées et non traitées. Les bandes communes aux gels P4b et P4a appartiennent à des protéines non spécifiquement colorées. Les réactions de clivage ont utilisé 0,3 μ m GST-K7L à 25 ଌ dans 50 m m NaCl, 2 m m DTT, 30 m m Tris, pH 8,0, tampon contenant 40 % de glycérol et 12 % v/v du produit de traduction.

Le glycérol améliore l'activité K7L

Pour évaluer l'activité des échantillons de K7L, nous avons synthétisé plusieurs substrats peptidyliques correspondant aux sites de clivage putatifs P25K, P4a et P4b (tableau 1). Les peptides étaient acétylés en N-terminal et contenaient ACC comme fluorophore. L'activité a été mesurée par la libération du fluorophore libre à l'aide d'un fluorimètre fonctionnant en mode cinétique. K7L présente une faible activité contre Ac-ISAG-ACC, mais son activité a été considérablement augmentée en présence de 45% de glycérol (Fig. 3 UNE). Semblable au glycérol, d'autres osmolytes tels que la bétaïne et le saccharose ont également augmenté l'activité contre Ac-ISAG-ACC ( Fig. 3 B). En conséquence, des mesures d'activité de routine ont été effectuées en présence de 40 % de glycérol à un pH optimal de 8,0 (Fig. 3 C) Sauf indication contraire. Le glycérol a augmenté l'activité de K7L contre d'autres peptides fluorescents distincts de Ac-ISAG-ACC et des substrats protéiques de pleine longueur (données non présentées), et nous concluons donc que l'effet de l'osmolyte est sur l'enzyme, pas sur le substrat.

TABLEAU 1

Protéolyse K7L de peptides fluorogènes

Les paramètres cinétiques ont été évalués dans 30 m m de tampon Tris-HCl, pH 8,0, 100 nM de NaCl, 2 m m de DTT et 45 % de glycérol avec une gamme de concentrations de peptides et de K7L de 0,2 à 1,0 μ m. NM, non mesuré. Les erreurs indiquent l'écart type observé de trois mesures.

Source de la séquenceSéquence peptidiquekchat/KmKm
m1 s1μ m
P25K, Gly 18 ↓Ser 19 Ac-FFAG-ACC300 ± 5100 ± 15
P25K, Gly 32 𡤺la 33 Ac-VIAG-ACC120 ± 30NM
P4b, Gly 60 ↓Ser 61 Ac-ISAG-ACC80 ± 30830 ± 110
P4a, Gly 614 ↓Ser 615 Ac-FYAG-ACC560 ± 90NM
P4a, Gly 697 ↓Thr 698 Ac-TNAG-ACCPas de clivagePas de clivage
P25K, Gly 18 ↓Ser 19 Ac-TIFFAG-ACC570 ± 307.5 ± 3
P25K, Gly 18 ↓Ser 19 Ac-EDTIFFAG-ACC14 400 ± 30026 ± 7
P4a, Gly 614 ↓Ser 615 Ac-RYFYAG-ACC880 ± 140NM
P4a, Gly 614 ↓Ser 615 Ac-CPRYFYAG-ACC1010 ± 20150 ± 30

Effets stabilisants des osmolytes, du sel, du pH et de la concentration en enzymes sur l'activité K7L. UNE, représentée est l'activité (vitesse en fonction de la concentration Ac-ISAG-ACC) en présence de 10 et 45% de glycérol. B, montré est une comparaison de l'activation de K7L par la bétaïne, le glycérol et le saccharose (vitesse en fonction de la concentration en osmolyte) dans 35 μ m Ac-ISAG-ACC. C, montré est l'effet de la concentration de NaCl sur l'activité K7L dans 35 μ m Ac-ISAG-ACC. Les vitesses initiales ont été mesurées à 25 ଌ dans 30 m m Tris, pH 8,0 et 2 m m DTT avec l'ajout des divers composants. C, montré est l'effet du pH sur l'activité K7L en présence de 45% de glycérol. , montré est l'effet de la concentration de K7L sur l'activité spécifique de K7L vers 30 μ m Ac-EDTIFFAG-ACC en présence de 10 % de glycérol.

