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Aide à la lecture du chromatogramme

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Une variation génétique se retrouve dans ce chromatogramme :

Il dit que la "séquence de référence" est la ligne du haut et que je peux utiliser le code génétique général pour trouver le cadre de lecture.

Je peux voir qu'il y a deux N au lieu d'un G et d'un C. Cependant, je ne sais pas ce que cela signifie. Je ne sais pas non plus comment je trouverais le cadre de lecture ? Je suppose que je pourrais chercher un codon de départ et d'arrêt, mais je pourrais les lire dans les deux sens ?

Dernière question : ce changement est-il probablement pathogène ? Je ne sais pas comment classer une variation comme pathogène ou non.


Ainsi, les deux N que vous voyez ne sont pas nécessairement des variantes, mais plutôt des lectures de mauvaise qualité. Essentiellement, lorsque vous séquencez l'ADN et que le séquenceur ne peut pas appeler la base, il la désignera simplement N, ce qui signifie que la base pourrait être l'une des quatre bases d'ADN.

En ce qui concerne la recherche de la lecture, si vous savez que cette séquence contient un codon d'arrêt, cela aide, et recherchez simplement l'une des séquences d'arrêt. Sinon, recherchez les bases qui correspondent aux séquences de codons et si vous obtenez un brin complet de séquence qui code pour les acides aminés, vous aurez probablement raison.

Pour référence, voici un lien vers un tableau de codons qui vous aidera à déchiffrer le cadre de lecture.

Est ce que ça aide?


Les traces que vous avez proviennent du séquençage de Sanger. N en génétique signifie nucléotide (surprenant non ?). N est utilisé lorsque la base à un emplacement donné est inconnue (ou pourrait être n'importe quelle paire de bases).

Dans votre cas, vous avez des N parce que le logiciel d'appel de base est incapable de déterminer le nucléotide. Le premier N est dû au chevauchement de deux pics (signaux G et A) et le second devrait être un C plutôt qu'un N.

D'après ce que je peux voir, vous n'avez aucune mutation apparente, donc il est peu probable que ces changements soient pathogènes. Une mutation peut être appelée lorsque vous savez qu'une base dans la référence est modifiée dans votre échantillon, ce qui n'est pas le cas ici (simplement N -> G et un N -> C). Les signaux pour vos Ns semblent très similaires entre votre référence et votre échantillon, ce qui ne suggère donc pas une mutation.

Pour le cadre de lecture, vous devez rechercher un codon de départ (ATG) et un codon d'arrêt (TAG,TAA ou TGA) pour identifier le cadre de lecture ouvert (ORF). Plusieurs logiciels le font et voici un lien vers un outil NCBI en ligne appelé ORF Finder.

Comme vous l'avez souligné, l'ORF peut également être dans le brin inverse. Vous ne voulez pas regarder l'ordre inverse mais au complémentaire inverse séquence. Habituellement, les outils de détection des ORF ont la possibilité d'examiner les deux volets.


Aide à la lecture du chromatogramme - Biologie

Un chromatogramme (parfois aussi appelé électrophérogramme) est la représentation visuelle d'un échantillon d'ADN produit par une machine de séquençage (telle que le système de détection de séquence ABI PRISM 7700 d'Applied Biosystems).

Fig. 1 - Exemple de chromatogramme. Les barres vertes au-dessus du chromatogramme indiquent des scores de confiance élevés.

L'assembleur de séquences d'ADN prend en charge les fichiers de chromatogrammes SCF et ABI (ABI, AB, AB!, AB1). Pour ouvrir un fichier de chromatogramme, double-cliquez simplement dessus dans Project Manager.

Les fichiers de chromatogrammes peuvent être facilement convertis en ABI, FASTA, SEQ ou TXT avec des outils tels que l'assembleur de séquences d'ADN, l'explorateur de chromatogrammes d'ADN, le convertisseur Batch ABI en FASTA. Veuillez consulter la page de téléchargement pour plus de détails.

Qu'est-ce qu'un bon chromatogramme ?

Avec DNA Baser, il est facile de faire la différence entre un bon chromatogramme (de confiance) et un mauvais. Il suffit de regarder les barres vertes affichées au-dessus de chaque base. Ces barres représentent les scores de confiance. Une barre haute signifie que l'appel de base est fiable. Une barre basse signifie que l'appel de base n'est pas fiable.

Habituellement, de mauvais chromatogrammes créent des ambiguïtés indésirables dans votre contig. Cependant, si vous assemblez un bon chromatogramme et un mauvais, DNA Baser saura extraire les informations utiles du bon chromatogramme et accordera moins de confiance au mauvais chromatogramme.

- pas d'ambiguïté
- pas de bruit
- pics très bien espacés


Lectures de qualité moyenne
- quelques ambiguïtés
- les pics sont encore bien espacés
- certains tronçons homopolymères ne sont pas bien résolus

- la différence entre le bruit et le signal est très faible

- l'amplitude globale du signal est faible

- faible confiance dans l'attribution des bases (faible score de confiance)

Certains de mes fichiers de chromatogramme ABI sont corrompus


Le format ABI a été inventé il y a longtemps. Il peut être considéré comme un format obsolète car il a des problèmes pour stocker de grandes séquences/chromatogrammes. Souvent, les fichiers ABI générés par certaines machines sont corrompus. Lorsque DNA Sequence Assembler rencontre un chromatogramme corrompu, il essaiera automatiquement de restaurer les données et il rédigera un rapport (dans le même dossier où se trouve le fichier) pour ce fichier de chromatogramme corrompu.

Pourquoi le format SCF est meilleur que le format ABI ?


Non seulement ce format SCF n'a pas le bogue mentionné ci-dessus, mais il offre de nombreuses autres fonctionnalités supplémentaires. De plus, le format SCF a été conçu pour être facilement compressé (à l'aide de programmes comme WinRar ou WinZip). Ceci est très important pour les entreprises qui stockent de grandes quantités de fichiers de chromatogrammes.
Nous vous recommandons fortement d'utiliser le format SCF au lieu d'ABI.

