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Que peut-on utiliser pour la préservation de l'ADN ?

Que peut-on utiliser pour la préservation de l'ADN ?


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Je ne suis ni étudiant ni vraiment avancé en biologie, je suis juste en train d'écrire un scénario de jeu de rôle sur table que je veux le plus réaliste possible. Dans l'histoire, les joueurs trouvent un ancien laboratoire où l'on étudiait les mutations génétiques, mais comme l'électricité est coupée depuis 40 ans, la plupart des embryons sont "pourris". J'ai encore besoin d'embryons encore "frais" pour que quelqu'un puisse en extraire de l'ADN et poursuivre l'expérience. Le problème, c'est que j'ai pensé au formol (l'expérience est censée avoir eu lieu dans les années 1980, donc le problème de santé n'en est pas un en ce moment), mais j'ai lu que le formol altère et détruit l'ADN. J'ai vu des méthodes plus anciennes avec l'alcool, mais le processus ne semble pas aussi efficace.

Quel liquide (ou technique) aurait pu être utilisé dans les années 80 pour préserver les embryons et leur ADN afin qu'on puisse encore l'exploiter 40 ans plus tard, et sans électricité ?


Il existe plusieurs manières plausibles :

Comme quelqu'un l'a mentionné dans les commentaires; L'alcool fonctionne bien pour cela. Nous avons des échantillons d'il y a cent ans (par exemple Thylacine), qui ont été conservés à température ambiante dans un musée pendant cette période et dont l'ADN a été facilement extrait.

Malheureusement pour de nombreuses espèces, la conservation de l'alcool est tombée en désuétude en raison du rétrécissement (par déshydratation) des spécimens, de sorte qu'ils ne semblent plus "réalistes" en termes de morphologie (ce qui est très important pour les méthodes d'identification classiques). De plus, l'éthanol et les autres alcools ont tendance à s'évaporer assez rapidement s'ils ne sont pas scellés correctement. Pour ces raisons, les solutions à base d'aldéhydes sont devenues populaires il y a environ 100 ans. L'inconvénient est que le formaldéhyde et d'autres aldéhydes réticulent le matériel génétique, le rendant plus ou moins impossible à extraire et à utiliser.

Une autre méthode possible est la déshydratation - la momification. Les petits échantillons comme les embryons ou les tissus peuvent être déshydratés assez rapidement. En l'absence d'eau, ces échantillons devraient durer plus ou moins éternellement - nous pouvons extraire l'ADN de momies dans de nombreux endroits du monde, mais celles-ci pourraient vous intéresser en particulier.

Il existe également des solutions chimiques spécialisées telles que RNAlater qui sont couramment utilisées dans les laboratoires pour la préservation du matériel génétique précieux.

Étant donné que nous savions ce genre de choses dans les années 1980 et que le laboratoire était composé de scientifiques compétents, et qu'ils savaient que le laboratoire allait fermer mais redémarrerait à un moment donné dans le futur, alors il est tout à fait plausible qu'ils auraient consommé de l'alcool ou quelque chose comme RNAlater.

En l'absence de ces connaissances, mais toujours de scientifiques compétents, il est beaucoup plus probable qu'ils auraient utilisé une sorte de méthode de stockage à froid (congelé) ; qu'il s'agisse de cryoconservation (azote liquide), comme c'est le cas pour le stockage de cellules ou d'un spécialiste -80 $^circ$C congélateur ou un -20 $^circ$C congélateur comme vous pourriez en trouver chez vous. Certains échantillons ont peut-être encore été stockés dans une conservation chimique dans l'intérêt d'un gain de place dans les congélateurs.


Le génie génétique doit-il être utilisé comme outil de conservation ?

Les chercheurs envisagent des moyens d'utiliser la biologie synthétique pour des objectifs de conservation tels que l'éradication des espèces envahissantes ou le renforcement des coraux en voie de disparition. Mais les écologistes s'inquiètent des questions éthiques et des conséquences indésirables de cette nouvelle technologie de modification des gènes.

L'effort mondial pour rendre les îles à leur faune d'origine, en éradiquant les rats, les porcs et d'autres espèces envahissantes, a été l'une des grandes réussites environnementales de notre époque. Le réensauvagement a réussi sur des centaines d'îles, avec des espèces assiégées revenant d'une extinction imminente et des colonies d'oiseaux en déclin s'épanouissant soudainement sur d'anciens sites de nidification.

Mais ces campagnes de restauration sont souvent extrêmement coûteuses et chargées d'émotions, les écologistes craignant d'empoisonner accidentellement la faune indigène, et les militants des droits des animaux s'étant parfois farouchement opposés à toute l'idée. Et s'il était possible de débarrasser les îles des espèces envahissantes sans tuer un seul animal ? Et à une fraction du coût des méthodes actuelles ?

C'est la promesse alléchante - mais aussi inquiétante - de la biologie synthétique, une Brave Nouveau Monde sorte de technologie qui applique les principes d'ingénierie aux espèces et aux systèmes biologiques. C'est du génie génétique, mais rendu plus facile et plus précis par la nouvelle technologie d'édition de gènes appelée CRISPR, que les écologistes pourraient utiliser pour épisser une séquence d'ADN conçue pour handicaper une espèce envahissante ou pour aider une espèce indigène à s'adapter à un climat changeant. Le « gene drive », un autre nouvel outil, pourrait alors propager un trait introduit dans une population beaucoup plus rapidement que ne le prédirait la génétique mendélienne conventionnelle.

