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Qu'est-ce qui provoque la séparation de la copie complémentaire d'une molécule d'ARN ?

Qu'est-ce qui provoque la séparation de la copie complémentaire d'une molécule d'ARN ?


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J'ai récemment lu un article qui explique que, dans l'hypothèse du monde de l'ARN, une molécule d'ARN est « balayée » par un acide nucléique, catalysée par une autre molécule d'ARN spécifiquement pliée, pour s'organiser de manière complémentaire à la molécule d'origine. Cependant, qu'est-ce qui fait que la nouvelle molécule complémentaire se détache de la molécule d'origine ? J'entends toujours les gens dire que cet appariement de bases complémentaires permet à la molécule d'ARN de se reproduire, mais je n'ai jamais bien compris : comment ? Si des bases complémentaires ont tendance à se lier entre elles, la structure nouvellement formée ne devrait-elle pas alors être stable ? Quelles sont les causes de la reproduction réelle?


Tout d'abord, je tiens à souligner que l'hypothèse du monde de l'ARN n'est que cela - une hypothèse. Bien qu'il ait été démontré qu'il est possible pour certaines molécules d'ARN de se reproduire, ce n'est pas une fonction « normale » d'un ARN.

Edit - pour donner une réponse plus claire à la question elle-même :

Après réplication d'une molécule d'ARN, elle peut former une structure stable avec sa matrice ou elle peut se dissocier. En raison des diverses possibilités et de la complexité des structures d'ARN, il est presque impossible de prédire cela, car la séquence (exacte) elle-même et les conditions environnementales, en particulier la température, sont très importantes.

Plus d'informations sur la réponse non modifiée :

Que deux brins complémentaires ou l'ARN (ou l'ADN) se lient ensemble n'est pas une question à laquelle il est toujours facile de répondre. Pour un ADN d'une longueur donnée (dans un environnement/tampon donné), on peut plus ou moins prédire la température à laquelle les brins complémentaires se sépareront (souvent appelée température de fusion), car l'ADN forme des hélices relativement stables. L'ARN, cependant, forme souvent des structures tridimensionnelles compliquées, impliquant souvent des auto-complémentaires et n'est pas limité aux hélices typiques observées dans l'ADN. Essayer de prédire la structure 3D résultante des molécules d'ARN est toujours un domaine de recherche en cours. Certaines de ces structures sont assez stables (par exemple dans l'ARNt) mais dans d'autres cas, elles peuvent également être très dynamiques et changer rapidement. En fin de compte, cela dépend toujours de la séquence d'ARN, de la température et de nombreux autres facteurs environnementaux.


Introduction à la biologie de l'ARN : édition de bande dessinée

L'ADN contient les instructions sur la façon de tout construire dans notre corps. Chacune de vos cellules contient une copie de votre ADN, comme un ensemble de plans. Certaines parties de ces instructions sont exécutées selon les besoins dans différentes cellules.

En règle générale, les instructions des plans d'ADN sont suivies pour construire différentes protéines. Les protéines font une grande partie du travail nécessaire pour maintenir le fonctionnement du corps. À un moment donné, une cellule peut suivre les instructions pour fabriquer une protéine immunitaire pour défendre le corps contre les envahisseurs comme les virus, tandis qu'une autre fabrique une protéine qui aide l'estomac à digérer les aliments.

Jennifer Cook-Chrysos/Institut Whitehead

Généralement, l'ADN est conservé à l'intérieur du noyau, où se trouve une bibliothèque centrale de plans pour la cellule entière. Cependant, les protéines se construisent dans une partie différente de la cellule. Comment les instructions pour les protéines sont-elles transmises des plans d'ADN à l'endroit où les protéines sont réellement construites ? Ils sont portés sous forme d'ARN messager, ou ARNm. Chaque ARNm contient une copie d'un plan spécifique de la plus grande bibliothèque d'ADN. Il transporte ce modèle dans la cellule, où les protéines sont fabriquées. (Les ARNm ne sont pas le seul type d'ARN. Il existe de nombreux autres types qui font autre chose, et nous en reparlerons plus tard !)

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L'ARNm est créé dans un processus appelé transcription. Une enzyme appelée ARN polymérase se déplace le long du brin d'ADN, apportant des blocs de construction d'ARN complémentaires pour créer un « transcription » des informations contenues dans l'ADN. La molécule résultante est un brin d'ARN avec une mission : transmettre son message à la partie de la cellule qui crée les protéines.