La dimérisation améliore l'activité K7L

Nous avons analysé l'effet de la dimérisation de K7L sur l'activité spécifique en observant la dépendance à la concentration du clivage d'un substrat peptidique marqué par ACC (Fig. 3 ). La dépendance avait une forme sigmoïde avec AC50 = 0,2 ± 0,1 μ m , ce qui correspond au K valeur déterminée par ultracentrifugation analytique (voir ci-dessus). Ce résultat lie clairement l'activité de K7L à la dimérisation.

Enfin, nous avons comparé les activités de la K7L recombinante produite dans E. coli versus cellules de mammifères infectées par le virus de la vaccine (Fig. 3 supplémentaire). Aucune différence significative n'a été observée, indiquant que K7L n'est pas activé de manière différentielle dans les cellules de mammifères (par exemple. par modification post-traductionnelle).

Sondage de la spécificité du substrat

La spécificité de substrat de la vaccine I7L a déjà été définie par in vivo essais de clivage du mutant P25K (5, 42, 43). Cependant, parce que les données publiées n'ont pas fourni de comparaisons quantitatives des efficacités de clivage, nous avons effectué une analyse approfondie de K7L. Le site P1 de tous les substrats naturels putatifs de K7L est un résidu Gly.Pour tester quantitativement la tolérance de K7L, nous avons muté le Gly conservé aux positions 18 et 32 ​​de P25K en Ala et comparé leurs efficacités de clivage avec le P25K de type sauvage. Comme le montre la figure 4 UNE, les deux sites de WT P25K ont été complètement clivés en 1 et 9 h, respectivement, alors qu'aucune preuve de clivage du double mutant n'a été obtenue après 9 h d'incubation. Ceci indique une très forte préférence pour Gly en position P1 des substrats protéiques.

Profilage du sous-site de K7L et comparaison avec les préférences de substrat de protéase associées. UNE, P25K et son double mutant, G18A/G32A, ont été produits dans un in vitro système de transcription/traduction (Promega), clivé par K7L-GST recombinant pendant les temps indiqués, et visualisé après SDS-PAGE comme décrit sous “Procédures expérimentales.” B, les préférences d'acides aminés aux positions P3-P1′ du site de clivage Gly↓Ser 18 de P25K sont montrées Gly 32 a toujours été muté en Ala pour faciliter l'analyse quantitative. Les analyses ont été conduites de la même manière que le montre le panneau A. Des mutations uniques ont été introduites aux positions P3-P1′ du site Gly↓Ser 18 , comme indiqué sur le axe horizontal. Les axe vertical montre les taux de clivage relatifs (%). C, une bibliothèque de peptides explorant les positions P2-P4 a été construite comme décrit sous Procédures expérimentales, & x0201d et les activités relatives de 0,5 μ m K7L sont exprimées par rapport au substrat clivé le plus efficacement à chaque position. Toutes les réactions ont été conduites dans du glycérol à 40 %. Les axe horizontal montre les acides aminés écrits dans le code standard à une lettre, les acides aminés non naturels sont : O, norleucine B, β-alanine. , les préférences relatives sont comparées pour les protéases déSUMOylantes et déubiquitinantes apparentées. rouge indique l'activité la plus élevée le noir indique le plus bas. Les préférences sont regroupées par leur similitude avec K7L.