Détails sur les fichiers de chromatogramme

BioSoft fournit des outils logiciels d'assemblage et d'analyse de séquences efficaces, conviviaux pour les biologistes et faciles à utiliser pour répondre aux besoins en constante évolution des chercheurs et diagnostiqueurs génétiques/médicaux d'aujourd'hui. Tous nos outils logiciels sont le résultat de collaborations étroites et efficaces avec la communauté génétique. Par conséquent, si l'un de nos logiciels ne répond pas exactement à vos besoins, n'hésitez pas à nous contacter.


Contenu

La chromatographie, prononcée / ˌ k r oʊ m ə ˈ t ɒ ɡ r ə f i / , est dérivée du grec χρῶμα chrominance, qui signifie "couleur", et γράφειν graphéine, qui signifie "écrire". La combinaison de ces deux termes est directement héritée de l'invention de la technique d'abord utilisée pour séparer les pigments. [3]

La chromatographie a été conçue pour la première fois en Russie par le scientifique d'origine italienne Mikhail Tsvet en 1900. [4] Il a développé la technique, il a inventé chromatographie, dans la première décennie du 20e siècle, principalement pour la séparation des pigments végétaux tels que la chlorophylle, les carotènes et les xanthophylles. Étant donné que ces composants se séparent en bandes de couleurs différentes (respectivement vert, orange et jaune), ils ont directement inspiré le nom de la technique. De nouveaux types de chromatographie développés au cours des années 1930 et 1940 ont rendu la technique utile pour de nombreux processus de séparation. [5]

La technique de chromatographie s'est considérablement développée à la suite des travaux d'Archer John Porter Martin et de Richard Laurence Millington Synge au cours des années 1940 et 1950, pour lesquels ils ont remporté le prix Nobel de chimie en 1952. [6] Ils ont établi les principes et les techniques de base de la chromatographie de partage et leurs travaux ont encouragé le développement rapide de plusieurs méthodes chromatographiques : la chromatographie sur papier, la chromatographie en phase gazeuse et ce qui allait devenir la chromatographie liquide à haute performance. Depuis lors, la technologie a évolué rapidement. Les chercheurs ont découvert que les grands principes de la chromatographie de Tsvet pouvaient être appliqués de différentes manières, résultant en les différentes variétés de chromatographie décrites ci-dessous. Les progrès améliorent continuellement les performances techniques de la chromatographie, permettant la séparation de molécules de plus en plus similaires.

  • Analyte – la substance à séparer lors de la chromatographie. C'est aussi normalement ce qui est nécessaire du mélange.
  • Chromatographie analytique – l'utilisation de la chromatographie pour déterminer l'existence et éventuellement la concentration d'analyte(s) dans un échantillon.
  • Phase collée – une phase stationnaire qui est liée de manière covalente aux particules de support ou à la paroi interne du tube de la colonne.
  • Chromatogramme – le rendement visuel du chromatographe. Dans le cas d'une séparation optimale, différents pics ou motifs sur le chromatogramme correspondent à différents composants du mélange séparé.

La chromatographie est basée sur le concept de coefficient de partage. Tout soluté se partage entre deux solvants non miscibles. Lorsque nous rendons un solvant immobile (par adsorption sur une matrice de support solide) et un autre mobile, il en résulte les applications les plus courantes de la chromatographie. Si le support de matrice, ou phase stationnaire, est polaire (par exemple papier, silice, etc.), il s'agit d'une chromatographie en phase directe, et s'il est non polaire (C-18), il s'agit d'une phase inverse.

Chromatographie sur colonne Modifier

La chromatographie sur colonne est une technique de séparation dans laquelle le lit fixe est à l'intérieur d'un tube. Les particules de la phase stationnaire solide ou du support enrobé d'une phase stationnaire liquide peuvent remplir tout le volume intérieur du tube (colonne garnie) ou être concentrées sur ou le long de la paroi interne du tube en laissant un chemin ouvert et sans restriction pour la phase mobile dans la partie médiane du tube (colonne tubulaire ouverte). Les différences de vitesses de déplacement à travers le milieu sont calculées pour différents temps de rétention de l'échantillon. [8] [9] En 1978, W. Clark Still a introduit une version modifiée de la chromatographie sur colonne appelée chromatographie éclair sur colonne (éclat). [10] [11] La technique est très similaire à la chromatographie sur colonne traditionnelle, sauf que le solvant est entraîné à travers la colonne en appliquant une pression positive. Cela a permis d'effectuer la plupart des séparations en moins de 20 minutes, avec des séparations améliorées par rapport à l'ancienne méthode. Les systèmes de chromatographie flash modernes sont vendus sous forme de cartouches en plastique pré-emballées, et le solvant est pompé à travers la cartouche. Les systèmes peuvent également être reliés à des détecteurs et des collecteurs de fractions assurant l'automatisation. L'introduction de pompes à gradient a entraîné des séparations plus rapides et une utilisation moindre de solvant.

Dans l'adsorption en lit expansé, un lit fluidisé est utilisé, plutôt qu'une phase solide constituée d'un lit tassé. Cela permet d'omettre les étapes de compensation initiales telles que la centrifugation et la filtration, pour les bouillons de culture ou les suspensions de cellules brisées.

La chromatographie sur phosphocellulose utilise l'affinité de liaison de nombreuses protéines de liaison à l'ADN pour la phosphocellulose. Plus l'interaction d'une protéine avec l'ADN est forte, plus la concentration en sel nécessaire pour éluer cette protéine est élevée. [12]

Chromatographie planaire Modifier

Chromatographie planaire est une technique de séparation dans laquelle la phase stationnaire est présente sous forme ou sur un plan. Le plan peut être un papier, servant tel quel ou imprégné par une substance comme le lit fixe (chromatographie sur papier) ou une couche de particules solides étalées sur un support tel qu'une plaque de verre (chromatographie sur couche mince). Différents composés dans le mélange d'échantillons parcourent des distances différentes selon la force avec laquelle ils interagissent avec la phase stationnaire par rapport à la phase mobile. Le facteur de rétention spécifique (RF) de chaque produit chimique peut être utilisé pour faciliter l'identification d'une substance inconnue.