Jennifer Cook-Chrysos/Institut Whitehead

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Une fois le transcrit créé, il doit subir quelques modifications pour être prêt pour la traduction (le processus par lequel le contenu de l'ARNm est lu par une machine moléculaire appelée ribosome et traduit en une séquence de blocs de construction protéiques appelés acides aminés.)

Jennifer Cook-Chrysos/Institut Whitehead

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Comment l'ARNm est-il régulé ?

Les cellules ont évolué de plusieurs manières pour réguler quelles protéines sont fabriquées et quand. Les ARNm se dégraderont naturellement avec le temps, la plupart ayant une durée de vie relativement courte : les molécules d'ARNm dans les cellules de mammifères peuvent rester de quelques minutes à quelques jours avant d'être dégradées. Une façon dont les cellules régulent la quantité d'une certaine protéine produite à un moment donné consiste à contrôler la durée pendant laquelle un ARNm reste intact. Tant qu'un ARNm est intact, il peut être traduit à plusieurs reprises pour produire plus de protéines.

Certains ARNm durent jusqu'à mille fois plus longtemps que d'autres. L'un des principaux régulateurs de la durée pendant laquelle les ARNm restent intacts est un autre type d'ARN, appelé miroARN (miARN).

Petit mais puissant

Les microARN sont l'un des nombreux types d'ARN qui ne codent pas pour les protéines. Ces minuscules ARN, qui ne font que 22 blocs de construction, ne sont pas traduits dans le ribosome comme les ARN messagers. Au lieu de cela, ils ciblent et se lient à des séquences dans des ARNm spécifiques et peuvent empêcher la traduction de l'ARNm.


Structure et mécanisme de la RNase Cas13a dépendante de l'ARN de Rhodobacter capsulatus

Les Cas13a sont des effecteurs à molécule unique de la famille des systèmes CRISPR-Cas de classe II et de type VI qui font partie des systèmes de défense bactérienne et archéenne. Ces endonucléases à ARN guidées par l'ARN et activées par l'ARN sont caractérisées par leur capacité à cliver les ARN cibles complémentaires de la séquence espaceur crRNA, ainsi que les ARN voisins d'une manière non spécifique à la séquence. En raison du clivage des transcrits cellulaires, ils induisent une dormance dans la cellule hôte et protègent ainsi la population bactérienne en interrompant le cycle infectieux des ARN-phages. Nous rapportons ici la caractérisation structurelle et fonctionnelle d'une enzyme Cas13a de la bactérie violette photo-auxotrophe Rhodobacter capsulatus. La structure cristalline aux rayons X du complexe RcCas13a-crRNA révèle son mode de reconnaissance distinct de crRNA ainsi que l'enzyme dans sa conformation contractée de pré-activation. En utilisant la mutagenèse dirigée en combinaison avec la spectrométrie de masse, nous avons identifié les résidus clés responsables du traitement pré-crRNA par RcCas13a dans son site catalytique distinct et élucidé le mécanisme de réaction de clivage à médiation acide-base. De plus, RcCas13a clive l'ARN cible ainsi que les ARN témoins dans Escherichia coli qui nécessite son activité catalytique de domaine HEPN (liaison des nucléotides des eucaryotes et des procaryotes supérieurs). Nos données fournissent des informations supplémentaires sur les mécanismes moléculaires et la fonction de cette famille intrigante d'endonucléases ARN dépendantes de l'ARN qui sont déjà utilisées comme outils efficaces pour la détection de l'ARN et la régulation de l'expression des gènes.


Passer devant le relecteur

Au début des années 2000, lorsque les experts pensaient que l'infection à coronavirus humain ne causait rien de pire que le rhume, Mark Denison a eu du mal à obtenir des subventions fédérales adéquates pour soutenir son laboratoire au centre médical de l'université Vanderbilt.

Virologue et clinicien, Denison étudiait les coronavirus depuis 1984, lorsque seuls deux des sept coronavirus actuellement connus pour provoquer des maladies chez l'homme étaient connus. Ces deux-là, ainsi que plusieurs autres coronavirus, provoquent des rhumes.

Denison a d'abord trouvé le virus qu'il a étudié, qui n'affecte que les souris, intéressant car il conduit à une version murine de la sclérose en plaques. En cours de route, il s'est intéressé à la façon dont le virus s'est répliqué, mais persuader les bailleurs de fonds de soutenir son travail était un véritable défi.

