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Comment les différentes matrices de culture tissulaire affectent-elles le bruit de fond en microscopie à fluorescence ?

Comment les différentes matrices de culture tissulaire affectent-elles le bruit de fond en microscopie à fluorescence ?


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En réponse à ma question précédente, j'ai lu un peu sur poly--lysine, collagène I, collagène IV, laminine et autres revêtements de culture tissulaire qui favorisent l'adhésion cellulaire. J'ai toujours supposé que tout autre chose que le plastique ou le verre traité TC standard augmenterait considérablement le bruit de fond, mais peut-être que mon point de vue sur la fluorescence de fond est un peu dépassé. Quelqu'un a-t-il de l'expérience avec ceux-ci dans un environnement de microscopie à fluorescence/de criblage à haut débit ?

Plus précisément dans mon cas, je regarde l'endocytose et le trafic d'une protéine marquée dans le lysosome. Je marque la protéine avec le colorant pHrodo dépendant du pHMT de Molecular Probes, qui est censé avoir très peu de fluorescence à pH neutre, mais devient très brillant lorsque le pH baisse lorsque les vésicules endocytaires deviennent des lysosomes. Cela signifie théoriquement qu'une étape de lavage final n'est pas nécessaire, mais avec un revêtement matriciel sur les plaques, je m'inquiète du fond.

Alors, quelle est la réflexion actuelle en ce qui concerne la fluorescence de fond des différentes matrices TC ? Le fond vient-il de la matrice elle-même, ou du colorant fluorescent qui s'y adsorbe ? Est-ce que cela dépend de la longueur d'onde ? Heureusement, je ne suis peut-être pas coincé avec mes cellules qui adhèrent mal et je n'ai peut-être pas du tout besoin de matrice supplémentaire à la fin, mais je veux quand même mieux comprendre comment cela fonctionne.


La matrice extracellulaire (MEC) est fluorescente, en particulier le collagène et la laminine. Le maximum est dans les canaux DAPI et FITC et la fluorescence devient plus faible vers les longueurs d'onde plus longues. Cependant, étant donné que le manteau sur les flacons TC est très fin, je ne m'attendrais pas à ce que cela soit un problème. La meilleure chose est juste d'essayer. Il existe également un document assez connu qui pourrait être utile :

Autofluorescence : causes et remèdes


Imagerie multispectrale en biologie et médecine : Tranches de vie †

L'imagerie multispectrale (MSI) est actuellement dans une période de transition de son rôle de technique exotique à son offre sous une forme ou une autre par tous les grands fabricants de microscopie. En effet, il apporte des solutions à certains des défis majeurs de l'imagerie par fluorescence, à savoir l'amélioration des conséquences de la présence d'autofluorescence et la nécessité de s'adapter facilement à des niveaux relativement élevés de multiplexage de signaux. Le MSI, qui caractérise spectralement et élimine par ordinateur l'autofluorescence, améliore considérablement le rapport signal-arrière-plan, révélant des cibles autrement obscurcies. Bien que cet article se concentre sur des exemples dérivés de la technologie basée sur un filtre accordable à cristaux liquides, l'intention est de présenter les avantages de l'imagerie multispectrale en général. Certaines technologies utilisées pour générer des images multispectrales ne sont compatibles qu'avec des configurations optiques particulières, telles que la microscopie confocale laser à balayage ponctuel. Les approches séquentielles de bandes, telles que celles offertes par les filtres accordables à cristaux liquides (LCTF), peuvent être facilement couplées à une variété de modalités d'imagerie, qui, en plus de la microscopie à fluorescence, comprennent la microscopie à fond clair (non fluorescente) ainsi que la microscopie pour petits animaux. , imagerie in vivo non invasive. La microscopie à fond clair est le format choisi pour l'histopathologie, qui s'appuie sur l'immunohistochimie pour fournir des informations cliniques résolues au niveau moléculaire. Cependant, contrairement aux marqueurs fluorescents, les chromogènes multiples, s'ils se chevauchent spatialement, sont beaucoup plus difficiles à séparer et à quantifier, à moins que des approches MSI ne soient utilisées. L'imagerie in-vivo est un domaine en croissance rapide avec des applications en biologie fondamentale, en découverte de médicaments et en médecine clinique. La sensibilité de l'imagerie in vivo basée sur la fluorescence, comme avec la microscopie à fluorescence, peut être limitée par la présence d'une autofluorescence significative, une limitation qui peut être surmontée grâce à l'utilisation du MSI. © 2006 Société internationale de cytologie analytique

L'imagerie multispectrale est l'acquisition d'informations résolues spectralement à chaque pixel d'une scène imagée. De nombreuses technologies différentes peuvent être utilisées pour générer de telles informations, allant des roues à filtres multipositions, des réseaux et des prismes, des spectrographes à balayage laser à point unique, des filtres réglables électroniquement, de la spectrométrie d'imagerie à transformée de Fourier et de la spectroscopie d'imagerie par tomodensitométrie (examinée dans Réf. ( 1 )). Ce rapport mettra en évidence l'utilisation d'approches d'imagerie multispectrale basées sur un filtre accordable à cristaux liquides (LCTF), ainsi que des outils d'analyse spécifiques à l'application, pour une variété de tâches d'imagerie, mais doit également être lu comme une présentation des avantages du MSI dans général.