Chromatographie sur papier Modifier

La chromatographie sur papier est une technique qui consiste à placer un petit point ou une ligne de solution échantillon sur une bande de papier de chromatographie. Le papier est placé dans un récipient avec une couche peu profonde de solvant et scellé. Au fur et à mesure que le solvant monte à travers le papier, il rencontre le mélange échantillon, qui commence à remonter le papier avec le solvant. Ce papier est fait de cellulose, une substance polaire, et les composés contenus dans le mélange voyagent plus loin s'ils sont moins polaires. Les substances plus polaires se lient plus rapidement au papier cellulosique et ne voyagent donc pas aussi loin.

Chromatographie sur couche mince (CCM) Modifier

La chromatographie sur couche mince (CCM) est une technique de laboratoire largement utilisée pour séparer différents produits biochimiques sur la base de leurs attractions relatives aux phases stationnaire et mobile. C'est similaire à la chromatographie sur papier. Cependant, au lieu d'utiliser une phase stationnaire de papier, il s'agit d'une phase stationnaire d'une fine couche d'adsorbant comme du gel de silice, de l'alumine ou de la cellulose sur un substrat plat et inerte. La TLC est très polyvalente, plusieurs échantillons peuvent être séparés simultanément sur la même couche, ce qui la rend très utile pour les applications de dépistage telles que le test des niveaux de médicament et de la pureté de l'eau. [13] La possibilité de contamination croisée est faible puisque chaque séparation est effectuée sur une nouvelle couche. Par rapport au papier, il présente l'avantage de cycles plus rapides, de meilleures séparations, de meilleures analyses quantitatives et le choix entre différents adsorbants. Pour une résolution encore meilleure et une séparation plus rapide qui utilise moins de solvant, une CCM haute performance peut être utilisée. Une utilisation populaire plus ancienne consistait à différencier les chromosomes en observant la distance dans le gel (la séparation des était une étape distincte).

Le principe de base de la chromatographie par déplacement est le suivant : Une molécule avec une affinité élevée pour la matrice de chromatographie (le déplaceur) entre en compétition efficacement pour les sites de liaison, et déplace ainsi toutes les molécules avec des affinités moindres. [14] Il existe des différences distinctes entre la chromatographie de déplacement et la chromatographie d'élution. En mode d'élution, les substances émergent généralement d'une colonne en pics gaussiens étroits. Une large séparation des pics, de préférence jusqu'à la ligne de base, est souhaitée pour une purification maximale. La vitesse à laquelle tout composant d'un mélange descend dans la colonne en mode d'élution dépend de nombreux facteurs. Mais pour que deux substances se déplacent à des vitesses différentes et soient ainsi résolues, il doit y avoir des différences substantielles dans certaines interactions entre les biomolécules et la matrice de chromatographie. Les paramètres de fonctionnement sont ajustés pour maximiser l'effet de cette différence. Dans de nombreux cas, la séparation de la ligne de base des pics ne peut être obtenue qu'avec une élution par gradient et de faibles charges de colonne. Ainsi, deux inconvénients de la chromatographie en mode d'élution, en particulier à l'échelle préparative, sont la complexité opérationnelle, due au pompage par gradient de solvant, et le faible débit, en raison des faibles charges de colonne. La chromatographie par déplacement présente des avantages par rapport à la chromatographie d'élution en ce que les composants sont résolus en zones consécutives de substances pures plutôt qu'en "pics". Étant donné que le procédé tire parti de la non-linéarité des isothermes, une alimentation de colonne plus importante peut être séparée sur une colonne donnée avec les composants purifiés récupérés à des concentrations significativement plus élevées.

Chromatographie en phase gazeuse Modifier

La chromatographie en phase gazeuse (GC), également parfois appelée chromatographie gaz-liquide (GLC), est une technique de séparation dans laquelle la phase mobile est un gaz. La séparation par chromatographie en phase gazeuse est toujours effectuée dans une colonne, qui est typiquement "à garnissage" ou "capillaire". Les colonnes remplies sont les chevaux de bataille de routine de la chromatographie en phase gazeuse, étant moins chères et plus faciles à utiliser et offrant souvent des performances adéquates. Les colonnes capillaires donnent généralement une résolution bien supérieure et bien que plus chères, elles sont de plus en plus utilisées, en particulier pour les mélanges complexes. En outre, les colonnes capillaires peuvent être divisées en trois classes : les colonnes tubulaires ouvertes à couche poreuse (PLOT), les colonnes tubulaires ouvertes à revêtement mural (WCOT) et les colonnes tubulaires ouvertes à revêtement de support (SCOT). Les colonnes PLOT sont uniques en ce sens que la phase stationnaire est adsorbée sur les parois de la colonne, tandis que les colonnes WCOT ont une phase stationnaire qui est chimiquement liée aux parois. Les colonnes SCOT sont en quelque sorte la combinaison des deux types mentionnés de telle sorte qu'elles ont des particules de support adhérant aux parois de la colonne, mais ces particules ont une phase liquide chimiquement liée sur elles. [15] Les deux types de colonnes sont fabriqués à partir de matériaux non adsorbants et chimiquement inertes. L'acier inoxydable et le verre sont les matériaux habituels pour les colonnes garnies et le quartz ou la silice fondue pour les colonnes capillaires.

La chromatographie en phase gazeuse est basée sur un équilibre de partage de l'analyte entre une phase stationnaire liquide solide ou visqueuse (souvent un matériau liquide à base de silicone) et un gaz mobile (le plus souvent de l'hélium). La phase stationnaire est collée à l'intérieur d'un tube en verre ou en silice fondue de petit diamètre (généralement de 0,53 à 0,18 mm de diamètre intérieur) (une colonne capillaire) ou d'une matrice solide à l'intérieur d'un tube métallique plus grand (une colonne garnie). Il est largement utilisé en chimie analytique bien que les températures élevées utilisées en GC le rendent inadapté aux biopolymères ou aux protéines de haut poids moléculaire (la chaleur les dénature), fréquemment rencontrés en biochimie, il est bien adapté pour une utilisation dans la pétrochimie, la surveillance environnementale et la remédiation, et les domaines de la chimie industrielle. Il est également largement utilisé dans la recherche en chimie.