Au début de 2003, lui et sa femme, Laura, étaient en vacances en Floride et avaient une conversation difficile. &ldquoJe pense que le travail est important. Je pense que les modèles sont importants », se souvient-il avoir dit. &ldquo (Mais) je ne sais pas si je peux maintenir une carrière.&rdquo

C'est le jour où il a appris l'existence de l'agent pathogène à l'origine de la maladie respiratoire mortelle SRAS, qui avait fait la une des journaux.

&ldquoI&rsquom littéralement sur la plage avec ma femme, et quelqu'un est descendu de l'hôtel et m'a dit que j'avais un appel téléphonique,», a-t-il dit. L'appel provenait d'un collègue, partageant la nouvelle que l'agent pathogène responsable de la maladie avait été identifié, et qu'il s'agissait d'un coronavirus.

Le syndrome respiratoire aigu sévère s'est propagé du sud de la Chine à 26 pays en 2002 et 2003, tuant environ 10 % des quelque 8 000 personnes qu'il a infectées. Bien que l'épidémie ait été contenue, les coronavirus ont été soudainement reconnus comme un problème grave de proportion potentiellement pandémique.

Près de deux décennies plus tard, les travaux effectués dans le laboratoire Denison se sont avérés essentiels dans le développement d'une molécule, appelée remdesivir, qui est entrée dans des essais cliniques à grande échelle quelques semaines seulement après le SRAS-CoV-2., le coronavirus qui cause le COVID-19, a été identifié.

La molécule, semble-t-il, peut vaincre la superpuissance des coronavirus : leur capacité de relecture du génome. Cette capacité est présente dans d'autres virus à ARN et rend les coronavirus résistants à la majorité des médicaments utilisés contre d'autres virus à ARN.

Les chercheurs s'attendent à savoir dans les prochaines semaines si le remdesivir est un traitement efficace pour les patients atteints de COVID-19. En attendant, le laboratoire Denison a continué à travailler pour identifier d'autres molécules qui pourraient contourner la résistance virale.

« C'est une question vraiment clé pour nous : est-ce une nouvelle classe de médicaments qui peut nous permettre de mieux concevoir davantage de médicaments capables de contourner la fonction de relecture et d'inhiber le virus ? », a déclaré Denison, qui dirige maintenant la division des maladies infectieuses pédiatriques chez Vanderbilt .

Pas vos virus à ARN moyens

Comme de nombreux virus qui causent des maladies humaines, les coronavirus ont un génome composé d'ARN.

Lorsque le virus à l'origine du SRAS a été identifié, l'un des nombreux traitements expérimentaux que les cliniciens ont essayé d'utiliser était une molécule appelée ribavirine. À l'époque, la ribavirine était le médicament de première intention pour de nombreux virus à ARN.

La ribavirine cible une protéine virale appelée ARN polymérase dépendante de l'ARN, ou RdRp, qui est responsable de la réplication du génome du coronavirus.

Craig Cameron est virologue à l'Université de Caroline du Nord à Chapel Hill qui étudie les mécanismes moléculaires RdRp chez les picornavirus. &ldquo(RdRp) est une cible médicamenteuse très bien validée&rdquo, a déclaré Cameron. &ldquoEt c'est l'une de ces cibles qui ont réellement le potentiel d'avoir une activité antivirale panvirale.&rdquo

La ribavirine appartient à une classe de médicaments antiviraux appelés analogues nucléotidiques ou nucléosidiques.

Le fonctionnement exact de la ribavirine semble varier d'un virus à l'autre, ce qui en fait une bonne illustration des nombreux modes d'action possibles des analogues de nucléotides. Certains fonctionnent en bloquant la polymérase virale, mettant fin à un brin croissant d'ARN. Certains sont des mutagènes, qui se glissent dans le génome viral en croissance, laissant la polymérase se poursuivre, mais introduisent une certaine ambiguïté moléculaire au prochain cycle de réplication qui provoque une cascade d'erreurs dans les générations ultérieures. Certains bloquent les enzymes métaboliques, empêchant la synthèse ou le traitement de vrais ribonucléotides et ralentissant ainsi la réplication.

Une revue systématique des données de 30 essais cliniques, menée après l'épidémie de SRAS, n'a montré aucun avantage concluant de la ribavirine &mdash ou de tout autre traitement testé &mdash et des preuves que la ribavirine avait fait du mal aux patients.