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  • Département de chirurgie plastique et de la main, Hôpital universitaire d'Erlangen, Friedrich&# x2013Alexander University Erlangen&# x2013N&# x00FCrnberg (FAU), Erlangen, Allemagne

L'approche de l'étude par microscopie intravitale (IVM) offre plusieurs avantages par rapport à in vitro, ex vivo, et des modèles 3D. IVM fournit une imagerie en temps réel des événements cellulaires, ce qui nous fournit une image complète des processus dynamiques. L'amélioration rapide des techniques de microscopie a permis l'imagerie des tissus profonds à une résolution plus élevée. Les progrès des méthodes de marquage par fluorescence permettent le suivi de types cellulaires spécifiques. De plus, l'IVM peut servir d'outil important pour étudier les différentes étapes des processus de régénération tissulaire. En outre, la compatibilité de différentes constructions d'ingénierie tissulaire peut être analysée. L'IVM est également une approche prometteuse pour étudier les réactions de l'hôte sur les biomatériaux implantés. L'IVM peut fournir un retour d'information instantané pour l'improvisation de stratégies d'ingénierie tissulaire. Dans cette revue, nous visons à fournir un aperçu des exigences et des applications des différentes approches IVM. Tout d'abord, nous discuterons de l'historique du développement de l'IVM, puis nous donnerons un aperçu des modalités optiques disponibles, y compris les avantages et les inconvénients. Plus tard, nous résumerons différentes méthodes de marquage par fluorescence. Dans la dernière section, nous discuterons des modèles IVM chroniques et aigus bien établis pour différents organes.


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Les intensités de fluorescence absolues diffèrent significativement entre les tissus pulmonaires normaux ( n = 36 ), périlésionnels ( n = 30 ) et cancéreux ( n = 52 ). La signification est présentée par « * » ( p < 0.05 ), « ** » ( p < 0.01 ) et « *** » (p < 0.001 ).


Nettoyage des tissus et préservation de la GFP dans le cœur

Le développement et l'utilisation rapides des techniques de nettoyage des tissus sont liés au développement rapide des méthodes d'imagerie, telles que la microscopie confocale et la microscopie à feuillet optique. Ensemble, ces méthodes peuvent être utilisées pour reconstruire l'anatomie 3D du tissu (Costantini etਊl., 2019).

L'un des principaux organismes modèles de la recherche biologique est le modèle murin, avec son large éventail de modifications génétiques possibles, y compris l'insertion de protéines marquées par fluorescence (par exemple, GFP) en tant que gènes rapporteurs. Les premières méthodes de nettoyage des tissus développées utilisaient des composés hydrophobes, qui déshydratent les tissus et déshydratent les protéines fluorescentes introduites (c'est-à-dire la GFP). Pour éviter ce phénomène, diverses solutions de clarification hydrophiles (à base d'eau) ont été développées. Cependant, les méthodes à base d'eau ont eu des performances de nettoyage des tissus inférieures (Silvestri et &ਊl., 2016), tout en préservant la fluorescence. Les figures 2C et 2D illustrent la préservation de la fluorescence de la GFP dans le cœur embryonnaire de différents stades (ED10.5 et ED14.5) par la méthode de compensation des tissus CUBIC. Outre l'utilisation d'une solution de clarification hydrophile, une autre approche pour maintenir la fluorescence est une méthode de transformation tissulaire consistant à enrober le tissu dans du gel d'acrylamide CLARITY (Chung et al., 2013).

Exemples d'immunocoloration et de préservation de la fluorescence GFP avec élimination des tissus sur le cœur de souris en développement

(A et B) Immunohistochimie combinée avec BABB sur embryon de souris ED 9.5, anticorps anti-actine musculaire lisse (SMA) en rouge marquant le myocarde, CD31 (PECAM-1) en coloration verte de l'endocarde (B) et coloration nucléaire DAPI (pas très distinct à ce faible grossissement) en bleu.

(C et D) Préservation de la fluorescence naturelle de la GFP avec la compensation des tissus CUBIC sur ED 10,5 (C) et ED 14,5 (D) dans des cœurs d'embryon de souris Connexin 40 - GFP (Cx40-GFP) avec autofluorescence superposée en rouge. Les trabécules ventriculaires et les oreillettes sont positives pour le Cx40 à ces stades. Du sang autofluorescent est présent dans les ventricules (C). Toutes les images ont été capturées en microscopie confocale. La barre d'échelle représente 100 μm dans tous les chiffres.