La biologie synthétique, également appelée synbio, est déjà un marché de plusieurs milliards de dollars, pour les procédés de fabrication dans les domaines pharmaceutique, chimique, biocarburant et agricole. Mais de nombreux écologistes considèrent la perspective d'utiliser des méthodes synbio comme un outil de protection du monde naturel profondément alarmante. Jane Goodall, David Suzuki et d'autres ont signé une lettre avertissant que l'utilisation du forçage génétique donne « aux techniciens la capacité d'intervenir dans l'évolution, de concevoir le destin d'une espèce entière, de modifier radicalement les écosystèmes et de déclencher des changements environnementaux à grande échelle. , d'une manière que l'on n'aurait jamais cru possible auparavant. Les signataires de la lettre soutiennent qu'une telle "technologie puissante et potentiellement dangereuse … ne devrait pas être promue comme un outil de conservation".

D'autre part, une équipe de biologistes de la conservation écrivant au début de cette année dans la revue Tendances de l'écologie et de l'évolution a publié une liste d'applications prometteuses pour le synbio dans le monde naturel, en plus du réensauvagement des îles :

  • Transplantation de gènes de résistance au syndrome du museau blanc chez les chauves-souris et du champignon chytride chez les grenouilles et autres amphibiens.
  • Donner aux coraux vulnérables au blanchiment des gènes soigneusement sélectionnés parmi les coraux voisins qui sont plus tolérants à la chaleur et à l'acidité.
  • Utiliser des microbiomes artificiels pour restaurer les sols endommagés par l'exploitation minière ou la pollution.
  • Éliminer les populations de chats et de chiens sauvages sans euthanasie ni stérilisation chirurgicale, en produisant des générations génétiquement programmées pour être stériles ou biaisées pour être majoritairement des mâles.
  • Et éradiquer les moustiques sans pesticides, notamment à Hawaï, où ce sont des nouveaux venus très destructeurs.

Kent Redford, consultant en conservation et co-auteur de cet article, soutient que les écologistes et les ingénieurs synbio doivent surmonter ce qui équivaut maintenant à une ignorance mutuelle. Les écologistes ont tendance à avoir une connaissance limitée et souvent dépassée de la génétique et de la biologie moléculaire, dit-il. Dans un article de 2014 dans Oryx, il a cité un écologiste déclarant catégoriquement: «Ce sont les cours que nous avons échoués.» Drew Endy, de l'Université de Stanford, l'un des fondateurs de synbio, a à son tour fait savoir qu'il y a 18 mois, il n'avait jamais entendu parler de l'UICN - l'Union internationale pour la conservation de la nature - ou de sa « Liste rouge » des espèces menacées. « En école d'ingénieur, le fossé de l'ignorance est énorme, ajoute-t-il. "Mais c'est de l'ignorance symétrique."

Lors d'une grande conférence synbio qu'il a organisée le mois dernier à Singapour, Endy a invité Redford et huit autres défenseurs de l'environnement à animer une session sur la biodiversité, dans le but, dit-il, d'amener les ingénieurs qui construisent la bioéconomie « à penser à l'avance au monde naturel… Mon espoir est que les gens ne soient plus simplement naïfs en termes de disposition industrielle. »

De même, Redford et les co-auteurs de l'article dans Tendances de l'écologie et de l'évolution, affirment que « ce serait nuire à l'objectif de protection de la biodiversité si les écologistes ne participent pas à l'application des meilleurs scientifiques et penseurs à ces questions ». Ils soutiennent qu'« il est nécessaire d'adapter la culture des biologistes de la conservation à une réalité en évolution rapide », y compris les effets du changement climatique et des maladies émergentes. « La philosophie de la conservation du XXIe siècle », concluent les co-auteurs, devrait « embrasser les concepts de la biologie synthétique, et à la fois rechercher et guider des solutions synthétiques appropriées pour aider la biodiversité ».

Le débat sur la « conservation synthétique de la biodiversité », en tant que Tendances de l'écologie et de l'évolution les auteurs l'appellent, trouve son origine dans un article de 2003 d'Austin Burt, un généticien évolutionniste à l'Imperial College de Londres. Il a proposé un outil radicalement nouveau pour le génie génétique, basé sur certains « éléments génétiques égoïstes » naturels, qui parviennent à se propager jusqu'à 99 % de la génération suivante, plutôt que les 50 % habituels. Burt pensait qu'il serait possible d'utiliser ces gènes « super-mendéliens » comme cheval de Troie, pour distribuer rapidement de l'ADN altéré, et ainsi « pour modifier génétiquement des populations naturelles ». C'était peu pratique à l'époque. Mais le développement de la technologie CRISPR a rapidement rapproché l'idée de la réalité, et les chercheurs ont depuis démontré l'efficacité du « forçage génétique », comme la technique est devenue connue, lors d'expériences en laboratoire sur les moustiques du paludisme, les mouches des fruits, les levures et les embryons humains.

Burt a proposé une application particulièrement inquiétante pour cette nouvelle technologie : il pourrait être possible dans certaines conditions, pensait-il, qu'« une charge génétique suffisante pour éradiquer une population puisse être imposée en moins de 20 générations ». Et c'est en fait probablement la première application pratique de la conservation synthétique de la biodiversité sur le terrain. L'éradication des populations invasives est bien sûr la première étape inévitable des projets de réensauvagement des îles.