La ribavirine a été le premier exemple. Depuis lors, la plupart des analogues de nucléotides essayés contre les coronavirus qui causent le SRAS et le syndrome respiratoire du Moyen-Orient, ou MERS, n'ont pas été des traitements efficaces. Se référant à la ribavirine et à l'analogue nucléosidique classique 5-fluorouracile, qui agit comme un mutagène, a déclaré Denison, « les coronavirus sont complètement, entièrement résistants à ces médicaments. Vous pouvez les tremper dedans, et ils n'ont aucun effet.&rdquo

Relecture virale rigoureuse

Bruno Canard est le chercheur principal d'un groupe de réplication virale au Centre national de la recherche scientifique. Avant l'épidémie de SRAS, Canard s'était concentré sur les relations structure-activité des analogues de nucléotides utilisés pour traiter le VIH et d'autres virus. Comme de nombreux virologues, il s'est inspiré du quasi-accident du SRAS pour lancer de nouveaux programmes de recherche.

"Nous avons été surpris que la ribavirine soit assez toxique et pas très efficace (contre) les coronavirus", a déclaré Canard.

L'équipe du CNRS à Marseille et le groupe Denison au Tennessee ont tous deux cherché à mieux comprendre le virus qui a causé le SRAS, et l'une de leurs principales questions était de savoir pourquoi la ribavirine, largement efficace contre d'autres virus à ARN, avait échoué contre celui-ci.

La réponse réside dans le grand génome de la famille des virus et dans la façon dont il a évolué pour se protéger.

« La raison pour laquelle les virus à ARN sont si efficaces est que leurs polymérases font des erreurs », a déclaré Denison. &ldquoIls n'ont pas la capacité de corriger les erreurs, ils génèrent donc des essaims de virus mutants prêts à s'adapter dans différents environnements.&rdquo

Les biologistes structurels décrivent les ARN polymérases dépendantes de l'ARN comme ressemblant à une main en coupe, les doigts et le pouce protégeant le site actif de l'enzyme. Au fur et à mesure que chaque nouvelle nucléobase du brin matrice pénètre dans le site actif, la polymérase coordonne un nouveau ribonucléotide entrant en le comparant à son homologue dans le brin existant. Si l'ajustement est correct, l'enzyme catalyse une formation de liaison dans le squelette de l'ARN. Si l'ajustement est suffisamment proche, de nombreuses ARN polymérases virales catalysent de toute façon une liaison. Un taux d'erreur pouvant atteindre une erreur pour 10 000 bases permet à ces essaims de mutants d'apparaître. Mais pour les coronavirus, le taux d'erreur de réplication est plus faible.

Les coronavirus ont certains des génomes les plus longs du monde viral à ARN. Alors que leurs plus proches cousins ​​ont des génomes de 10 kilobases en moyenne, les génomes des coronavirus sont trois fois plus longs. Avec autant de matériel génétique à copier, si les coronavirus muté au même rythme que les autres virus à ARN, ils accumuleraient tellement de mutations qu'ils produiraient à peine une descendance viable.

Au fur et à mesure que les chercheurs sur le terrain comprenaient mieux le coronavirus RdRp, ils ont découvert que la polymérase à elle seule ne pouvait pas expliquer la déconnexion. Le virologue François Ferron, chercheur au CNRS, travaille sur la réplication du coronavirus depuis l'épidémie de SRAS. "L'ARN polymérase virale est assez lâche, ce qui signifie qu'elle a tendance à faire beaucoup d'erreurs", a-t-il déclaré. &ldquoPeut-être un peu plus que l'ARN polymérase (cellulaire) ordinaire.&rdquo

Cela a conduit les chercheurs à soupçonner que les coronavirus pourraient avoir un moyen de reconnaître et de corriger les erreurs.

Une équipe internationale menant une étude du génome viral du SRAS a identifié un certain nombre d'enzymes potentielles de traitement de l'ARN sur la base de leur homologie avec d'autres enzymes connues. En 2006, le groupe Canard a travaillé avec des membres de cette équipe internationale de bio-informatique pour montrer qu'une de ces enzymes, comme ses homologues, pouvait cliver l'ARN double brin et était nécessaire pour une réplication virale réussie.