Une analyse détaillée de la préservation de la fluorescence par diverses méthodes de compensation a été réalisée par Xu et ses collègues (Xu etਊl., 2019b) sur les tissus intestinaux. Ils ont confirmé que la plupart des méthodes de clarification aqueuses étaient plus performantes en conservation de la fluorescence que celles à base de solvants organiques. En mesurant le rapport signal sur bruit de fond après l'éclaircissement des tissus, ils ont découvert que la meilleure méthode pour préserver la fluorescence était FRUIT, suivie par ScaleS et SeeDB. Cependant, CUBIC et PACT ont conservé des niveaux de fluorescence similaires à ceux de 3DISCO et uDISCO, qui sont les agents de compensation hydrophobes organiques. Ils n'ont pas inclus CLARITY et ses variations dans leurs tests. Même si leur étude incluait le tissu cardiaque, la partie concernant la préservation de la fluorescence a été réalisée sur l'intestin, qui peut réagir différemment du tissu cardiaque dense et hautement vascularisé. Par conséquent, une analyse plus approfondie de 3DISCO, uDISCO et FRUIT sur le tissu cardiaque est nécessaire. Un aperçu est résumé dans la figureਁ .

Seules quelques études ont analysé directement la compatibilité de l'éclaircissement des tissus et de la préservation de la fluorescence dans le tissu cardiaque adulte ou embryonnaire. Dans notre étude précédente (Kolesova etਊl., 2016), nous avons utilisé les méthodes de compensation CLARITY, SCALE, CUBIC et DBE et comparé leur capacité de préservation de la fluorescence GFP dans les cœurs embryonnaires (illustrés dans les figures 2 C, 2D et ​ et 3B 3 B avec élimination des tissus CUBIC sur les trabécules Cx40:GFP et le système vasculaire coronaire dans les cœurs embryonnaires). Nous avons constaté que CUBIC nettoyait le tissu à un niveau plus profond par rapport à SCALE et était donc plus adapté à l'analyse de cœurs intacts. Cependant, bien que SCALE ait également préservé le signal GFP, il n'a nettoyé que les couches superficielles du cœur, ce qui peut être suffisant pour les études des gros vaisseaux du système vasculaire coronaire (Kolesova etਊl., 2016). La différence entre SCALE et CUBIC était plus évidente dans les cœurs postnatals, où CUBIC s'est effectivement dégagé tout au long des cœurs, contrairement à SCALE (Shaikh Qureshi et &ਊl., 2016). Une autre étude a testé la capacité de CUBIC à préserver divers signaux fluorescents dans le tissu cardiaque (Nehrhoff etਊl., 2016). Ils ont découvert que la compensation CUBIC peut également préserver d'autres protéines fluorescentes telles que TdTomato et GFP dans des sections cardiaques de 750-μm d'épaisseur.

Visualisation de la vascularisation coronarienne dans les cœurs en développement

(A) Le système vasculaire a été injecté avec DiI dans un embryon de caille ED9.

(B) Les artères coronaires ont été visualisées sur la surface du cœur d'un embryon de souris ED18.5 Cx40-GFP nettoyé avec CUBIC. Image sur un microscope confocal.

(C) Analyse du cœur injecté par DiI avec des vaisseaux coronaires pseudocolorés pour indiquer la profondeur dans la paroi ventriculaire, embryon de caille ED13.

(D) Cœur de souris juvénile avec système vasculaire coronaire injecté avec Microfil et artères coronaires principales indiquées en couleur : artère coronaire droite (orange) et sa branche, artère septale (rouge) et artère coronaire gauche (jaune). Image sur un scanner micro-CT.

Il a également été démontré que CLARITY préserve de nombreuses protéines fluorescentes telles que GFP, mCherry, mOrange et Cerulean dans le tissu cardiaque (Sereti etਊl., 2018). En outre, des protocoles CLARITY modifiés ont été utilisés pour analyser le tissu cardiaque. SUT (Scheme Update on tissue Transparency, combination of CUBIC and CLARITY) a été utilisé pour analyser la cicatrisation fibrotique dans l'infarctus du myocarde (Wang etਊl., 2018). La SCM (Simplified CLARITY Method) a été utilisée pour analyser les tissus cardiaques (Sung etਊl., 2016) cependant, de meilleurs résultats ont été obtenus lorsque le sang a été lavé du cœur avant la fixation, car la décoloration de l'hème à l'aide d'un traitement à l'aminoalcool a réduit la fluorescence YFP dans échantillons cardiaques (Sung etਊl., 2016).