Chromatographie liquide Modifier

La chromatographie liquide (LC) est une technique de séparation dans laquelle la phase mobile est un liquide. Elle peut être réalisée soit dans une colonne, soit dans un plan. La chromatographie liquide actuelle qui utilise généralement de très petites particules de remplissage et une pression relativement élevée est appelée chromatographie liquide à haute performance (HPLC).

En HPLC, l'échantillon est forcé par un liquide à haute pression (la phase mobile) à travers une colonne remplie d'une phase stationnaire composée de particules de forme irrégulière ou sphérique, d'une couche monolithique poreuse ou d'une membrane poreuse. La HPLC est historiquement divisée en deux sous-classes différentes en fonction de la polarité des phases mobile et stationnaire. Les méthodes dans lesquelles la phase stationnaire est plus polaire que la phase mobile (par exemple, le toluène comme phase mobile, la silice comme phase stationnaire) sont appelées chromatographie liquide en phase normale (NPLC) et l'inverse (par exemple, le mélange eau-méthanol comme et C18 (octadécylsilyle) comme phase stationnaire) est appelée chromatographie liquide en phase inverse (RPLC).

Les techniques spécifiques sous cette rubrique générale sont énumérées ci-dessous.

La chromatographie d'affinité [16] est basée sur une interaction sélective non covalente entre un analyte et des molécules spécifiques. Il est très spécifique, mais pas très robuste. Il est souvent utilisé en biochimie dans la purification de protéines liées à des tags. Ces protéines de fusion sont marquées avec des composés tels que des balises His, de la biotine ou des antigènes, qui se lient spécifiquement à la phase stationnaire. Après purification, certains de ces marqueurs sont généralement retirés et la protéine pure est obtenue.

La chromatographie d'affinité utilise souvent l'affinité d'une biomolécule pour un métal (Zn, Cu, Fe, etc.). Les colonnes sont souvent préparées manuellement. Les colonnes d'affinité traditionnelles sont utilisées comme étape préparatoire pour éliminer les biomolécules indésirables.

Cependant, il existe des techniques HPLC qui utilisent des propriétés de chromatographie d'affinité. La chromatographie d'affinité avec un métal immobilisé (IMAC) [17] [18] est utile pour séparer les molécules susmentionnées en fonction de l'affinité relative pour le métal (c'est-à-dire Dionex IMAC). Souvent, ces colonnes peuvent être chargées avec différents métaux pour créer une colonne avec une affinité ciblée. [19]

Chromatographie en fluide supercritique Modifier

La chromatographie en phase fluide supercritique est une technique de séparation dans laquelle la phase mobile est un fluide au-dessus et relativement proche de sa température et pression critiques.

Chromatographie d'échange d'ions Modifier

La chromatographie d'échange d'ions (généralement appelée chromatographie d'ions) utilise un mécanisme d'échange d'ions pour séparer les analytes en fonction de leurs charges respectives. Elle est généralement réalisée en colonnes mais peut également être utile en mode planaire. La chromatographie par échange d'ions utilise une phase stationnaire chargée pour séparer les composés chargés, notamment les anions, les cations, les acides aminés, les peptides et les protéines. Dans les méthodes conventionnelles, la phase stationnaire est une résine échangeuse d'ions qui porte des groupes fonctionnels chargés qui interagissent avec des groupes de charges opposées du composé à retenir. Il existe deux types de chromatographie échangeuse d'ions : l'échange de cations et l'échange d'anions. Dans la chromatographie d'échange de cations, la phase stationnaire a une charge négative et l'ion échangeable est un cation, tandis que, dans la chromatographie d'échange d'anions, la phase stationnaire a une charge positive et l'ion échangeable est un anion. [20] La chromatographie d'échange d'ions est couramment utilisée pour purifier des protéines en utilisant la FPLC.

Chromatographie d'exclusion stérique Modifier

La chromatographie d'exclusion stérique (SEC) est également connue sous le nom de chromatographie par perméation de gel (GPC) ou chromatographie de filtration sur gel et sépare les molécules selon leur taille (ou plus précisément selon leur diamètre hydrodynamique ou leur volume hydrodynamique). Les molécules plus petites sont capables de pénétrer dans les pores du support et, par conséquent, les molécules sont piégées et retirées du flux de la phase mobile. Le temps de séjour moyen dans les pores dépend de la taille effective des molécules d'analyte. Cependant, les molécules qui sont plus grandes que la taille moyenne des pores du garnissage sont exclues et ne subissent donc pratiquement aucune rétention, ces espèces sont les premières à être éluées. Il s'agit généralement d'une technique de chromatographie à basse résolution et elle est donc souvent réservée à l'étape finale de "polissage" d'une purification. Elle est également utile pour déterminer la structure tertiaire et la structure quaternaire de protéines purifiées, d'autant plus qu'elle peut être réalisée dans des conditions de solution native.

Séparation chromatographique par adsorption sur lit expansé Modifier

Une colonne d'adsorption chromatographique sur lit expansé (EBA) pour un procédé de séparation biochimique comprend un distributeur de liquide d'équilibrage de pression ayant une fonction d'autonettoyage sous une plaque de tamis de blocage poreux au fond du lit expansé, un ensemble buse de partie supérieure ayant une fonction de nettoyage à contre-courant au sommet du lit expansé, une meilleure répartition de la liqueur de charge ajoutée dans le lit expansé garantissant que le fluide traversant la couche de lit expansé présente un état d'écoulement piston. La couche de lit expansé affiche un état d'écoulement de piston. La colonne de séparation chromatographique à lit expansé présente l'avantage d'augmenter l'efficacité de séparation du lit expansé.