La technique d'éradication proposée consiste à utiliser le forçage génétique pour fournir de l'ADN qui détermine le sexe de la progéniture. Parce que le forçage génétique se propage si complètement à travers les générations suivantes, il peut rapidement amener une population à devenir presque entièrement masculine et à s'effondrer rapidement. Le résultat, du moins en théorie, est l'élimination des souris, des rats ou d'autres espèces envahissantes d'une île sans que personne n'ait tué quoi que ce soit.

Des recherches visant à tester la faisabilité de la méthode, y compris des considérations morales, éthiques et juridiques, sont déjà en cours par le biais d'un consortium de recherche composé de groupes à but non lucratif, d'universités et d'agences gouvernementales en Australie, en Nouvelle-Zélande et aux États-Unis. À l'Université d'État de Caroline du Nord, par exemple, des chercheurs ont commencé à travailler avec une population de laboratoire de souris envahissantes prélevées sur une île côtière. Ils doivent déterminer dans quelle mesure une population sauvage acceptera les souris qui ont été modifiées en laboratoire.

« Le succès de cette idée dépend fortement », selon Megan Serr, chercheuse sur le forçage génétique, « du fait que les souris mâles génétiquement modifiées soient des « étalons » avec les souris insulaires… Voudra-t-elle un mâle hybride qui est en partie sauvage, en partie de laboratoire ? Au-delà de cela, le programme de recherche doit déterminer combien de souris modifiées introduire pour éradiquer une population invasive dans un habitat d'une taille particulière. D'autres défis pratiques importants surgiront également sans aucun doute. Par exemple, une étude publiée au début de l'année dans la revue La génétique a conclu que la résistance aux forçages génétiques modifiés par CRISPR « devrait évoluer presque inévitablement dans la plupart des populations naturelles ».

Des résistances politiques et environnementales sont également susceptibles de se développer. Dans un e-mail, le biologiste évolutionniste du MIT, Kevin Esvelt, a affirmé que le forçage génétique basé sur CRISPR « n'est pas adapté à la conservation en raison du risque très élevé de propagation » au-delà de l'espèce ou de l'environnement cible. Même un système de forçage génétique introduit pour éradiquer rapidement une population introduite d'une île, a-t-il ajouté, « est encore susceptible d'avoir plus d'un an pour s'échapper ou être délibérément transporté hors de l'île. S'il est capable de se propager ailleurs, c'est un problème majeur.

Même "un essai sur le terrain hautement confiné sur une île éloignée est probablement dans une dizaine d'années", a déclaré Heath Packard, d'Island Conservation, une organisation à but non lucratif qui a participé à de nombreux projets de réensauvagement d'îles et fait maintenant partie du consortium de recherche. "Nous nous engageons à adopter une approche de précaution par étapes, avec de nombreuses rampes de sortie, si cela s'avère trop risqué ou non éthique." Mais son groupe note que 80% des extinctions connues au cours des 500 dernières années se sont produites sur des îles, qui abritent également 40% des espèces désormais considérées comme menacées d'extinction. Il est donc important au moins de commencer à étudier le potentiel de la conservation synthétique de la biodiversité.

Même si les écologistes rechignent finalement à ces nouvelles technologies, les intérêts commerciaux amènent déjà le synbio sur le terrain à des fins commerciales. Par exemple, un chercheur de l'Université d'État de Pennsylvanie a récemment découvert comment utiliser l'édition de gènes CRISPR pour désactiver les gènes qui font brunir les champignons des supermarchés. Le département américain de l'Agriculture a décidé l'année dernière que ces champignons ne seraient pas soumis à une réglementation en tant qu'organisme génétiquement modifié car ils ne contiennent aucun gène introduit par d'autres espèces.

Avec ce genre de changements qui se produisent tout autour d'eux, les écologistes " doivent absolument s'engager avec la communauté de la biologie synthétique ", dit Redford, " et si nous ne le faisons pas, ce sera à nos risques et périls ". Synbio, dit-il, présente aux écologistes « une vaste gamme de questions auxquelles personne ne prête encore attention ».

Richard Conniff est un écrivain lauréat du National Magazine Award dont les articles ont paru dans The New York Times, Smithsonian, The Atlantic, National Geographic, et d'autres publications. Son dernier livre est House of Lost Worlds : dinosaures, dynasties et histoire de la vie sur Terre. Il contribue fréquemment à Yale Environnement 360. En savoir plus sur Richard Conniff →


Étape 1. Casser les cellules pour libérer l'ADN

Les cellules d'un échantillon sont séparées les unes des autres, souvent par un moyen physique tel que le broyage ou le vortex, et placées dans une solution contenant du sel. Les ions sodium chargés positivement dans le sel aident à protéger les groupes phosphates chargés négativement qui longent l'épine dorsale de l'ADN.

Un détergent est ensuite ajouté. Le détergent décompose les lipides dans la membrane cellulaire et les noyaux. L'ADN est libéré lorsque ces membranes sont rompues.

Étape 2. Séparation de l'ADN des protéines et autres débris cellulaires

Pour obtenir un échantillon d'ADN propre, il est nécessaire d'éliminer autant de débris cellulaires que possible. Cela peut être fait par une variété de méthodes. Souvent, une protéase (enzyme protéique) est ajoutée pour dégrader les protéines associées à l'ADN et d'autres protéines cellulaires. Alternativement, certains des débris cellulaires peuvent être éliminés en filtrant l'échantillon.

Étape 3. Précipitation de l'ADN avec un alcool

Enfin, de l'alcool glacé (soit de l'éthanol ou de l'isopropanol) est soigneusement ajouté à l'échantillon d'ADN. L'ADN est soluble dans l'eau mais insoluble en présence de sel et d'alcool. En remuant doucement la couche d'alcool avec une pipette stérile, un précipité devient visible et peut être retiré. S'il y a beaucoup d'ADN, vous pouvez voir un précipité blanc filandreux.