Méthodes

Lignées cellulaires

Les lignées cellulaires de cancer du sein humain MCF7 (HTB-22, ATCC) et MDA-MB-231 (HTB-26, ATCC) ont été maintenues dans un milieu essentiel α-minimum (α-MEM SH30265, GE Healthcare), complété avec 10 % de fœtus bovin. sérum (FBS S11150, Atlanta Biologicals) et 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S 15140, GIBCO). La lignée cellulaire de cancer de la prostate humaine PC3 a été maintenue dans du milieu RPMI-1640 (23400-021, GIBCO) supplémenté avec 10 % de FBS et 1 % de P/S. Carcinome épidermoïde de la tête et du cou (HNSCC) Les cellules OSC19 et HN5 ont été maintenues dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM SH30022FS, GE Healthcare), complété avec 10 % de FBS, 1 % de P/S, 1 mM de pyruvate de sodium (11360070, GIBCO), 2 mM de L-glutamine (25030081, GIBCO), 1 % de vitamine MEM (11120052, GIBCO) et 1 % d'acides aminés non essentiels MEM (NEAA 11140050, GIBCO). La lignée cellulaire de carcinome colorectal humain HCT116 et ses cellules dérivées – les cellules knock-out (KO) DNA-PKcs 41 – ont été maintenues dans du -MEM supplémenté avec 10 % de FBS et 1 % de P/S. Toutes les cellules ont été cultivées dans un milieu humidifié à 5% de CO2 incubateur à 37°C.

Fabrication de dispositif PDMS-HDA

La fabrication du dispositif PDMS-HDA reposait sur un substrat plat (c'est-à-dire un verre de protection 22*22 mm2) fixé avec un ruban adhésif (3 M de scotch 810), qui sert de moule pour éviter les fuites de la solution Fig. 1 (une). Le mélange de polydiméthylsiloxane (PDMS Sylgard 184, Dow Corning) a ensuite été versé dans le moule et coulé à 125°C pendant 1 h. Le rapport en poids de la base à l'agent de durcissement était de 10:1, et le poids du prépolymère PDMS était de 0,5 g par puce. La puce a été stérilisée par UV pendant 30 min après avoir retiré le ruban et stockée dans une boîte stérilisée en scellant avec du parafilm à température ambiante jusqu'à utilisation.

Culture sphéroïde tridimensionnelle par PDMS-HDA

Avant le chargement des cellules, une solution de collagène de type I de 1 ml (

4,26 mg/ml C3867, SIGMA) a été préparé en ajoutant du milieu de culture cellulaire et de l'hydroxyde de sodium 1 N pour l'ajustement du pH (les détails sont rapportés dans le tableau supplémentaire S1). Avant chaque expérience individuelle, le pH de la solution de collagène a été mesuré à environ pH 7,4. Les cellules ont ensuite été remises en suspension dans des solutions avec différentes concentrations de collagène (0, 50, 500 et 1000 µg/ml). Dans la culture de sphéroïdes multicellulaires 3D Fig. 1(c), des gouttes cellulaires d'un volume de 1 l ont été distribuées sur le dispositif PDMS-HDA (étape 1) par une machine à liquide (Versa 10 spotter, Aurora Instruments Ltd.) Fig. 1 (b). Chaque goutte avait un diamètre moyen de 1,4 mm. Le dispositif a été retourné et placé dans une boîte de culture cellulaire de 6 cm, qui avait été pré-remplie de 750 l de milieu et scellée avec du parafilm pour empêcher l'évaporation des gouttes contenant les cellules. L'ensemble a été immédiatement transféré dans un incubateur humidifié à 37°C pendant la nuit pour permettre la formation de fibrilles de collagène, qui ont contribué à la sédimentation et à l'agrégation des cellules (étapes 2 et 3), favorisant la génération de sphéroïdes cellulaires (étape 4) .

Évaluation de la taille des sphéroïdes cellulaires

Le volume moyen des sphéroïdes cellulaires cultivés en 3D a été calculé sur la base des mesures de leurs diamètres par un logiciel d'imagerie open source (Fidji). Bien que certains sphéroïdes aient été ovales ou de forme irrégulière, le diamètre moyen (je) a été déterminé par l'équation suivante : je = (une × b) 1/2 , où une et b représentent les deux diamètres orthogonaux de chaque sphéroïde. Le volume moyen (V) des sphéroïdes a ensuite été évaluée par l'équation (V=4 imes pi imes <(l/2)>^<3>/3) .

Marquage et imagerie cellulaire

Les cultures sur le dispositif PDMS-HDA ont été colorées avec un mélange de 2 M de calcéine AM et 4 M d'éthidium homodimère-1 (kit de viabilité vivante/morte, L3224, Thermo Fisher Scientific Inc.) pour colorer les cellules vivantes et mortes, respectivement. Le dispositif a été incubé sous 5% de CO2 à 37°C pendant une heure. Les images en fond clair et en fluorescence ont été capturées à l'aide d'une caméra CCD (SPOT Flex, SPOT Imaging) sur un microscope droit. L'analyse des images a été réalisée par le logiciel d'imagerie Fidji.