"Il y avait une spéculation selon laquelle (les coronavirus) pourraient coder une fonction de relecture qui leur permettrait de stabiliser un gros génome, et il y avait un endroit prévu dans le génome où cela pourrait se produire", a expliqué Denison. &ldquoCela nous a vraiment conduit à essayer les expériences génétiques.&rdquo

En 2007, son groupe a découvert que dans les virus dépourvus de la protéine codée au même endroit, une protéine appelée nsp14, les coronavirus d'un virus modèle murin accumulaient des mutations à un rythme similaire à celui des autres virus à ARN. Et les souches du virus sans nsp14, ont-ils découvert, étaient sensibles à la ribavirine.

Suite à ce travail, le groupe français s'est concentré sur le fonctionnement de nsp14 dans un tube à essai. "Nous n'avons pas travaillé sur le virus, comme Mark Denison le faisait magnifiquement", a déclaré Canard. &ldquoNous nous sommes concentrés sur cette enzyme &hellip et nous avons découvert qu'elle pouvait en fait exciser la ribavirine.&rdquo

L'équipe du CNRS a publié une étude enzymologique qui a confirmé que nsp14 peut identifier et éliminer les mésappariements entre les bases à la fin d'une copie croissante d'ARN viral en 2018, ils ont confirmé que lorsque la ribavirine est incorporée dans un brin d'ARN en croissance, la protéine nsp14 peut écoper le sortir du brin bloqué, laissant la réplication reprendre.

Alors que les chercheurs élaboraient l'enzymologie, une question pressante s'est posée : leurs découvertes signifiaient-elles que tous les analogues de nucléotides seraient inutiles contre les coronavirus ?

&ldquoCette question est actuellement essentielle dans le développement d'inhibiteurs d'analogues nucléosidiques&rdquo, a déclaré Canard.

Anatomie d'une molécule : qu'est-ce qui rend le remdesivir unique ?

Éviter la relecture virale

C'est là qu'intervient le remdesivir.

&ldquoDe mon point de vue, l'histoire (du remdesivir) a commencé en 2013&rdquo, a déclaré Denison. &ldquoNous avions découvert que les coronavirus codent le seul système de relecture d'ARN connu &hellip (et) je voulais tester s'il y avait des nucléosides qui pourraient être actifs dans le cadre de la relecture des coronavirus.&rdquo

Denison a entendu Cameron parler d'une collaboration de recherche avec Gilead Sciences. Cameron travaillait à comprendre le mécanisme d'action précis d'un groupe d'analogues de nucléotides que la société utilisait pour traiter l'hépatite C, un virus à ARN qui infectait des dizaines de milliers de personnes chaque année.

Avant la course au médicament contre l'hépatite C, selon Adrian Ray, un chimiste médical qui travaillait à Gilead, &ldquoL'espace nuc pour les ARN polymérases et pour les virus à ARN n'était vraiment pas très exploré.&rdquo

En essayant de battre ses concurrents sur le marché lucratif de l'hépatite C, Gilead avait développé une vaste bibliothèque d'inhibiteurs de l'ARN polymérase ARN-dépendante, y compris la molécule qui deviendrait connue sous le nom de remdesivir. Un composé étroitement lié au remdesivir avait atteint les premiers tests cliniques pour l'hépatite C, mais avait échoué, en partie parce que, comme le remdesivir, il devait être administré par injection. Gilead a changé de stratégie en achetant une start-up biotechnologique pour accéder à l'analogue nucléotidique disponible par voie orale, qui est devenu un élément clé du cocktail de Gilead contre l'hépatite C.

En travaillant avec l'ARN polymérase dépendante de l'ARN du poliovirus, Cameron avait commencé des travaux qui montreraient que la molécule était un terminateur de chaîne non obligatoire, un type d'analogue nucléotidique que la polymérase devrait être capable d'incorporer dans un brin en croissance et de continuer &mdash mais impossible.

Intrigué, Denison a contacté Gilead pour demander la permission d'essayer ce médicament approuvé, appelé sofosbuvir, contre les coronavirus de souris.

"C'était leur médicament qui a changé le monde qui a guéri l'hépatite C", a déclaré Denison. "Ils n'allaient pas laisser un virologue peu connu travaillant sur un coronavirus utiliser leurs médicaments". Mais après une série d'introductions par Cameron et plusieurs discussions, Gilead a accepté de laisser son laboratoire travailler avec une autre série de molécules, celles qui avaient été développé en interne et mis de côté pour l'hépatite C. Ils avaient montré des résultats prometteurs dans les premières études en tant que traitement candidat pour d'autres infections virales, y compris contre le virus Ebola.