La chromatographie d'adsorption sur lit expansé (EBA) est une technique pratique et efficace pour la capture de protéines directement à partir d'un échantillon brut non clarifié. En chromatographie EBA, le lit décanté est d'abord étendu par un flux ascendant de tampon d'équilibrage. La charge brute, un mélange de protéines solubles, de contaminants, de cellules et de débris cellulaires, est ensuite passée vers le haut à travers le lit expansé. Les protéines cibles sont capturées sur l'adsorbant, tandis que les particules et les contaminants passent à travers. Un changement de tampon d'élution tout en maintenant un flux ascendant entraîne une désorption de la protéine cible en mode lit expansé. Alternativement, si le flux est inversé, les particules adsorbées se déposent rapidement et les protéines peuvent être désorbées par un tampon d'élution. Le mode d'élution (lit expansé versus lit décanté) dépend des caractéristiques de la charge. Après l'élution, l'adsorbant est nettoyé avec une solution de nettoyage en place (NEP) prédéfinie, avec un nettoyage suivi d'une régénération de la colonne (pour une utilisation ultérieure) ou d'un stockage.

Chromatographie en phase inversée Modifier

La chromatographie en phase inverse (RPC) est toute procédure de chromatographie liquide dans laquelle la phase mobile est significativement plus polaire que la phase stationnaire. Il est ainsi nommé parce qu'en chromatographie liquide en phase normale, la phase mobile est nettement moins polaire que la phase stationnaire. Les molécules hydrophobes dans la phase mobile ont tendance à s'adsorber sur la phase stationnaire relativement hydrophobe. Les molécules hydrophiles dans la phase mobile auront tendance à s'éluer en premier. Les colonnes de séparation comprennent typiquement une chaîne carbonée en C8 ou C18 liée à un substrat de particules de silice.

Chromatographie d'interaction hydrophobe Modifier

Les interactions hydrophobes entre les protéines et la matrice chromatographique peuvent être exploitées pour purifier les protéines. Dans la chromatographie d'interaction hydrophobe, le matériau de la matrice est légèrement substitué par des groupes hydrophobes. Ces groupes peuvent aller des groupes méthyle, éthyle, propyle, octyle ou phényle. [21] À des concentrations élevées de sel, les chaînes latérales non polaires à la surface des protéines "interagissent" avec les groupes hydrophobes, c'est-à-dire que les deux types de groupes sont exclus par le solvant polaire (les effets hydrophobes sont augmentés par l'augmentation de la force ionique). Ainsi, l'échantillon est déposé sur la colonne dans un tampon fortement polaire. L'éluant est typiquement un tampon aqueux avec des concentrations de sel décroissantes, des concentrations croissantes de détergent (qui perturbent les interactions hydrophobes) ou des changements de pH.

En général, la chromatographie d'interaction hydrophobe (HIC) est avantageuse si l'échantillon est sensible aux changements de pH ou aux solvants agressifs généralement utilisés dans d'autres types de chromatographie, mais pas à des concentrations élevées de sel. Généralement, c'est la quantité de sel dans le tampon qui est variée. En 2012, Müller et Franzreb ont décrit les effets de la température sur l'HIC en utilisant l'albumine sérique bovine (BSA) avec quatre types différents de résine hydrophobe. L'étude a modifié la température de manière à affecter l'affinité de liaison de la BSA sur la matrice. Il a été conclu qu'un cycle de température de 50 à 10 degrés ne serait pas adéquat pour éliminer efficacement tout le BSA de la matrice, mais pourrait être très efficace si la colonne n'était utilisée que quelques fois. [22] L'utilisation de la température pour effectuer le changement permet aux laboratoires de réduire les coûts d'achat de sel et d'économiser de l'argent.

Si des concentrations élevées de sel ainsi que des fluctuations de température doivent être évitées, vous pouvez utiliser un matériau plus hydrophobe pour rivaliser avec votre échantillon afin de l'éluer. [source] Cette méthode dite indépendante du sel de HIC a montré un isolement direct de l'immunoglobuline humaine G (IgG) à partir du sérum avec un rendement satisfaisant et a utilisé la bêta-cyclodextrine comme compétiteur pour déplacer les IgG de la matrice. [23] Cela ouvre largement la possibilité d'utiliser HIC avec des échantillons sensibles au sel, car nous savons que des concentrations élevées de sel précipitent les protéines.

Chromatographie hydrodynamique Modifier

La chromatographie hydrodynamique (HDC) est dérivée du phénomène observé selon lequel les grosses gouttelettes se déplacent plus rapidement que les petites. [24] Dans une colonne, cela se produit parce que le centre de masse des plus grosses gouttelettes ne peut pas être aussi proche des côtés de la colonne que les plus petites gouttelettes en raison de leur plus grande taille globale. [25] Les plus grosses gouttelettes élueront d'abord à partir du milieu de la colonne tandis que les plus petites gouttelettes adhéreront aux côtés de la colonne et s'élueront en dernier. Cette forme de chromatographie est utile pour séparer les analytes par masse molaire, taille, forme et structure lorsqu'elle est utilisée conjointement avec des détecteurs de diffusion de lumière, des viscosimètres et des réfractomètres. [26] Les deux principaux types de HDC sont les tubes ouverts et les colonnes garnies. Le tube ouvert offre des temps de séparation rapides pour les petites particules, tandis que la colonne à garnissage HDC peut augmenter la résolution et convient mieux aux particules d'une masse moléculaire moyenne supérieure à 10 5 > daltons. [27] La ​​HDC diffère des autres types de chromatographie car la séparation n'a lieu que dans le volume interstitiel, qui est le volume entourant et entre les particules dans une colonne garnie. [28]

La HDC partage le même ordre d'élution que la chromatographie d'exclusion de taille (SEC), mais les deux processus varient encore à bien des égards. [27] Dans une étude comparant les deux types de séparation, Isenberg, Brewer, Côté et Striegel utilisent les deux méthodes pour la caractérisation des polysaccharides et concluent que la HDC couplée à la diffusion de la lumière multiangle (MALS) permet d'obtenir une distribution de masse molaire plus précise par rapport à off- ligne MALS que SEC en beaucoup moins de temps. [29] Ceci est largement dû au fait que la SEC est une technique plus destructrice en raison des pores de la colonne dégradant l'analyte pendant la séparation, ce qui a tendance à avoir un impact sur la distribution de masse. [29] Cependant, le principal inconvénient de la HDC est la faible résolution des pics d'analyte, ce qui fait de la SEC une option plus viable lorsqu'elle est utilisée avec des produits chimiques qui ne sont pas facilement dégradables et où l'élution rapide n'est pas importante. [30]

