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Circulariser les molécules d'ADN ?

Circulariser les molécules d'ADN ?



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J'ai lu des articles sur les technologies de séquençage de nouvelle génération qui peuvent séquencer de longues lectures. Même si l'origine de ma question concerne les technologies de séquençage, la question que je pose concerne les bases de la biochimie de l'ADN.

L'un des problèmes liés à la manipulation d'échantillons d'ADN semble être la capacité de circulariser de longues molécules d'ADN linéaires en molécules d'ADN circulaires. Quels sont les défis techniques de la circularisation des molécules d'ADN de plus de 50Kbp ?


Pour que la ligature d'une molécule linéaire se produise, les deux extrémités doivent se rejoindre au site actif de l'ADN ligase. Dans une simple expérience de clonage moléculaire, le but est généralement d'éviter la recircularisation d'un vecteur plasmidique coupé, et au lieu d'obtenir un nouveau fragment d'ADN inséré dans le vecteur. Cependant, étant donné que les extrémités du plasmide circulaire linéarisé sont attachées ensemble (en étant les extrémités de la même molécule), elles sont plus susceptibles de se rencontrer que de rencontrer l'extrémité d'un fragment entrant. Ceci est généralement surmonté, en partie, en augmentant la concentration relative du fragment cible.

Si vous visez à recirculariser un long fragment, l'effet inverse entrera en jeu : les extrémités de longues molécules individuelles seront beaucoup plus indépendantes et donc l'extrémité d'une autre molécule sera susceptible de rivaliser avec succès pour la ligature. En théorie, cet effet pourrait être surmonté en réduisant la concentration d'ADN, mais je suppose que cela n'est pas pratique pour d'autres raisons.