Les molécules candidates sont arrivées. Denison et ses stagiaires n'avaient aucune idée de ce qu'ils étaient. Mais ils sont allés de l'avant et les ont testés. Ce qu'ils ont trouvé était passionnant : dans la culture de cellules de souris, les médicaments pourraient bloquer la réplication du coronavirus.

&ldquoNous avons donc demandé à nos collaborateurs de Gilead, &lsquoQu'est-ce que ce (composé) ?&rsquo Ils ont dit, &lsquo&rsquoNous n'allons pas vous le dire, mais nous allons vous envoyer 60 promédicaments, des modifications chimiques du même composé&rdquo, a déclaré Denison.

L'un de ce deuxième lot de molécules s'est avéré être le remdesivir. L'étudiante diplômée Maria Agostini, qui avait récemment rejoint le laboratoire Denison&rsquos, faisait partie des chercheurs qui ont travaillé à la compréhension de sa forte activité.

"Nous avons travaillé avec quelques composés puissants, mais le remdesivir était vraiment l'un des premiers avec lesquels j'avais travaillé", a déclaré Agostini. &ldquoLorsque vous regardiez les cellules, vous pouviez voir moins de preuves de réplication virale en cours.&rdquo

Alors que les cellules de ses boîtes de contrôle étaient visiblement infectées, souffrant de mauvais effets cytopathiques, les cellules traitées avec du remdesivir après infection ont bien survécu. En cultivant de nombreuses générations du virus dans des cellules traitées avec des concentrations sous-thérapeutiques de remdesivir, en sélectionnant des mutations qui permettraient au virus d'échapper au médicament, Agostini et ses collègues Erica Andres et Clint Smith ont démontré qu'il faudrait des mutations dans la polymérase virale pour conférer une résistance à remdesivir &mdash et que ces virus mutants étaient moins capables d'infecter les hôtes que le type sauvage.

Gilead a fourni le médicament gratuitement et les National Institutes of Health ont financé les chercheurs dans le cadre d'un programme visant à développer des traitements pour les maladies infectieuses émergentes.< /p>

&ldquoCela souligne la valeur de la science collaborative,&rdquo Denison a déclaré. &ldquoC'était une entreprise qui s'est engagée à nous aider à le faire lorsque personne ne s'intéressait aux coronavirus, et un mécanisme de subvention qui permet une certaine flexibilité en termes d'expansion.&rdquo

Récemment, le laboratoire d'enzymologie de Mathias Götte au Canada a examiné comment le remdesivir agit sur les enzymes polymérases du coronavirus qui cause le MERS. Les chercheurs du groupe Götte&rsquos ont déterminé que le composé arrête la polymérase, agissant comme un terminateur de chaîne &mdash mais pas immédiatement.

Andrea Pruijssers, un virologue qui dirige le programme de recherche sur les antiviraux au sein du groupe Denison, a déclaré : &ldquo (Remdesivir) échappe en quelque sorte à la reconnaissance par l'enzyme de relecture.&rdquo

Au lieu d'arrêter la polymérase dès qu'elle est incorporée, le remdesivir semble laisser l'enzyme continuer pendant quelques cycles supplémentaires mais la fait ensuite caler. Les chercheurs soupçonnent que le trébuchement moléculaire peut être causé par une structure inhabituelle dans le duplex d'ARN matrice-copie.

"Ils pensent qu'à ce stade, l'analogue nucléosidique qui a déjà été incorporé est protégé de l'enzyme de relecture", a déclaré Pruijssers.

Dans le laboratoire de Ralph Baric, collaborateur de longue date de Denison à l'Université de Caroline du Nord, Chapel Hill, les chercheurs ont découvert que le remdesivir était un traitement efficace pour les souris infectées par le SRAS. Ces résultats étaient suffisamment prometteurs pour faire avancer le remdesivir dans une étude du MERS chez les singes, publiée en février par des chercheurs du Rocky Mountain Laboratory du NIH. Le médicament a montré un certain avantage dans la réduction de la gravité de la maladie, à condition que les singes soient traités à titre prophylactique.

En termes de développement de médicaments, le remdesivir "a en quelque sorte franchi toutes les étapes importantes, de notre point de vue", a déclaré Denison.