Nous avons ensuite étudié le clivage des substrats tétrapeptidiques et utilisé une approche de bibliothèque de substrats à balayage positionnel pour définir les préférences optimales aux positions P2, P3 et P4. La position P1 a été fixée en tant que Gly, et les positions P2, P3 et P4 ont chacune été modifiées au hasard en l'un des 18 acides aminés, y compris la norleucine et la β-alanine (Fig. 4 C). Comme nous avons utilisé des concentrations de peptides similaires, les contributions relatives des substitutions d'acides aminés à l'activité ont pu être mesurées directement. Les résultats démontrent une forte préférence pour Ala à P2. La sélectivité à P3 était plus faible, mais les résidus hydrophobes étaient particulièrement bien tolérés. La position P4 était plus restreinte que P3 et montrait une nette préférence pour les résidus hydrophobes (Fig. 4 C). Ces résultats sont bien en accord avec les motifs de séquence qui existent dans les cibles de clivage naturelles de K7L (Fig. 2 C) et distinguer K7L des protéases étroitement apparentées dans le Clan CE ( Fig. 4 ) (39).

Nous avons ensuite utilisé nos observations basées sur les peptides dans une analyse mutationnelle du substrat naturel putatif P25K. Nous avons muté les positions P3, P2 et P1&# x02032 dans le site de clivage Gly 18 ↓Ser 19 tout en introduisant une mutation Ala à Gly 31 pour faire taire toute contribution du clivage secondaire (Fig. 4 B). P1′ dans le site Gly 18↓Ser 19 a démontré une nette préférence pour Ser et Ala, les résidus les plus fréquents sur tous les sites de clivage naturels putatifs de K7L (Fig. 2 B). Nous avons également constaté que la substitution d'Ala à P2 par Gly n'affectait pas le taux de clivage, confirmant la proposition selon laquelle le clivage des substrats naturels peut être influencé par les exosites (12).

Pour corroborer ces résultats, nous avons synthétisé des substrats ACC tétrapeptides individuels correspondant à la séquence tétrapeptidique optimale et aux sites de clivage de P25K, P4b et P4a et les avons co-incubés avec K7L. Les kchat/Km les paramètres ont ensuite été calculés à partir des données de clivage (tableau 1), révélant une préférence pour Tyr et Phe à la position P3. Ces résultats indiquent que la spécificité de K7L dans les positions P2, P1 et P1 & # x02032 entourant la liaison scissile est bien corrélée avec les sites de clivage des séquences de protéines naturelles (Fig. 2, C𠄾). Cependant, au-delà de cette région, les corrélations s'effondrent.

Cartographie du site de liaison de substrat étendu de K7L

Les divergences dans les spécificités des sites de clivage entre les substrats peptidiques et protéiques au-delà de la fente catalytique suggèrent que des résidus plus éloignés que P4-P1 pourraient affecter l'activité. Pour déterminer l'effet des positions de résidus distants sur l'activité K7L, nous avons utilisé deux stratégies. Dans la première stratégie, nous avons étendu les substrats peptidiques à base d'ACC pour englober les résidus P1-P8 correspondant aux sites de clivage P25K et P4a. Les mesures cinétiques révèlent que l'extension des deux substrats aux résidus P5 et P6 n'a donné qu'une amélioration mineure de la vitesse d'hydrolyse des peptides. En revanche, l'extension des substrats aux positions P7 et P8 a favorisé l'hydrolyse jusqu'à 25 fois tout en laissant l'hydrolyse du peptide à base de P4a presque inchangée. Notamment, les résidus chargés négativement dans P7 et P8, dérivés des sites de clivage P25K, ont été préférés aux résidus neutres trouvés à ces positions dans les séquences des sites P4a et P4b.

Dans une deuxième stratégie, nous avons synthétisé des peptides qui couvraient les résidus P9-P4′ de P25K, P4a et P4b, dérivés à leur extrémité N avec FAM. Cela nous a permis de surveiller le clivage par PR-HPLC d'échantillons chronométrés à de faibles concentrations de substrat μ m, permettant une estimation de l'efficacité catalytique (kchat/Km) (voir “Procédures expérimentales”). Les sites de clivage ont été confirmés indépendamment par spectrométrie de masse MALTI-TOF. Conformément aux résultats présentés dans le tableau 1, les peptides englobant le site Gly 18 ↓Ser 19 de P25K ont été clivés par K7L beaucoup plus efficacement que les peptides dérivés d'autres sites des protéines P25K, P4a et P4b.