Étape 4. Nettoyage de l'ADN

L'échantillon d'ADN peut maintenant être davantage purifié (nettoyé). Il est ensuite remis en suspension dans un tampon légèrement alcalin et prêt à l'emploi.

Étape 5. Confirmation de la présence et de la qualité de l'ADN

Pour d'autres travaux de laboratoire, il est important de connaître la concentration et la qualité de l'ADN.

Les lectures de densité optique prises par un spectrophotomètre peuvent être utilisées pour déterminer la concentration et la pureté de l'ADN dans un échantillon. Alternativement, l'électrophorèse sur gel peut être utilisée pour montrer la présence d'ADN dans votre échantillon et donner une indication de sa qualité.


Que fait l'ADN ?

L'ADN contient les instructions nécessaires au développement, à la survie et à la reproduction d'un organisme. Pour remplir ces fonctions, les séquences d'ADN doivent être converties en messages pouvant être utilisés pour produire des protéines, qui sont les molécules complexes qui effectuent la plupart du travail dans notre corps.

Chaque séquence d'ADN qui contient des instructions pour fabriquer une protéine est appelée gène. La taille d'un gène peut varier considérablement, allant d'environ 1 000 bases à 1 million de bases chez l'homme. Les gènes ne représentent qu'environ 1% de la séquence d'ADN. Les séquences d'ADN en dehors de ce 1% sont impliquées dans la régulation du moment, de la manière et de la quantité d'une protéine.

L'ADN contient les instructions nécessaires au développement, à la survie et à la reproduction d'un organisme. Pour remplir ces fonctions, les séquences d'ADN doivent être converties en messages pouvant être utilisés pour produire des protéines, qui sont les molécules complexes qui effectuent la plupart du travail dans notre corps.

Chaque séquence d'ADN qui contient des instructions pour fabriquer une protéine est appelée gène. La taille d'un gène peut varier considérablement, allant d'environ 1 000 bases à 1 million de bases chez l'homme. Les gènes ne représentent qu'environ 1% de la séquence d'ADN. Les séquences d'ADN en dehors de ce 1% sont impliquées dans la régulation du moment, de la manière et de la quantité d'une protéine.


Le diagnostic de certaines conditions médicales peut souvent être fait à partir de l'ADN extrait d'un patient. Les conditions qui peuvent être diagnostiquées par des tests génétiques comprennent la fibrose kystique, l'anémie falciforme, le syndrome du X fragile, la maladie de Huntington, l'hémophilie A, le syndrome de Down et la maladie de Tay-Sachs. En plus de diagnostiquer les maladies existantes, les généticiens testent également couramment si une personne est porteuse d'une maladie génétique particulière mais ne présente aucun symptôme de la maladie.

Une utilisation bien connue de l'extraction génétique est l'empreinte génétique, un processus qui met en correspondance le matériel génétique d'un individu avec d'autres matériels génétiques disponibles. Un exemple est le test de paternité, pour déterminer le père biologique de quelqu'un. Une autre utilisation courante de l'extraction d'ADN dans la vérification d'identité est à des fins médico-légales. Le matériel génétique d'un individu peut être comparé au matériel génétique d'une scène de crime, comme le sang, par exemple. La vérification génétique a fonctionné à la fois pour placer une personne sur les lieux d'un crime et pour disculper les personnes faussement reconnues coupables d'un crime.


Cryoconservation

Nos rédacteurs examineront ce que vous avez soumis et détermineront s'il faut réviser l'article.

Cryoconservation, la conservation des cellules et des tissus par congélation.

La cryoconservation est basée sur la capacité de certaines petites molécules à pénétrer dans les cellules et à empêcher la déshydratation et la formation de cristaux de glace intracellulaires, qui peuvent provoquer la mort cellulaire et la destruction des organites cellulaires pendant le processus de congélation. Deux agents cryoprotecteurs courants sont le diméthylsulfoxyde (DMSO) et le glycérol. Le glycérol est principalement utilisé pour la cryoprotection des globules rouges, et le DMSO est utilisé pour la protection de la plupart des autres cellules et tissus. Un sucre appelé tréhalose, présent dans les organismes capables de survivre à une déshydratation extrême, est utilisé pour les méthodes de cryoconservation par lyophilisation. Le tréhalose stabilise les membranes cellulaires et est particulièrement utile pour la conservation du sperme, des cellules souches et des cellules sanguines.

La plupart des systèmes de cryoconservation cellulaire utilisent un congélateur à vitesse contrôlée. Ce système de congélation délivre de l'azote liquide dans une enceinte fermée dans laquelle la suspension cellulaire est placée. Une surveillance attentive de la vitesse de congélation permet d'éviter une déshydratation cellulaire rapide et la formation de cristaux de glace. En général, les cellules sont prises de la température ambiante à environ -90 °C (-130 °F) dans un congélateur à vitesse contrôlée. La suspension cellulaire congelée est ensuite transférée dans un congélateur à azote liquide maintenu à des températures extrêmement froides avec de l'azote soit en phase vapeur, soit en phase liquide. La cryoconservation basée sur la lyophilisation ne nécessite pas l'utilisation de congélateurs à azote liquide.