Test de dépistage de drogue

Pour démontrer que le dispositif PDMS-HAD peut dépister des médicaments anticancéreux, différents sphéroïdes tumoraux (des cellules MCF7, MDA-MB-231, PC3, OSC19 et HN5) ont été testés après traitement avec les médicaments chimiothérapeutiques paclitaxel (T7402, SIGMA ) et le cisplatine (P4394, SIGMA), à des concentrations de 0 à 50 µg/ml. Sur la base de la procédure décrite précédemment, des sphéroïdes monocellulaires ont été obtenus à une densité cellulaire initiale de 450/μl dans chaque goutte de milieu contenant du collagène de 500 g/ml pour une culture de 2 jours. En suivant la procédure illustrée à la figure 2 (a), une goutte contenant un médicament de 1 l avec deux fois la concentration de test finale (0, 5, 25 ou 50 g/ml) a été distribuée dans les gouttes contenant les cellules appropriées, résultant en un volume total de 2 ul pour chaque goutte. Après un traitement médicamenteux de 2 jours, la viabilité cellulaire a été obtenue en utilisant le test CellTiter-Blue (à 520 nm d'excitation et 590 nm d'émission G8080, Promega Corp.) avec un volume de 1 l par goutte, les cellules ont été incubées pendant 4,5 h. Un microscope à fluorescence (BX51, OLYMPUS) a été utilisé pour capturer les images fluorescentes des gouttes contenant des cellules-médicaments. Des images fluorescentes ont été utilisées pour interpréter la quantité de cellules vivantes. Les intensités de fluorescence de chaque goutte ont ensuite été analysées par le logiciel d'imagerie Fiji. La viabilité cellulaire relative, correspondant à l'intensité de fluorescence, a été normalisée par rapport aux cellules non traitées sous différentes concentrations de médicament.

Pour sur l'appareil Dépistage médicamenteux 2D, 1 l des suspensions cellulaires mélangées à 2 g/ml de collagène, utilisées pour faciliter l'adhésion des cellules sur PDMS, ont d'abord été déposés sur le dispositif et cultivés pendant 2 jours sans retournement. Les expériences de sensibilité aux médicaments suivantes ont été menées dans les mêmes conditions que le dépistage de médicaments 3D mentionné précédemment. Pour les expériences de contrôle 2D à partir de plaques à 96 puits, les cellules ont été plaquées à une densité de 6000 cellules dans 100 µl de milieu par puits pendant 2 jours. Les milieux ont été échangés en conséquence avec des milieux contenant des médicaments pour une culture supplémentaire de 2 jours. Dix microlitres de CellTiter-Blue ont été ajoutés à chaque puits et les plaques ont été incubées pendant 4,5 h. Un lecteur de plaque (POLARstar Optima, BMG LABTECH) a été utilisé pour déterminer l'intensité de fluorescence, et la viabilité cellulaire a été évaluée en suivant la procédure décrite précédemment.

Test de dissémination tumorale

L'essai de dissémination tumorale a été réalisé en suivant la procédure illustrée sur la figure 3(a). Des sphéroïdes tumoraux cultivés pendant 2 jours ont été générés à partir d'un ensemencement initial de 900 cellules. Les gouttes contenant des sphéroïdes ont été distribuées avec 10 ul de gouttes moyennes avec ou sans les médicaments. La hauteur résultante de chaque goutte (un volume total de 11 µl) était d'environ 1,2 mm. Pour le traitement combiné, des médicaments ont été ajoutés à l'appareil avant l'irradiation aux rayons γ. Le dispositif a été retourné et placé sur une boîte de culture cellulaire de 6 cm. La paroi supportée du dispositif avait une hauteur de 1,5 mm et empêchait suffisamment le contact indésirable entre le réseau de gouttes et le substrat examiné. Le réseau de sphéroïdes a été déplacé vers le substrat en quelques secondes, suivi d'un effort avec une pression uniforme sur le dispositif, le séparant simultanément du substrat, voir l'exemple de la figure 3(b). Le volume de chaque goutte décalée était d'environ 5 µl. La boîte a été remplie du milieu et scellée avec du parafilm pour empêcher l'évaporation. Le plat a été transféré à un 5% de CO2 incubateur à 37 ° C pendant la nuit pour permettre aux sphéroïdes cellulaires d'adhérer au substrat. Du milieu avec ou sans les médicaments a été ajouté au plat après 1 jour. La dissémination cellulaire a été observée quotidiennement au microscope et la zone de migration a été dérivée en mesurant la migration cellulaire soustraite de la zone initiale au jour 0.