Fait intéressant, le peptide FAM-LDRIITNAGTCTV couvrant le site de clivage Gly 697 ↓Thr 698 de P4a est apparu résistant à la protéolyse K7L. Ceci était en accord avec les données sur le peptide Ac-TNAG-ACC démontrant que ce site est hautement défavorable pour le clivage par K7L (tableau 2). En accord, les données de spectrométrie de masse MALDI-TOF ont confirmé que le peptide FAM-LDRIITNAGTCTV n'était pas clivé même par des niveaux très élevés de K7L (non représenté). Semblable au substrat Ac-EDTIFFAG-ACC, l'élimination des résidus P9-P7 de la séquence peptidique optimale P25K a réduit son taux de clivage de � fois. De manière significative, l'extension des substrats au-delà de la liaison scissile dans la direction principale (en aval de la liaison scissile) n'a eu aucun impact majeur sur les taux de clivage, et l'extension de P2′ à P4′ n'a fourni qu'une amélioration modeste (moins de 2 fois) dans catalyse (tableau 2). Dans l'ensemble, nos données de clivage pour les peptides plus longs sont très bien corrélées avec l'activité K7L in vitro contre des substrats protéiques (P25K et P4b). Sur la base de nos données, il est probable que le site Gly 697 ↓Thr 698 de la protéine P4a soit un substrat sous-optimal de K7L.

TABLEAU 2

Protéolyse K7L du peptide marqué FAM P9-P4′

Les paramètres cinétiques ont été évalués dans 30 m m de tampon Tris-HCl, pH 8,0, 100 nM de NaCl, 2 m m de DTT et 45 % de glycérol avec 10 μ m de peptide et K7L de 0,1 à 1,0 μ m . O (norleucine) a été utilisé à la place de Met pour éviter l'oxydation de ce dernier lors de la synthèse de la séquence DDLQMVIAG𡤺KSK. Les erreurs indiquent que le S.D. de deux mesures. ND, non déterminé.

Protéine, site de clivageSéquence peptidiquekchat/Km
45% de glycérol15% Glycérol
m1 s1
P25K, Gly 18 ↓Ser 19 DEEDTIFFAGSISE28000 ± 30001300 ± 400
P25K, Gly 18 ↓Ser 19 DEEDTIFFAGSje17500 ± 1500
P25K, Gly 18 ↓Ser 19 TIFFAGSISE670 ± 220
P25K, Gly 32 𡤺la 33 JJQL O VIAGUNEKSK3500 ± 800220 ± 100
P4b, Gly 60 ↓Ser 61 VDDDFISAGUNERNQ2000 ± 500
P4a, Gly 614 ↓Ser 615 YCPRYFYAGSCHEVILLE2100 ± 500
P4a, Gly 697 ↓Ser 698 LRDIITNAGTCla téléND
P4a, Gly 697 ↓Thr 698 mutantLRDIITNAGT S la téléND
Preuve de l'activation médiée par les exosites allostériques de K7L

La stimulation substantielle de l'activité de la catalyse K7L sur les substrats occupant les positions P7 et P8 a suggéré deux possibilités 1) une reconnaissance de substrat concertée étendue ou 2) une interaction exosite agissant comme un commutateur allostérique. Pour répondre à ces hypothèses, nous avons testé si P25K pouvait améliorer la protéolyse K7L du substrat Ac-ISAG-ACC. Nous avons co-incubé K7L (0,5 μ m ) avec P25K (0,1� μ m ), puis mesuré la vitesse de clivage du substrat fluorescent. Les protéines témoins albumine de sérum bovin (BSA) et lysozyme n'ont eu aucun effet sur la vitesse de clivage, mais la protéine P25K a augmenté l'activité K7L jusqu'à 2,4 fois, avec un effet stimulateur maximal à 8 μ m P25K. Des concentrations plus élevées de P25K ont conduit à l'inhibition de l'activité K7L contre Ac-ISAG-ACC ( Fig. 5 UNE). En revanche, le peptide FAM-EEDTIFFAGSISE n'a montré aucune stimulation de Ac-ISAG-ACC et a plutôt été inhibé avec un IC50 de 37 μ m , similaire à la concentration à laquelle P25K commence à inhiber le clivage du substrat rapporteur tétrapeptide ( Fig. 5 B). Ces résultats sont cohérents avec un petit effet allostérique mais indiquent que le mécanisme principal du clivage amélioré des peptides longs est la présence d'une reconnaissance étendue et concertée du substrat.