Le HDC joue un rôle particulièrement important dans le domaine de la microfluidique. Le premier appareil réussi pour le système HDC-on-a-chip a été proposé par Chmela et al. en 2002. [31] Leur conception a permis de réaliser des séparations en utilisant un canal de 80 mm de long sur une échelle de temps de 3 minutes pour des particules de diamètres allant de 26 à 110 nm, mais les auteurs ont exprimé le besoin d'améliorer les paramètres de rétention et de dispersion. [31] Dans une publication de 2010 de Jellema, Markesteijn, Westerweel et Verpoorte, la mise en œuvre de la HDC avec un flux bidirectionnel en recirculation a entraîné une séparation haute résolution basée sur la taille avec seulement un canal de 3 mm de long. [32] Le fait d'avoir un canal aussi court et une résolution élevée était considéré comme particulièrement impressionnant étant donné que les études précédentes utilisaient des canaux de 80 mm de long. [31] Pour une application biologique, en 2007, Huh, et al. a proposé un dispositif de tri microfluidique basé sur la HDC et la gravité, utile pour empêcher les particules potentiellement dangereuses de diamètre supérieur à 6 microns de pénétrer dans la circulation sanguine lors de l'injection d'agents de contraste en échographie. [33] Cette étude a également fait des progrès en matière de durabilité environnementale en microfluidique en raison du manque d'électronique extérieure entraînant le flux, ce qui était un avantage de l'utilisation d'un dispositif basé sur la gravité.

Chromatographie bidimensionnelle Modifier

Dans certains cas, la sélectivité fournie par l'utilisation d'une colonne peut être insuffisante pour assurer la résolution des analytes dans des échantillons complexes. La chromatographie bidimensionnelle vise à augmenter la résolution de ces pics en utilisant une seconde colonne aux propriétés physico-chimiques (classification chimique) différentes. [34] [35] Le mécanisme de rétention sur ce nouveau support solide étant différent de la séparation en première dimension, il peut être possible de séparer par chromatographie bidimensionnelle des composés indiscernables par chromatographie unidimensionnelle. De plus, la séparation sur la deuxième dimension se produit plus rapidement que sur la première dimension. [34] Un exemple d'une séparation TLC bidimensionnelle est l'endroit où l'échantillon est repéré à un coin d'une plaque carrée, développé, séché à l'air, puis tourné de 90° et généralement redéveloppé dans un second système de solvant. La chromatographie bidimensionnelle peut être appliquée aux séparations GC ou LC. [34] [35] Cette méthode de séparation peut également être utilisée dans une approche coupante, [36] où des régions d'intérêt spécifiques sur la première dimension sont sélectionnées pour la séparation par la deuxième dimension, ou dans une approche globale, [34] [35] où tous les analytes de la première dimension subissent la séparation de la deuxième dimension.

Chromatographie en lit mobile simulé Modifier

La technique du lit mobile simulé (SMB) est une variante de la chromatographie liquide haute performance, elle est utilisée pour séparer des particules et/ou des composés chimiques qui seraient difficiles ou impossibles à résoudre autrement. Cette séparation accrue est provoquée par un agencement de vannes et de colonnes qui est utilisé pour allonger indéfiniment la phase stationnaire. Dans la technique du lit mobile de la chromatographie préparative, l'entrée de l'alimentation et la récupération de l'analyte sont simultanées et continues, mais en raison des difficultés pratiques avec un lit mobile en continu, la technique du lit mobile simulé a été proposée. Dans la technique du lit mobile simulé, au lieu de déplacer le lit, les positions d'entrée d'échantillon et de sortie d'analyte sont déplacées en continu, donnant l'impression d'un lit mobile. La véritable chromatographie en lit mobile (TMBC) n'est qu'un concept théorique. Sa simulation, SMBC, est obtenue grâce à l'utilisation d'une multiplicité de colonnes en série et d'un agencement de vannes complexe, qui permet l'alimentation en échantillon et en solvant, ainsi qu'un prélèvement d'analyte et de déchets aux emplacements appropriés de n'importe quelle colonne, ce qui permet une commutation à intervalles réguliers. the sample entry in one direction, the solvent entry in the opposite direction, whilst changing the analyte and waste takeoff positions appropriately as well.

Pyrolysis gas chromatography Edit

Pyrolysis–gas chromatography–mass spectrometry is a method of chemical analysis in which the sample is heated to decomposition to produce smaller molecules that are separated by gas chromatography and detected using mass spectrometry.

Pyrolysis is the thermal decomposition of materials in an inert atmosphere or a vacuum. The sample is put into direct contact with a platinum wire, or placed in a quartz sample tube, and rapidly heated to 600–1000 °C. Depending on the application even higher temperatures are used. Three different heating techniques are used in actual pyrolyzers: Isothermal furnace, inductive heating (Curie Point filament), and resistive heating using platinum filaments. Large molecules cleave at their weakest points and produce smaller, more volatile fragments. These fragments can be separated by gas chromatography. Pyrolysis GC chromatograms are typically complex because a wide range of different decomposition products is formed. The data can either be used as fingerprint to prove material identity or the GC/MS data is used to identify individual fragments to obtain structural information. To increase the volatility of polar fragments, various methylating reagents can be added to a sample before pyrolysis.

Besides the usage of dedicated pyrolyzers, pyrolysis GC of solid and liquid samples can be performed directly inside Programmable Temperature Vaporizer (PTV) injectors that provide quick heating (up to 30 °C/s) and high maximum temperatures of 600–650 °C. This is sufficient for some pyrolysis applications. The main advantage is that no dedicated instrument has to be purchased and pyrolysis can be performed as part of routine GC analysis. In this case quartz GC inlet liners have to be used. Quantitative data can be acquired, and good results of derivatization inside the PTV injector are published as well.