Classe de médicament similaire, résultat différent

Lorsque Pruijssers a commencé dans le laboratoire Denison en 2017, ils avaient une autre molécule à étudier, la bêta-D-N4-hydroxycytidine, ou NHC en abrégé, qui était testée à l'Emory Institute for Drug Development en tant que médicament antiviral à large spectre potentiel.

Agostini a également dirigé la première étude de ce médicament, montrant son activité en culture tissulaire. En mars, des chercheurs des laboratoires Baric et Denison ont publié un suivi dans Science Translational Medicine, montrant que le NHC peut bloquer la réplication dans les virus qui causent le MERS et le SRAS et aussi le coronavirus qui cause COVID-19.

&ldquoC&rsquos intéressant,&rdquo Pruijssers. &ldquo(NHC) n&rsquot agit comme un terminateur de chaîne. Il s'intègre dans le génome et provoque ensuite une mutagenèse mortelle.&rdquo

Grâce à sa capacité à s'apparier avec plus d'un nucléotide dans le brin complémentaire, NHC introduit une cascade d'erreurs dans les cycles successifs de réplication. Finalement, la descendance virale n'a pas les informations dont elle a besoin pour créer un nouveau virus.

Alors que le remdesivir arrête la polymérase dans son élan, provoquant peu de nouvelles mutations, des expériences de séquençage en profondeur dans les quelques virus qui ont émergé après le traitement au NHC ont montré que le médicament provoque de nombreuses mutations.

"Nous avons identifié deux composés qui appartiennent structurellement à la même classe d'analogues nucléosidiques mais agissent très différemment sur les coronavirus", a déclaré Agostini.

Ils ont été particulièrement encouragés car les travaux ont montré que le NHC a une certaine efficacité thérapeutique dans le modèle murin de MERS & mdash et qu'il peut même bloquer les souches de coronavirus résistantes au remdesivir.

Dans une interview début mars, Pruijssers a déclaré que le NHC était encore relativement peu testé en tant que thérapeutique. "Il est difficile de développer un mutagène, car la FDA n'aime généralement pas l'idée de mutation à moins qu'il ne s'agisse d'une maladie potentiellement mortelle".

Mais la pandémie a changé les choses. Emory s'est associé à la société de biotechnologie de Miami Ridgeback Biotherapeutics pour développer la molécule, et Emory a déposé une demande auprès de la Food and Drug Administration des États-Unis pour obtenir l'autorisation de commencer les premiers essais sur l'homme pour tester la sécurité de la molécule.

Denison a décrit le rôle central joué par Agostini : &ldquoEn cinq années d'études supérieures, Maria a testé et développé l'analyse in vitro détaillée sur deux médicaments potentiels pour traiter ce coronavirus pandémique &mdash et les a menés jusqu'au bout de ce développement préclinique in vitro.&rdquo

C'est un exploit remarquable et très inhabituel. Le développement de médicaments est connu pour son taux d'échec élevé. Bien sûr, de nombreux candidats-médicaments qui semblent prometteurs dans les études précliniques vacillent dans les grands essais humains.

Face à la pandémie

Après avoir soutenu pendant une décennie que le monde doit être prêt pour une pandémie, Denison a déclaré début mars qu'il était étrange d'y faire face.

&ldquoC&rsquos vraiment bizarre que nous ayons travaillé là-dessus au cours des six dernières années, et les médicaments étaient seulement passer, et ils étaient juste prêts à partir », a-t-il déclaré. &ldquoNous&rsquo verrons quel est le résultat.&rdquo

Il a quelques inquiétudes quant à la façon d'interpréter les données des essais cliniques testant l'efficacité du remdesivir pour COVID-19 chez l'homme, dont les premiers devraient être publiés ce mois-ci alors qu'un essai au China&ndashJapan Friendship Hospital de Wuhan se termine. (D'autres essais, parrainés par Gilead, le NIH et l'Organisation mondiale de la santé, lancés plus tard.)

Premièrement, les données animales d'autres coronavirus suggèrent que le médicament est plus efficace lorsqu'il est administré à titre prophylactique, après l'exposition des animaux mais avant qu'ils ne commencent à développer des symptômes. Dans le contexte d'une pandémie mondiale, cela serait difficile à réaliser chez l'homme. À un moment donné au cours de l'infection, une réponse immunitaire extrêmement forte commence à faire plus de mal que le virus à ce stade, a déclaré Denison, il est peut-être trop tard pour qu'un antiviral aide.