Une application importante de la cryoconservation est la congélation et le stockage des cellules souches hématopoïétiques, qui se trouvent dans la moelle osseuse et le sang périphérique. Dans le sauvetage de moelle osseuse autologue, des cellules souches hématopoïétiques sont prélevées dans la moelle osseuse d'un patient avant le traitement par chimiothérapie à haute dose. Après le traitement, les cellules cryoconservées du patient sont décongelées et réinjectées dans le corps. Cette procédure est nécessaire, car la chimiothérapie à haute dose est extrêmement toxique pour la moelle osseuse. La capacité de cryoconserver les cellules souches hématopoïétiques a considérablement amélioré les résultats du traitement de certains lymphomes et tumeurs malignes solides. Dans le cas des patients atteints de leucémie, leurs cellules sanguines sont cancéreuses et ne peuvent pas être utilisées pour le sauvetage autologue de la moelle osseuse. En conséquence, ces patients s'appuient sur du sang cryoconservé prélevé dans le cordon ombilical de nouveau-nés ou sur des cellules souches hématopoïétiques cryoconservées provenant de donneurs. Depuis la fin des années 1990, il a été reconnu que les cellules souches hématopoïétiques et les cellules souches mésenchymateuses (dérivées du tissu conjonctif embryonnaire) sont capables de se différencier en tissus musculaires squelettiques et cardiaques, en tissus nerveux et en os. Aujourd'hui, il existe un intérêt intense pour la croissance de ces cellules dans les systèmes de culture tissulaire, ainsi que pour la cryoconservation de ces cellules pour une thérapie future pour une grande variété de troubles, y compris les troubles des systèmes nerveux et musculaire et les maladies du foie et du cœur. .

La cryoconservation est également utilisée pour congeler et conserver les embryons et les spermatozoïdes humains. Il est particulièrement utile pour la congélation d'embryons supplémentaires générés par la fécondation in vitro (FIV). Un couple peut choisir d'utiliser des embryons cryoconservés pour les grossesses ultérieures ou en cas d'échec de la FIV avec des embryons frais. Lors du transfert d'embryons congelés, les embryons sont décongelés et implantés dans l'utérus de la femme. Le transfert d'embryons congelés est associé à une augmentation faible mais significative du risque de cancer infantile chez les enfants nés de ces embryons.

L'hypothermie profonde, une forme de cryoconservation légère utilisée chez les patients humains, a des applications importantes. L'induction d'une hypothermie profonde est couramment utilisée pour les interventions chirurgicales cardiovasculaires complexes. Une fois que le patient a été placé sous circulation extracorporelle complète, à l'aide d'un cœur-poumon artificiel, le sang passe à travers une chambre de refroidissement. Le refroidissement contrôlé du patient peut atteindre des températures extrêmement basses d'environ 10 à 14 °C (50 à 57 °F). Cette quantité de refroidissement arrête efficacement toute activité cérébrale et protège tous les organes vitaux. Lorsque ce refroidissement extrême est atteint, la machine cœur-poumon peut être arrêtée et le chirurgien peut corriger des anomalies aortiques et cardiaques très complexes lors d'un arrêt circulatoire. Pendant ce temps, aucun sang ne circule à l'intérieur du patient. Une fois la chirurgie terminée, le sang est progressivement réchauffé dans le même échangeur de chaleur utilisé pour le refroidissement. Le retour progressif à la température corporelle normale entraîne la reprise des fonctions normales du cerveau et des organes. Cette hypothermie profonde est cependant loin de la congélation et de la cryoconservation à long terme.

Les cellules peuvent vivre plus d'une décennie si elles sont correctement congelées. De plus, certains tissus, tels que les glandes parathyroïdes, les veines, les valves cardiaques et le tissu aortique, peuvent être cryoconservés avec succès. La congélation est également utilisée pour stocker et maintenir la viabilité à long terme des premiers embryons humains, des ovules (œufs) et du sperme. Les procédures de congélation utilisées pour ces tissus sont bien établies et, en présence d'agents cryoprotecteurs, les tissus peuvent être conservés pendant de longues périodes à des températures de -14 °C (6,8 °F).

La recherche a montré que des animaux entiers congelés en l'absence d'agents cryoprotecteurs peuvent produire des cellules viables contenant de l'ADN intact lors de la décongélation. Par exemple, des noyaux de cellules cérébrales de souris entières conservés à -20 °C (-4 °F) pendant plus de 15 ans ont été utilisés pour générer des lignées de cellules souches embryonnaires. Ces cellules ont ensuite été utilisées pour produire des clones de souris.


L'ADN tactile, les cellules invisibles que les humains transfèrent à tout ce que nous contactons, est actuellement en cours d'évaluation pour son potentiel à contaminer les preuves sur les scènes de crime. Bien qu'apprécié pour sa capacité à obtenir des preuves là où l'ADN visible (comme le sang, le sperme, les cheveux ou la salive) ne peut pas être trouvé, certains chercheurs contestent la validité de ces preuves car les marqueurs génétiques microscopiques sont transférés si facilement.

Dans une étude de 2015 intitulée « Le transfert d'ADN secondaire pourrait-il faussement placer quelqu'un sur les lieux d'un crime ? Des chercheurs de l'Université d'Indianapolis ont effectué des expériences pour tester la sensibilité des transferts d'ADN tactile. La personne A a tenu une poignée de main avec la personne B pendant deux minutes, puis a manipulé un couteau. Le profil ADN de la personne B, qui n'a jamais touché l'arme, a été identifié sur l'écouvillon du manche de l'arme dans 85 % des échantillons. Dans un cinquième de ces expériences, la personne qui n'avait jamais touché directement le couteau a été identifiée comme le principal ou le seul contributeur de l'ADN sur le manche, selon l'étude.