Test de co-culture en trois dimensions

Le dispositif PDMS-HDA a été adapté à la procédure illustrée sur la figure 4a pour étudier si deux cultures cellulaires individuelles en 3D pouvaient s'influencer mutuellement. Le dispositif est un outil émergent pour la modélisation des interactions cellule-cellule à différents niveaux tissulaires 32 . Deux sphéroïdes cellulaires (par exemple de type cellulaire A et de type B) ont été générés à un écart de 1,5 mm. Après 2 jours de culture, 1 l de Matrigel a été distribué manuellement sur les gouttes contenant les cellules à 4°C. Dix microlitres de milieu ont été ajoutés aux deux gouttes adjacentes après la gélification du Matrigel à 37°C pendant une nuit. Les diamètres moyens de deux sphéroïdes distincts ont été observés quotidiennement. Le volume sphéroïde a été évalué par l'équation mentionnée précédemment, (V=4 imes pi imes <(l/2)>^<3>/3) .

Essai d'invasion en trois dimensions

Pour effectuer le test d'invasion de sphéroïdes tumoraux avec le dispositif PDMS-HDA, les sphéroïdes cellulaires ont d'abord été générés sur le dispositif pendant 24 h, en suivant la procédure illustrée à la figure 5 (a). Des matrices d'échafaudage tridimensionnelles de 10 ul ont été ajoutées à chaque goutte contenant un sphéroïde cellulaire, qui a été mélangée avec du Matrigel et du collagène-I (dans du PBS à pH 7,4) dans un rapport de 1:1. La concentration finale de Matrigel était de 5 mg/ml et la concentration de collagène-I était de 1,5 mg/ml. L'ajout de collagène-I au Matrigel a facilité l'invasion en augmentant la rigidité de la matrice 42 . Nous avons observé que les cellules du gel mixte envahissaient plus efficacement que le Matrigel ou le gel de collagène utilisé seul (données non présentées). Cinq microlitres de matrices d'échafaudage encapsulées dans le facteur de croissance épidermique (EGF 236-EG-200, systèmes R&D) ont été distribués à côté de la goutte sphéroïde correspondante à un écart de 1,5 mm. L'EGF a été utilisé à des concentrations de 0, 10 et 50 ng/ml. Après gélification de la matrice d'échafaudage à 37 °C pendant 1 h, 20 l de milieux de culture standard ou contenant du NU7441 ont été distribués et reliés aux deux gouttes de gel adjacentes au jour 0. L'ajout du milieu permet la génération d'un in vitro-like microenvironnement, dans lequel un gradient d'EGF de la matrice encapsulée pourrait être généré pour stimuler et coordonner l'invasion sphéroïde à proximité Fig. 5 (a). Pour le traitement combiné, des médicaments ont été ajoutés à l'appareil avant l'irradiation aux rayons γ. L'invasion sphéroïde a été observée quotidiennement par microscopie. De plus, la zone d'invasion a été évaluée en tant que mesure de la propagation cellulaire soustraite de la zone initiale au jour 0.

Analyses statistiques

Le test t de Student a été utilisé pour comparer les données de deux groupes. Le test TukeyHSD ANOVA unidirectionnel a été utilisé pour comparer les données de plus de deux groupes. Un p < de 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.


Contributions d'auteur

TN et MS ont conçu des recherches TN, ME, CR, JS, JMU, PF, SW, LO et AM ont effectué des recherches PL, MDF, BMM, AC et AJM ont contribué de nouveaux réactifs/lignes de plantes/outils d'analyse TN, ME, CR, JS, PF, SW et SJM-S ont analysé les données et TN et MS ont rédigé l'article avec l'aide de tous les co-auteurs.

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Figure S1 Purification de la protéine hétérologue roGFP2-Orp1, spectres d'émission et H2O2-taux d'oxydation dépendants.

Figure S2 Analyse de l'état redox roGFP2-Orp1 cytosolique dans différents tissus de plantules d'Arabidopsis.

Figure S3 Réponses redox des lignées indépendantes roGFP2-Orp1 Arabidopsis et in planta spectres du capteur mitochondrial réduit.

Figure S4 Expression de la sonde fluorescente cyt-roGFP2-Orp1 chez Arabidopsis.

Figure S5 Réponse redox du diacétate de 2′,7′-dichlorodihydrofluorescine et du mt-roGFP2-Orp1 chez les semis d'Arabidopsis à la ménadione.

Figure S6 La réponse de cyt-roGFP2-Orp1 à l'explosion oxydative déclenchée par flg22 dans les disques foliaires d'Arabidopsis traités au diphénylène iodonium.

Méthodes S1 Clonage de constructions de capteurs et génération de lignées végétales.

Méthodes S2 Culture végétale.