Fast protein liquid chromatography Edit

Fast protein liquid chromatography (FPLC), is a form of liquid chromatography that is often used to analyze or purify mixtures of proteins. As in other forms of chromatography, separation is possible because the different components of a mixture have different affinities for two materials, a moving fluid (the "mobile phase") and a porous solid (the stationary phase). In FPLC the mobile phase is an aqueous solution, or "buffer". The buffer flow rate is controlled by a positive-displacement pump and is normally kept constant, while the composition of the buffer can be varied by drawing fluids in different proportions from two or more external reservoirs. The stationary phase is a resin composed of beads, usually of cross-linked agarose, packed into a cylindrical glass or plastic column. FPLC resins are available in a wide range of bead sizes and surface ligands depending on the application.

Countercurrent chromatography Edit

Countercurrent chromatography (CCC) is a type of liquid-liquid chromatography, where both the stationary and mobile phases are liquids and the liquid stationary phase is held stagnant by a strong centrifugal force.

Hydrodynamic countercurrent chromatography (CCC) Edit

The operating principle of CCC instrument requires a column consisting of an open tube coiled around a bobbin. The bobbin is rotated in a double-axis gyratory motion (a cardioid), which causes a variable gravity (G) field to act on the column during each rotation. This motion causes the column to see one partitioning step per revolution and components of the sample separate in the column due to their partitioning coefficient between the two immiscible liquid phases used. There are many types of CCC available today. These include HSCCC (High Speed CCC) and HPCCC (High Performance CCC). HPCCC is the latest and best-performing version of the instrumentation available currently.

Hydrostatic countercurrent chromatography or centrifugal partition chromatography (CPC) Edit

In the CPC instrument, the column consists of a series of cells interconnected by ducts attached to a rotor. This rotor rotates on its central axis creating the centrifugal field necessary to hold the stationary phase in place. The separation process in CPC is governed solely by the partitioning of solutes between the stationary and mobile phases, which mechanism can be easily described using the partition coefficients (K) of solutes. CPC instruments are commercially available for laboratory, pilot, and industrial-scale separations with different sizes of columns ranging from some 10 milliliters to 10 liters volume.

Periodic counter-current chromatography Edit

In contrast to Counter current chromatography (see above), periodic counter-current chromatography (PCC) uses a solid stationary phase and only a liquid mobile phase. It thus is much more similar to conventional affinity chromatography than to counter current chromatography. PCC uses multiple columns, which during the loading phase are connected in line. This mode allows for overloading the first column in this series without losing product, which already breaks through the column before the resin is fully saturated. The breakthrough product is captured on the subsequent column(s). In a next step the columns are disconnected from one another. The first column is washed and eluted, while the other column(s) are still being loaded. Once the (initially) first column is re-equilibrated, it is re-introduced to the loading stream, but as last column. The process then continues in a cyclic fashion.

Chiral chromatography Edit

Chiral chromatography involves the separation of stereoisomers. In the case of enantiomers, these have no chemical or physical differences apart from being three-dimensional mirror images. Conventional chromatography or other separation processes are incapable of separating them. To enable chiral separations to take place, either the mobile phase or the stationary phase must themselves be made chiral, giving differing affinities between the analytes. Chiral chromatography HPLC columns (with a chiral stationary phase) in both normal and reversed phase are commercially available.


How to Read a Chapter of Biology

Cet article a été co-écrit par Bess Ruff, MA. Bess Ruff est doctorante en géographie à la Florida State University. Elle a obtenu sa maîtrise en sciences et gestion de l'environnement à l'Université de Californie à Santa Barbara en 2016. Elle a mené des travaux d'enquête pour des projets de planification spatiale marine dans les Caraïbes et a fourni un soutien à la recherche en tant que chercheur diplômé pour le Sustainable Fisheries Group.

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Biology is the study of life and the processes that govern it. While this can get quite complex, gaining a working knowledge of basic concepts will help you to understand the more complicated ideas. The first steps to gaining this understanding are reading the chapter, making notes, and finding ways to apply biology to your life.


Les plantes

La botanique est l'étude des plantes. Les étudiants en cours de biologie générale doivent généralement apprendre la forme et la fonction de base des plantes. Les pages à colorier sont une excellente ressource pour enseigner l'anatomie des plantes.

Coloration des fleurs – colore les parties d'une étamine, d'un pistil, d'un ovaire, de pétales
Coloration des feuilles – structures de couleur xylème, phloème, gaine de faisceau, épiderme..etc
Comparaison Monocot et Dicot - Coloriage avec termes et questions
Photosystem Coloring – montre PSI et PSII, et l'ETC, colorent les structures

Botanique Wordsearch – termes de plantes
Identification des arbres - Terminologie des feuilles (alternative vs simple), et une clé pour identifier les arbres du Midwest
Site Web Tree Rings – sur la dendrologie, avec des questions

Où les plantes obtiennent-elles leur nourriture – cultivent des plantes, pèsent le sol et réfutent que les plantes consomment de la terre
Le laboratoire Plant Hormones – étudie les effets de l'acide gibbérellique sur la croissance

La simulation de photosynthèse mesure les taux de production d'ATP tout en modifiant l'intensité lumineuse et les niveaux de CO2
Waterweed Simulator – contrôle les quantités de lumière et de CO2 et observe les taux de photosynthèse

Taux de photosynthèse – en utilisant du bicarbonate de soude, de l'élodée et de la lumière, mesurez les bulles pour observer à quelle vitesse une plante effectue la photosynthèse et libère de l'oxygène
Enquête : photosynthèse – ce laboratoire utilise des disques de feuilles qui flottent pour indiquer la photosynthèse. Les élèves étudient les facteurs qui affectent la photosynthèse. (Laboratoire AP)

Séparation des pigments végétaux – identifier les pigments végétaux par séparation et isolement des pigments à l'aide de la chromatographie sur papier en couche mince.