Conservation des échantillons

L'alcool est un conservateur, pas un fixateur. L'alcool ne pénètre pas dans les tissus des invertébrés ainsi que les fixateurs tels que le formol. Par conséquent, à moins d'utiliser de l'alcool en quantité et concentration suffisantes, l'échantillon se décomposera. Nous n'utilisons pas de formol car c'est un cancérigène et un mutagène. Veuillez ne pas utiliser de colorants tels que le rose Bengale. Ils ne facilitent pas le tri des échantillons d'eau douce et certains colorants sont suspectés d'être cancérigènes.

Nous recommandons d'utiliser de l'éthanol dénaturé à 90-95% pour préserver les échantillons de terrain. Sélectionnez une qualité technique plutôt que réactive pour économiser sur les coûts. À moins d'avoir un permis spécial d'alcool, de tabac et d'armes à feu, vous ne pouvez acheter que de l'éthanol dénaturé. "Dénaturé" signifie que d'autres alcools et cétones malodorantes sont mélangés à l'éthanol pour l'empêcher d'être consommé.

L'alcool isopropylique (alcool à friction) peut également être utilisé à la rigueur. Il est disponible dans les épiceries, les pharmacies et les magasins discount. Si vous décidez d'utiliser de l'alcool isopropylique, achetez une concentration à 90 % plutôt qu'à 70 %.

Nous recommandons Tarr, LLC comme fournisseur d'alcool dans l'ouest des États-Unis. Une boîte de 5 gallons d'éthanol dénaturé Tarsol E2-190 coûte environ 50 $. Voir le Site Web de Tarr pour plus d'informations, y compris leur zone de service de livraison. Fisher ou VWR Scientific peuvent expédier de petites quantités d'éthanol dénaturé, mais à un coût plus élevé.

Comment conserver vos échantillons

Ne laissez jamais des échantillons sans conservateur exposés à la lumière directe du soleil car les invertébrés mourront et se décomposeront rapidement. Conservez les échantillons dans l'heure suivant le prélèvement. Les échantillons conservés n'ont pas besoin d'être réfrigérés, mais conservez-les dans un endroit frais à l'abri de la lumière directe du soleil. Soyez aussi doux que possible en manipulant les échantillons afin que les invertébrés soient préservés intacts, plutôt que broyés en morceaux.

Les flacons d'échantillons ne doivent pas être remplis à plus de la moitié d'un échantillon de sédiments, d'insectes et de débris (voir photo). Assurez-vous que l'échantillon est bien vidé de son eau avant de le transférer dans la bouteille. Remplissez ensuite la bouteille avec de l'éthanol dénaturé à 90-95% ou de l'alcool isopropylique. Retournez le flacon plusieurs fois pour vous assurer que l'alcool est bien mélangé à l'échantillon.

Pour les échantillons contenant beaucoup de détritus fins ou d'algues filamenteuses, qui retiennent beaucoup d'eau, nous recommandons de décanter la moitié de l'alcool en fin de journée et de le remplacer par de l'alcool frais.


Options d'homogénéisation du tissu foliaire pour l'isolement des acides nucléiques

De nombreuses méthodes ont été décrites pour préparer le tissu foliaire pour l'isolement des acides nucléiques et, comme la plupart des protocoles de laboratoire, il existe autant de variantes que de chercheurs. Généralement, le tissu foliaire est récolté et traité frais, congelé et traité cryogéniquement, ou congelé, lyophilisé, puis homogénéisé. Chaque variation peut avoir un impact sur la qualité de l'ADN, comme la taille des fragments isolés. Le protocole utilisé pour isoler l'ADN affectera également grandement la qualité de l'ADN, en particulier en ce qui concerne la contamination des polysaccharides et des polyphénols. Selon les besoins, la récolte et l'homogénéisation sont assorties pour un rendement optimal.

Il existe trois voies courantes par lesquelles le tissu foliaire est récolté avant la perturbation. La première consiste à récolter le tissu foliaire suivi d'une congélation. Placer le tissu dans un congélateur à -80°C fournit un environnement suffisamment froid qui préserve l'ADN et de nombreuses protéines, mais ne convient pas à la préservation de l'ARN. Même à -80°C, l'activité de l'eau et l'action de la nucléase sont suffisantes pour dégrader l'ARN, bien que lentement. Pour récolter les feuilles et préserver l'ARN, les échantillons doivent être congelés rapidement, généralement par immersion dans l'azote liquide. Pour préserver l'ARN, les échantillons doivent être maintenus en dessous de -120 °C, la température de transition vitreuse de l'eau. A cette température, toute activité biologique cesse. La deuxième option de préparation du tissu foliaire avant l'homogénéisation consiste à récolter, congeler puis lyophiliser les échantillons. La lyophilisation permet le stockage à long terme de l'ADN et des protéines (bien que toutes les protéines ne restent pas actives), mais encore une fois, l'ARN ne survit généralement pas au processus de lyophilisation. La lyophilisation des feuilles élimine l'eau qui, si elle est présente, peut altérer la concentration des analytes dans les tampons d'extraction. La troisième option pour préparer le tissu foliaire à la rupture consiste simplement à récolter les feuilles et à les homogénéiser pendant qu'elles sont fraîches. Avec l'avènement des tampons qui préservent l'ADN et l'ARN, tels que le Trizol, il est souvent pratique de perturber le tissu foliaire lors de la récolte.