Méthodes S3 Purification de la protéine roGFP2-Orp1.

Méthodes S4 Élicteurs.

Tableau S1 Séquences d'amorces pour le clonage des vecteurs d'expression.

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Modèles Fluorescent Mouse Reporter pour l'imagerie tissulaire

Plusieurs types de modèles de rapporteurs fluorescents, selon l'application à la fois constitutifs et inductibles, ont été utilisés individuellement ou en combinaison pour l'imagerie des tissus ectodermiques vivants (résumés dans le tableau 1). Ces modèles peuvent être divisés en trois catégories, qui se chevauchent partiellement : indicateurs de comportements cellulaires, identité/destin cellulaire, activité de signalisation. Des exemples de reporters pour les comportements cellulaires incluent les reporters pour visualiser les divisions cellulaires tels que le modèle R26-H2B-EGFP (Hadjantonakis et Papaioannou, 2004) et les reporters du cycle cellulaire fluorescent à base d'oscillateur d'ubiquitinoylation (Fucci) qui permettent un suivi direct en temps réel de la progression du cycle cellulaire dans des cellules individuelles avec un signal fluorescent nucléaire à changement de couleur dynamique (Sakaue-Sawano et al., 2008 Mort et al., 2014). Ces reporters ont également été utilisés pour suivre les mouvements cellulaires avec une imagerie en direct. Les reporters liés à la membrane cellulaire inductibles par fluorescence tels que le R26R mT/mG (Muzumdar et al., 2007) et le R26R Confetti (Snippert et al., 2010) permettent de visualiser le type de tissu, les changements de forme cellulaire, le traçage de la lignée et le suivi des approches de marquage rares. de cellules individuelles. Le rapporteur de signalisation TCF/Lef:H2B-GFP (Ferrer-Vaquer et al., 2010) est un rapporteur fluorescent sensible de l'activation de la signalisation Wnt canonique et est basé sur les sites de liaison du facteur de transcription en tandem entraînant l'expression de la protéine de fusion H2B-EGFP. Des exemples de rapporteurs fluorescents pour l'identité cellulaire sont le rapporteur Shh GFP𠄼re (Harfe et al., 2004) visualisant l'identité du centre de signalisation, Sox2-GFP pour les cellules de condensat cutané du follicule pileux (Biggs et al., 2018) et la kératine 17-GFP pour visualiser l'épithélium des organes ectodermiques (Bianchi et al., 2005 Ahtiainen et al., 2014).

Tableau 1. Modèles de rapporteurs de souris fluorescentes pour l'imagerie des tissus vivants de l'embryogenèse ectodermique.


Les références

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Dépannage

Problème 1

Sections se détachant de la lame de verre chargée (étape 3).

Solutions potentielles

Lors de la réalisation de lavages verticaux (dans des pots de coloration Coplin en verre), il est possible que des coupes de tissus commencent à se détacher. Pour éviter cela, de nombreuses approches peuvent être envisagées :

Solution 1 : tout en coupant les coupes dans le cryostat et en les plaçant sur les lames de verre, elles doivent être conservées à température ambiante pendant 30 à 1 heure pour favoriser une adhérence complète de la coupe de tissu au verre.

Solution 2 : Des lames telles que les lames de verre traitées APES (aminopropyltriéthoxysilane) peuvent être utilisées (au lieu des lames SuperFrost™ Plus) pour augmenter l'adhérence des tissus (https://theolb.readthedocs.io/en/latest/molecular-biology/apes- traitement-des-diapositives.html).

Solution 3 : Avant de commencer la coloration, il faut laisser suffisamment de temps aux lames pour qu'elles soient à température ambiante, afin de s'assurer que les coupes sont complètement attachées aux lames de verre.

Solution 4 : Si le tissu n'est pas déjà fixé, fixez-le avec du PFA sur la lame pour favoriser une adhérence supplémentaire.

Solution 5 : Pendant la coloration, remplacez délicatement le tampon entre les lavages et, lorsque vous utilisez l'agitation, sélectionnez une vitesse faible.

Solution 6 : Si les sections continuent à se détacher, effectuez tous les lavages horizontalement au goutte à goutte.

Problème 2

Un signal de fluorescence élevé est détecté dans les sections qui ont été incubées avec le sucre hapténique (témoins inhibiteurs) (étape 14 ou 25).