Influence de la P25K pleine longueur et des polynucléotides sur l'activité K7L. UNE, l'activation par P25K du clivage Ac-ISAG-ACC est montrée. L'activation dépendante de la concentration correspond à une courbe dose-réponse en cloche, avec KUNE = 8 μ m et Kje = 45 μ m . La BSA et le lysozyme ont été utilisés comme témoins de liaison non spécifique. B, montré est l'inhibition par FAM-EEDTIFFAGSISE du clivage Ac-ISAG-ACC, avec des données ajustées à une courbe dose-réponse de premier ordre, Kje = 37 μ m . Les réactions ont été réalisées dans 30 m m de Tris, pH 8,0, contenant 40 % de glycérol, 50 m m de NaCl, 0,2 𠄰,5 μ m de K7L et 50 μ m de substrat Ac-ISAG-ACC. C, le clivage de P25K par K7L en présence de divers cofacteurs est montré. 0,3 μ m K7L a été co-incubé pendant les temps indiqués avec 8 μ m P25K en présence de 1 m m Mg 2+ (panneau de gauche), ARN humain (0,1 mg/ml) + Mg 2+ (panneau central), ou ADN viral (0,1 mg/ml) + 1 m m Mg 2+ (panneau de droite). Des expériences ont été réalisées avec 3, 15 ou 40 % de glycérol comme indiqué. Les digestions ont été séparées par SDS-PAGE. , les images dans C ont été numérisés pour calculer les kchat/Km valeurs comme décrit sous “Procédures expérimentales.” E, effets du glycérol, de l'ARN humain et du Mg 2+ les ions sur le clivage de Ac-EDTIFFAG-ACC par K7L sont montrés. K7L (0,1 μ m ) a été co-incubé à 25 ଌ avec le peptide (10 μ m ). Les réactions contenaient 30 m m de Tris-HCl, pH 8,0, 50 m m de NaCl et 2 m m de DTT, et les concentrations indiquées de glycérol. Le cas échéant, 1 m m MgCl2 ou 0,1 mg/ml d'ARN ont été ajoutés aux réactions.

Les polynucléotides stimulent la protéolyse de P25K par K7L

P25K est un liant de haute affinité de polynucléotides (K = 1𠄲 nm), comprenant à la fois l'ARN et l'ADN (44). Pour tester si les polynucléotides affectent le clivage de P25K, nous avons co-incubé K7L avec P25K en présence et en l'absence d'ARN, d'ADN double brin de la vaccine et de glycérol. L'ADN, et surtout l'ARN (tous deux à 0,1 mg/ml), ont considérablement stimulé le clivage des deux sites P25K, et leur effet était particulièrement fort à des concentrations plus faibles de glycérol (3&# x0201315%) ( Fig. 5 , C et ). Il est possible que des polynucléotides soient nécessaires pour stimuler la protéolyse K7L de la protéine P25K et que cette stimulation ne nécessite pas la présence de glycérol élevé. Il est important de noter que l'ARN (et l'ADN viral non illustré) ont tous deux inhibé le clivage du peptide Ac-EDTIFFAG-ACC par K7L par 𢏄 fois (Fig. 5 E), suggérant que K7L a une propension à se lier aux polyanions. De plus, la stimulation polynucléotidique de la catalyse sur P25K était beaucoup plus élevée que l'effet inhibiteur vis-à-vis du substrat octapeptide. Parce que l'activation est spécifique à une protéine, nous proposons que l'ADN et l'ARN viraux influencent le clivage de P25K en favorisant son interaction avec K7L sur un site allostérique.