Une fois les feuilles récoltées, l'une des nombreuses méthodes de broyage/homogénéisation est utilisée pour ouvrir les cellules. Vous trouverez ci-dessous un bref résumé de chaque méthode.

CryoCooler&trade, un outil de collecte et de transport d'échantillons thermosensibles ( vidéo ).

Broyage à l'azote liquide avec mortier et pilon

L'une des méthodes les plus traditionnelles et les plus courantes pour récolter les acides nucléiques des plantes consiste à broyer les feuilles dans de l'azote liquide avec un mortier et un pilon. Soit le mortier et le pilon peuvent être pré-refroidis et le broyage effectué à sec sur des feuilles congelées, soit les feuilles peuvent être immergées dans de l'azote liquide pour le broyage. Le broyage cryogénique est une technique très efficace pour prélever des substances dures, comme des tissus végétaux et animaux, et les transformer en poussière. Les glucides tenaces des tissus végétaux deviennent très fragiles à -196°C et se brisent facilement. Les deux problèmes avec le broyage cryogénique sont que l'échantillon peut se réchauffer et, deuxièmement, le débit est très faible. Il est possible d'empêcher le réchauffement de l'échantillon en ajoutant de l'azote liquide supplémentaire au mortier tout en pulvérisant l'échantillon. Le faible débit est un problème plus difficile car un mortier ne peut être utilisé qu'une seule fois avant de devoir être nettoyé. Comme le mortier et les pilons sont généralement en céramique, cela signifie que l'ensemble doit être réchauffé progressivement avant d'être nettoyé. Les matériaux broyés dans la surface du mortier peuvent être difficiles à enlever et peuvent donc agir comme un contaminant.

Perturbation via Homogénéisateur : Rotor-Stators et Blenders

Pour les échantillons frais ou lyophilisés, l'homogénéisation peut être obtenue en cisaillant les feuilles avec une lame. L'homogénéisateur à lames le plus simple est un mélangeur, qui peut parfois être tout à fait adéquat pour perturber les échantillons. Bien qu'efficaces pour les milkshakes, les mélangeurs sont mieux utilisés pour le cisaillement tandis que les rotors stators sont l'outil préféré pour perturber efficacement les tissus. Les rotors stators ont une pale circulaire en rotation appelée rotor à l'intérieur d'un tube avec des fentes, connu sous le nom de stator. Lorsque la lame passe les fentes, elle agit comme un ciseau fin et cisaille tout ce qui chevauche la fente. As the rotors can turn at 20,000 rpm, this makes the rotor-stator very efficient at tearing open cells. The problem with both blenders and rotor-stators is throughput. These homogenizers must be cleaned between use, and in both cases, this may require taking apart the blade assembly.

Where mortar and pestle and homogenizers fall short in throughput, bead beating makes it up. Bead beating is accomplished using a mixer mill, which is basically a machine that rapidly shakes samples which have been mixed with balls. The balls crash around and effectively shear and crack cells and tissues. For microorganisms, small beads of several hundred microns are mixed with the microbe in a microfuge tubes which can be vortexed. Some vortexers will hold multiple tubes making the processing of many samples relatively easy. However, with leaf tissues, it is most practical to use vials or deep well plates and large stainless steel balls. With Vial Sets that use 4 ml polycarbonate vials, the balls are large being 3/8" in diameter. Several hundred milligrams of tissue can be disrupted using a vial. Larger vials can also accommodate up to five grams of leaf tissue. But the most widely used method for homogenizing leaf tissue is to punch leaf holes with a paper punch and drop one disk into a deep well of a microplate along with a 5/32" stainless steel ball. Using a high throughput homogenizer that holds deep well plates, multiple samples can be processed in minutes.

Freezing is often used to store harvested leaves

Harvesting fresh tissue for immediate homogenization is dependent upon throughput and practicality.


Searching for Evidence

Marilyn T. Miller , Peter Massey , in The Crime Scene , 2016

Chemical Evidence Visualization and Enhancement

Latent Fingerprints and Other Impressions

There are various methods for the visualization and enhancement of latent fingerprints and impression evidence (see Table 6.2 ). Special methods of visualization sometimes will combine the ALS with physical and chemical techniques. These combination methods are especially useful for latent fingerprints. The enhancement reagents are based on their chemical composition and the chemical reactions that occur when reacting with the various types of patterned impression evidence. The enhancement reagents for latent fingerprint enhancement react with chemicals found in the residues deposited on various surfaces.

Table 6.2 . Fingerprint and Impression Visualization and Enhancement

Reagent Use
Blood enhancementAmido black
Coomassie blue
Crowle’s double stain
Diaminobenzidine (DAB)
Fluorescéine
Leucocrystal violet
Luminol
Latent printsPowder dusting
Ninhydrin
Superglue (hotshots, cyanowand, pouches)
Sticky surface powder
1,8-Diazafluoren-9-one (DFO)
Small particle reagent
Ardrox
Rhodamine 6G

Latent fingerprints on nonporous surfaces: the secretions from the pores of the friction ridges on skin will contain water, salt, proteins, and oily substances. These secretions will be visible using oblique lighting methods followed by dusting with contrasting colored powders (black powder on light backgrounds or light powder on dark backgrounds). Magnetic and fluorescent powders are also used on this surface. Care must be taken not to “overdust” the surface.

Latent fingerprints on porous surfaces: for this visualization a chemical reaction between the secretions and applied reagent occurs. It is a protein-based color reaction as discussed above. Ninhydrin remains the most successful reagent for this visualization method.