Solution potentielle

Si la liaison de la lectine est médiée par les glucides, en incubant une lectine avec son sucre hapténique, le sucre hapténique occupera le site de liaison de la lectine et empêchera la lectine de se lier aux glycanes dans le tissu, conduisant à une diminution significative du signal dans ces sections il ne faut pas toujours s'attendre à l'abolition). Consultez les instructions du fabricant pour confirmer le sucre le plus approprié à utiliser. De plus, il convient de noter que certaines lectines ne peuvent être inhibées que par des sucres complexes et non par des monosaccharides, auquel cas des glycoprotéines glycosylées de manière appropriée doivent être utilisées (Brooks et Hall, 2012). Si la liaison de la lectine n'est pas significativement diminuée en présence du sucre hapténique, la liaison de la lectine est soit non spécifique, soit médiée par les sites de liaison non glucidiques présents dans la lectine (Gerlach, etਊl., 2012). Une lectine différente avec une spécificité souhaitée similaire doit être sélectionnée dans ce dernier cas.

Problème 3

Signal de coloration/fluorescence de fond élevé (étape 14 ou 25).

Solution potentielle

Si une forte coloration de fond est détectée, plusieurs étapes peuvent être tentées pour la réduire. Cela peut être dû à plusieurs raisons :

Raison 1 : Blocage insuffisant des sites de liaison non spécifiques, qui peut être surmonté en augmentant la concentration de BSA traitée au periodate ou en prolongeant la période d'incubation de l'étape de blocage.

Raison 2 : Concentration de lectine, température d'incubation ou durée d'incubation excessives. In these cases, it is advised to reduce the concentration of lectin and/or to incubate sections at 4ଌ instead of at room temperature and/or for a reduced period of time. Also, the lectin used could be potentially diluted in a buffer containing the blocking agent (e.g., 0.1% periodate-treated BSA in TBS-T or TBS). The use of other blocking agents (such as normal serum, which is frequently used in immunohistochemistry) is not appropriate as it possesses multiple glycosylated molecules, which might inhibit specific binding of lectins to the tissue or cause non-specific binding.

Reason 3: Number and duration of washes are too short. These can be increased to ensure that any lectin that is non-specifically bound is removed.

Reason 4: The tissue might have physiological structures/molecules that can cause auto fluorescence due to endogenous fluorophores (e.g., lipofuscin) (Croce and Bottiroli, 2014). To solve this problem, it is crucial to know the features and composition of the tissue and try to address them by finding a specific compound that can bind to these structures and reduce their auto fluorescence.

Problem 4

No fluorescence signal is detected in the stained tissue sections (step 14 or 25).

Potential solution

Lack of fluorescence signal in the samples might be caused by multiple factors:

Factor 1: Not enough lectin is bound to glycans of interest, for which the recommended course of action would be to use a higher concentration of lectin, to incubate it during a longer period (e.g., 2 h or even 3 h) or to incubate it at a higher temperature (e.g., at 37ଌ).

Factor 2: The lectin might have been improperly stored (e.g., kept at room temperature for long periods or in an environment not protected from light), which could lead to quenching of its signal or loss of its function. To ensure that the lectin has kept its function and labeling, a positive control should be run in parallel in every staining experiment. This positive control should be a tissue known to express the glycosylation motif specific to that lectin as characterized by the literature or based on previous in-house experiments.

Factor 3: The specific glycosylation motif might not be present in the tissue sample. To confirm this, a positive control using a sample where this glycosylation motif has been reported to be found should always be run in parallel.

Factor 4: The fixation procedure may modify the glycan structure that is necessary for recognition by the lectin. To solve this issue, a shorter fixation period or a different fixation method are recommended.

Factor 5: TBS buffer might be contaminated with bacteria, which might alter its properties and compromise the staining and functions of the lectin. For this, it is advised to only use freshly prepared sterile-filtered or autoclaved TBS.

Problem 5

The positive signal associated with the glycan distribution is not homogenous across the tissue section (step 14 or 25).


Z.Y. and J.L. contributed equally to this work. Conceptualization — X.C., X.Z., and H.W.O. Supervision — X.C. and H.W.O. Investigation — Z.Y., J.L., W.Z., M.L., R.L., B.Z., Y.C., and Y.H. Formal Analysis — J.L. and R.Y. Methodology — K.Z., C.F., and C.A. Writing–Original Draft — Z.Y. and J.L. Writing–Review & Editing — A.E., J.Z., and H.W.O. Funding Acquisition — X.C., B.W., and H.W. All authors read and approved the manuscript.

Remarque : L'éditeur n'est pas responsable du contenu ou de la fonctionnalité des informations fournies par les auteurs. Toute question (autre que le contenu manquant) doit être adressée à l'auteur correspondant pour l'article.


Voir la vidéo: L6E3 Yhtälöryhmät ja matriisit (Juin 2022).


Commentaires:

  1. Torht

    Vous ne m'inviterez pas à moi, où je peux lire à ce sujet?

  2. Enceladus

    Je pense que tu n'as pas raison. Entrez nous discuterons. Écrivez-moi en MP, on en parlera.

  3. Zolohn

    Merci beaucoup pour l'aide dans cette question.

  4. Verrall

    Exactement. C'est une bonne réflexion. Je le garde.



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