Inhibiteurs peptidiques et sondes d'activité

L'empreinte du substrat préféré K7L a été utilisée pour concevoir des sondes basées sur l'activité qui seraient reconnues par la protéase K7L. A cet effet, les séquences peptidiques FYAG et EDTIFFAG ont été fonctionnalisées avec une étiquette biotine N-terminale et un réactif VME C-terminal “warhead” (Fig. 6 UNE). La sélectivité et l'efficacité de la biotine-AEEAc-EDTIFFA-VME ont été directement confirmées dans des expériences de marquage utilisant K7L. Pour visualiser le matériel marqué, les échantillons ont été soumis à un transfert Western avec de la streptavidine-HRP. Bien que la sonde courte n'ait pas marqué visiblement K7L, la sonde biotine-AEEAc-EDTIFFA-VME plus longue à 25 nm était suffisante pour marquer le site actif de K7L, conformément aux constantes de taux d'inhibition mesurées (Fig. 6 B). Le blocage du marquage par le N-éthylmaléimide a indiqué que la sonde cible le site actif ( Fig. 6 B).

Une sonde basée sur l'activité marque K7L in vitro et dans les extraits cellulaires. UNE, illustrées sont des formules chimiques de sondes à base de peptides biotinylés. Les constantes d'inhibition ont été calculées en observant la décroissance de pseudo-premier ordre de l'activité (kobs) en présence d'une concentration d'inhibiteur (je). B, panneau supérieur, K7L (0,2 μ m ) a été marqué avec les concentrations indiquées de court (S) et longue (L) sondes pendant 15 min à 25 ଌ et visualisées avec de la streptavidine-HRP par SDS-PAGE. Panneau inférieur, l'enzyme totale a été visualisée par Western blot en utilisant un anticorps anti-K7L sur le même gel. C, montré est le marquage K7L et I7L dans des cellules BSC-1 infectées par le virus de la vaccine (multiplicité d'infection = 5, 24 h). Lorsque cela est indiqué, le K7L recombinant a été co-exprimé à partir d'un vecteur pTF7-3 transfecté. 10 μ m d'EDTIFFAG-VME biotinylé ont été ajoutés à des échantillons homogénéisés, incubés pendant 15 min et chargés sur SDS-PAGE. Les protéines biotinylées ont été visualisées avec de la streptavidine-HRP. Les flèches noires indiquer les positions du K7L recombinant et du I7L viral sur le gel. Les flèche ouverte souligne l'absence de la bande I7L dans un échantillon dépourvu du virus.

Pour tester si la sonde biotine-EDTIFFAG-VME marque K7L cellulaire, nous avons ajouté des concentrations de 10 μ m de sonde aux lysats de cellules BSC-1 infectées par le virus de la vaccine. Après une courte incubation, les lysats ont été analysés par Western blot avec streptavidine-HRP (Fig. 6 C) et également avec un anticorps K7L (Fig. 4 supplémentaire). Les résultats démontrent que la sonde a marqué de manière prédominante une bande de 48 kDa dans les cellules infectées par le virus. Des expériences futures et une optimisation des sondes seront nécessaires pour déterminer si les sondes décrites ici sont capables d'inhiber l'infectivité et/ou la réplication virale.

Conclusion

K7L est désigné par le système de classification MEROPS comme membre de la famille C57 de peptidase Clan CE (45), un clan qui contient des protéases de transformation de l'adénovirus et du virus de la peste porcine africaine, des enzymes déSUMOylantes de la levure à l'homme et des enzymes déubiquitinantes des plantes et bactéries pathogènes pour les animaux (24&# x0201329, 35). Les orthologues K7L sont présents et probablement requis dans tous les orthopoxvirus. En utilisant une expression transitoire et des analyses de virus létal conditionnels, il a déjà été démontré que I7L, l'orthologue de la vaccine de K7L, est nécessaire pour le traitement de la protéine centrale (7, 16, 18). Une étude séminale a utilisé des extraits de cellules infectées par un virus contenant I7L pour démontrer que l'enzyme est une cystéine protéase capable de cliver les précurseurs de la protéine centrale P4a, P4b et P25K (17). Les auteurs n'ont cependant pas été en mesure de produire du I7L catalytiquement actif synthétisé in vitro, les conduisant à conclure qu'un cofacteur est requis pour l'activité.