Latent fingerprints on sticky surfaces: this visualization is easily seen with oblique lighting but can be enhanced using a solution of dusting powder in water with a couple drops of a surfactant (dish cleaning soap). Once brushed on the sticky surface a quick rinse with water will visualize the fingerprints or other impression.

Latent fingerprints on a wet surface (porous and nonporous): this visualization and enhancement method is a chemical reaction of the wet surface reagent, small particle reagent, and the secretion chemicals. A black product is formed that visualizes the fingerprint pattern. The reagent is applied by spraying or immersion directly on to the wet surface. Overspraying is not a problem. See Figure 6.12 .

Figure 6.12 . Spraying small particle reagent on wet surfaces—porous and nonporous.

Superglue fuming: for this visualization and enhancement technique cyanoacrylate or superglue is used. It self-polymerizes upon exposure to the air. This polymer will coat the nonporous surface with the latent fingerprint so that it can be powder dusted. Portable fuming tanks can be transported to crime scenes for processing there or larger fixed tanks in laboratories are useful, too. It is possible to overfume the surface that will make dusting of the coated secretions impossible. Additionally, later collection for touch-DNA cannot be done after superglue application. See Figure 6.13 .

Figure 6.13 . Too much superglue.

Gunshot Residue

When a firearm is discharged, it creates gases, soot, and burned or partially burned gunpowder particles that are deposited on any and all surfaces at the crime scene, but especially on the shooter’s hand and the intended target. GSR comes from detonation of the primer, gunpowder, lubricants, or components of the projectile. These materials are propelled forward with the projectile toward the target and many will fall on the surfaces of any nearby objects. Searching for GSR is done for two reasons: (1) to determine if an individual fired or handled a recently discharged firearm and (2) to analyze the pattern of GSR for the purpose of determining the muzzle-to-target distance. Any test designed to detect GSR must be used in a manner that minimizes the potential for damaging the GSR pattern. GSR is not evidence that will remain for a long period of time especially if it lands on a target that may move. For this reason the visualization and enhancement of GSR must be done within 2–4 h of firearm discharge. Documentation, preservation, and collection by correct methods should follow immediately. See Figure 6.14 .

Figure 6.14 . Gunshot residue on clothing and enhancement.

These visualization and enhancement reagents react with nitrate and nitrite compounds in GSR, yielding a colored reaction or pattern. The modified Greiss reagent, diphenylamine, and sodium rhodizonate reagents will produce colored products when reacting with GSR components. Reagents can be used as swabbed color tests or by a spraying application. Attention to false positives from cigarette smoke, urine, and fertilizer is important to consider before interpretation is attempted.

Explosive Residues

Explosives are chemical substances, which are unstable in their natural form. When heated, shocked, or ignited, they are capable of rapid chemical reaction, producing an explosion by the liberation of large quantities of heat and gas often followed by fire. Explosive residues may be encountered in numerous forms at scene. Explosive residues may be located on the hands or clothes of a suspect, at storage or production scenes, and in vehicles or containers used to transport the explosive material. At postblast crime scenes there may be both unexploded explosive material and products of the explosion.

Searching for explosive residues can be done by portable hydrocarbon or ion “sniffers.” Canine programs have reported significant success detecting minute amounts of explosive materials. The visualization and enhancement of explosive residues is not usually done but preliminary testing for screening purposes can be done. The color reagents that give characteristic colors are the same as the GSR reagents. These reagents react with nitrate and nitrite compounds found in all three categories of explosives to produce color reactions. As with the GSR these reagents can be used as swabbed color tests or by a spraying application. Positive reactions are only indicative and require collection for laboratory confirmation.

Controlled Substances and Drugs

Crime scenes are often part of drug investigations like clandestine labs or other crimes relating to drug cases. As such, crime scene investigators may be asked to search the scenes for controlled substances on a variety of surfaces. For these reasons, there is often a need for a quick screening test or field test to analyze a material suspected of being a drug or controlled substance. In many situations, this field test helps provide the necessary probable cause to substantiate an arrest for sale and/or possession of a controlled substance.

Certain drugs will react with selected chemical reagents to give characteristic color changes or precipitates. Easy-to-use kits with widespread use are commercially available which contain these reagents in convenient single-test vials. Some commonly used drug-screening reagents and their characteristic reactions are shown in Table 6.3 .

Table 6.3 . Screening Tests for Drug Substances

ReagentApplicationRésultat
MarquisLarge variety general reagentOpiates = purple
PCP = colorless to light pink
Phenethylamines = orange to brown
LSD = orange/brown/purple
Mescaline and psilocybin = orange
MandelinVariety phenethylaminesOpiates = blue-gray
Ampethamines = green
LSD = orange/green/gray
Psilocybin = green
Conc. nitric acidMorphine vs heroinMorphine = orange to red
Heroin = yellow to green
DuquenoisMarihuana THCMarihuana, THC, and Hashish = blue-violet
Cobalt thiocyanateCocaine and derivatives“Cocaines” = blue precipitate
Dille–KoppanyiBarbituratesRed-violet

Portable Instrumentation for Visualization and Enhancement

There are many different instruments that have moved out of the forensic laboratory and into the field and crime scenes. For many years the only instrument at the crime scene was the metal detector, but now it is common to find portable ground penetrating radar, portable X-ray detectors, and a variety of classic lab instruments like Fourier transform infrared spectroscopy and Raman spectroscopy, even gas chromatography–mass spectroscopy. The negative for these portable instruments remains the availability of the scientist to get to the scene to operate the instrument. See Figure 6.15 .