Étiquetage des photosystèmes – image montrant les photosystèmes I et II et la chaîne de transport d'électrons, les étudiants étiquettent les parties du système

Fluorescence de la chlorophylle – coupe une feuille d'épinard et ajoute de l'éthanol pour voir comment la chlorophylle devient rouge sous une lumière noire

L'enquête sur les stomates des feuilles compare les stomates de plantes conservées à la lumière et à l'obscurité

Les plantes consomment-elles ou libèrent-elles du CO2 en utilisant le rouge de phénol comme indicateur, les couleurs dans le tube à essai changeront à mesure que la plante libère de l'oxygène et consomme du dioxyde de carbone.

Help Wanted – descriptions des emplois de l'usine (petites annonces), les étudiants devinent la structure la mieux adaptée
Transpiration Lab – mesure les taux de perte d'eau dans les plantes conservées dans différentes conditions
Les inhibiteurs de germination mesurent les taux de germination des tomates
Expériences sur la germination des graines - les élèves étudient les facteurs qui affectent la germination


Chromatography - polar and non polar

If the stationary phase was polar and the moving phase was non- polar e.g. Hexane. Then non- polar compounds would pass through the column more quickly than polar compounds as they would have a greater solubility in the non-polar moving phase


and what it has to do with intermolecular forces?

Pas ce que vous cherchez ? Essayer&bonjour

(Message original de tmifan)
I don't really understand this.

If the stationary phase was polar and the moving phase was non- polar e.g. Hexane. Then non- polar compounds would pass through the column more quickly than polar compounds as they would have a greater solubility in the non-polar moving phase


and what it has to do with intermolecular forces?

Things dissolve because of intermolecular (interparticular) forces.

1. There are forces of attraction between solvent particles
2. There are forces of attraction between solute particles
3. There are forces of attraction between solvent and solute particles.

If force 3 is strong enough to overcome forces 1 & 2 then the solute dissolves. This is not an all or nothing situation and there is a range of solubilities from insoluble to very soluble.

Fundamentally the process must be energetically favourable overall (this also includes entropy, but let's keep it simple)

Polar substances can make better bonds with polar solutes and so can dissolve them.

Non-polar substances can make better bonds with non-polar solutes and so can dissolve them better.

All of these principles come into play with chromatography.

A non-polar solvent will be able to carry a non-polar solute through a polar stationary phase rapidly, but a non-polar solvent will not be able to carry a polar substance through a polar stationary phase very well at all.

Clearly, there will be a range of degrees of polarity for the mobile phase, stationary phase and solute, which can be employed to separate soluble components.


Résolution

In general, resolution is the ability to separate two signals. In terms of chromatography, this is the ability to separate two peaks. Resolution, R, is given by tr1 et tr2 et w1 et w2 are the times and widths, respectively, of the two immediately adjacent peaks. If the peaks are sufficiently close, which is the pertinent problem, w is nearly the same for both peaks and resolution may be expressed as

If the distance between the peaks is 4σ, then R is 1 and 2.5 percent of the area of the first peak overlaps 2.5 percent of the area of the second peak. A resolution of unity is minimal for quantitative analysis using peak areas.


FinchTV

FinchTV chromatogram viewer is a popular desktop application that was developed by Geospiza, Inc. for viewing trace data from Sanger DNA Sequencing (scf or ab1 file formats). We are making FinchTV freely available here as a service to the community. FinchTV does not collect location or usage data.

Download FinchTV 1.5 for MacOS X *If you have problems installing FinchTV on a Mac, we have some helpful hints below.

Helpful hints for installing FinchTV on MacOSX

1. Download FinchTV for MacOS X.
2. Go to your Downloads Folder.
3. Hold the control key down and right click the file name (FinchTV)
4. Choose Open (it’s the middle button).

Newer MacOSX operating systems (Catalina, etc) prevent you from installing apps that haven't come from the Apple store. Since FinchTV is an older program, you need to temporarily override the security system in order to open it.


Introduction to protein mass spectrometry

Proteomics is the study of all proteins in a biological system (e.g., cells, tissue, organism) during specific biological events. Genomics and proteomics are considerably more difficult to study together than genomics or even transcriptomics alone, because of the dynamic nature of protein expression. Additionally, the majority of proteins undergo some form of posttranslational modification (PTM), further increasing proteomic complexity. During the last 15 years, the broad scope of proteomics is only beginning to be realized due in large part to technological developments in mass spectrometry.

Mass spectrometry is a sensitive technique used to detect, identify and quantitate molecules based on their mass-to-charge (m/z) ratio. Originally developed almost 100 years ago to measure elemental atomic weights and the natural abundance of specific isotopes, MS was first used in the biological sciences to trace heavy isotopes through biological systems. In later years, MS was used to sequence oligonucleotides and peptides and analyze nucleotide structure.

The development of macromolecule ionization methods, including electrospray ionization (ESI) and atmospheric pressure chemical ionization (APCI), enabled the study of protein structure by MS. Ionization also allowed scientists to obtain protein mass "fingerprints" that could be matched to proteins and peptides in databases and help identity unknown targets. New isotopic tagging methods led to the quantitation of target proteins both in relative and absolute quantities. All these technological advancements have resulted in methods that successfully analyze samples in solid, liquid or gas states. The sensitivity of current mass spectrometers allows one to detect analytes at concentrations in the attomolar range (10 -18 ).


It expands a reader's attention span.

Another side effect of this incredible brain workout, reading not only improves memory, but in increases attention spans, too. Because of the sequential narrative style of most books — a beginning, middle, and end — reading encourages the brain to think similarly in sequence, and thus spend more time on building a story rather than rushing through each detail.

According to neuroscientist Susan Greenfield and her book Mind Change, the internet has improved users' capacity for short-term memory and ability to multi-task, but it can actually split our attention, unlike reading. When we read a novel, we read linearly, rather than sporadically jumping from tab to tab, and slowly think about the information in front of us. This exercise of taking time to process the narrative, to think about the complex layers of the story and how they fit together, actually increases the capacity for longer attention spans, especially in children.


Voir la vidéo: Say the magic code and get help from higher powers (Mai 2022).