Notre succès dans la production de K7L catalytiquement actif par expression dans E. coli nous amène à proposer que la dimérisation de K7L, et par inférence I7L, est nécessaire pour l'activité et que le in vitro système de traduction précédemment employé (17) a produit des concentrations insuffisantes de protéine pour permettre une dimérisation significative. De plus, nos résultats suggèrent fortement que K7L nécessite en effet un cofacteur pour une activité maximale. Bien que nous ne connaissions pas son identité, nous avons montré que le glycérol et d'autres osmolytes stabilisants ont un effet stimulateur. De plus, nous avons constaté que les polyanions ont des effets différentiels sur l'activité de l'enzyme sur les protéines vis à vis substrats peptidiques. Ensemble, ces caractéristiques indiquent une régulation de K7L qui est multivariée et plus complexe que pour les autres membres du Clan CE, peut-être en raison de l'exigence stricte que son activité soit localisée principalement ou exclusivement sur le virion en condensation (7, 16, 18 ).

Les informations sur d'autres protéases virales du clan CE sont extrêmement limitées, et à ce jour, seule la protéase adénaïne de traitement adénoviral a été caractérisée biochimiquement et structurellement de manière significative (29, 35, 46, 47). Fait intéressant, certaines propriétés de K7L semblent être distinctes des autres membres du Clan CE, alors que d'autres sont apparentées. Ainsi, K7L fonctionne le plus efficacement en tant qu'homodimère, ce qui n'est pas une exigence signalée pour les autres enzymes du Clan CE. Cependant, en commun avec d'autres membres du Clan CE, nous avons fourni in vitro preuve que les cofacteurs améliorent l'activité K7L, bien que les détails varient. Ainsi, l'adénaïne est activée par la liaison simultanée de deux cofacteurs, le fragment à 11 résidus de la protéine centrale pIV et l'ADN viral (29), alors que nos données suggèrent que les oligonucléotides d'ARN et d'ADN peuvent améliorer l'activité de K7L vers son substrat apparenté, P25K.

Notre analyse des caractéristiques étendues de liaison au substrat de K7L aide à expliquer la spécificité de la protéase pour ses substrats prédits, révélant que la présence de résidus chargés négativement aux positions P7 et P8 améliore considérablement le clivage de certains substrats.Cela implique qu'une interaction exosite distante du site actif est nécessaire pour un clivage optimal des substrats naturels. Conformément à nos résultats, aucun des peptides qui couvrent le site de clivage P4a, Gly 614 ↓Ser 615, ni la protéine P4a elle-même, n'est clivé par le K7L recombinant.

K7L a été proposé comme cible prometteuse pour le traitement de la variole (10, 11). En effet, une petite molécule qui empêche la maturation de la protéine centrale de la vaccine a été rapportée (10, 11) et pourrait être un inhibiteur de I7L. Notre analyse de sonde basée sur l'activité biotinylée démontre que le K7L est actif et ciblable dans les lysats de cellules infectées. En conclusion, nos résultats fournissent de nombreuses nouvelles informations sur le mécanisme, la spécificité et la régulation de la protéase virale K7L. Notre travail fournit également une base solide ainsi que des outils moléculaires spécifiques (méthodes de production de protéases, conception d'essais, conception et synthèse d'inhibiteurs) qui peuvent désormais être utilisés pour sonder la fonction de K7L dans un environnement cellulaire.


Voir la vidéo: Microbiologie - 2ème cours: Multiplication Des Virus (Juin 2022).


Commentaires:

  1. Harrison

    y a-t-il une autre issue ?

  2. Sawyers

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  3. Guilio

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  4. Durane

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  5. Aranos

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