Deuxièmement, les données des premiers essais sont susceptibles d'être nuancées et nécessitent une interprétation prudente, ce à quoi Denison craint que le discours public ne soit pas bien préparé. Les premiers essais humains du composé sœur du remdesivir chez les patients atteints d'hépatite ont montré des différences dramatiques entre les individus dans la réponse antivirale, et le remdesivir lui-même a montré un avantage limité par rapport à d'autres thérapies candidates dans un essai clinique chez les patients Ebola. « Les gens ont tendance à avoir une mentalité de gagnant ou de perdant », a-t-il déclaré. &ldquoIls&rsquo ont appelé remdesivir &lsquoqu'un médicament contre Ebola a échoué&rsquo,&rsquo n'est-ce pas ? Il n'a pas échoué dans l'essai Ebola, il était simplement avancé car il n'a pas montré autant d'avantages que les deux autres composés.

Quel que soit le résultat des essais cliniques sur le remdesivir et le NHC, Denison a déclaré qu'il espère que cette crise soulignera l'importance de financer la recherche sur les virus potentiellement pandémiques avant le début des épidémies.

&ldquoEssayer de maintenir les investigations de base et le développement de médicaments contre quelque chose qui&rsquo a un impact élevé, élevé, élevé mais une probabilité faible, faible, faible est vraiment difficile dans notre monde. Vraiment dur », a-t-il dit. &ldquoNous n'avons jamais abandonné cette idée que nous devions avoir ces choses prêtes et les avoir dans le seau.&rdquo


L'ondulation de la transcriptase inverse

En 1970, deux laboratoires ont démontré biochimiquement que l'ARN pouvait être utilisé comme matrice pour l'ADN. Howard Temin avait soutenu que l'ARN de certains virus devait être copié dans l'ADN de certains types de cellules afin d'expliquer la « transformation » de cellules normales en cellules cancéreuses par ces virus. La détection de l'enzyme responsable de cette synthèse d'ADN dépendante de l'ARN était une preuve importante qui a convaincu de nombreux anciens sceptiques que sa théorie était valide. Pour beaucoup, les nouveaux résultats semblaient cohérents avec les prédictions du dogme central, mais pour d'autres, ces découvertes étaient considérées comme un défi. Un auteur est allé jusqu'à suggérer que l'existence d'une « transcription inversée » (copie de l'ARN pour fabriquer de l'ADN) signifiait que l'ensemble du dogme central devait être réexaminé. Rétrospectivement, il semble un peu étrange que cet écrivain (anonyme) n'ait pas pris la peine de relire la formulation originale avant d'appeler à son élimination ! Crick a répondu au défi et, quelques semaines plus tard, a publié une vue élargie du dogme central. Il a réitéré que le transfert d'informations d'ARN à ARN, d'ARN à ADN, ou peut-être même d'ADN à protéine (directement, sans intermédiaire d'ARN) étaient tous des « transferts spéciaux » qui pouvaient se produire dans certains types de cellules. En tant que tels, ils étaient parfaitement cohérents à la fois avec l'hypothèse de séquence et avec le flux d'informations entre les acides nucléiques ou des acides nucléiques aux protéines. Ainsi, les « transcriptases inverses » nouvellement découvertes, comme sont désormais appelées les ADN polymérases dépendantes de l'ARN, n'ont pas perturbé le dogme central, malgré le « ondulation » initiale. Cependant, Crick a également souligné trois « transferts inconnus », de la protéine à la protéine, à l'ARN ou à l'ADN. De tels transferts, s'ils existent, nécessiteraient une reformulation radicale des principes moléculaires. Si les produits des gènes (protéines) pouvaient altérer les gènes (séquences d'ADN), la voie serait ouverte à l'hérédité des caractéristiques acquises. En 1970, Crick a estimé que les preuves disponibles étaient encore insuffisantes pour conclure que le dogme central était certain d'être correct, bien qu'il ait maintenu qu'il était susceptible de rester utile. Plus récemment, il a été découvert que dans certaines circonstances, les séquences d'ADN d'un organisme étaient altérées de ce qui semblait être une manière dirigée en réponse à des stimuli environnementaux. En plus d'élargir notre compréhension de l'origine des mutations, les expériences ont soulevé la possibilité que des protéines « avantageuses » puissent provoquer des mutations « avantageuses ». Ainsi, l'analyse de l'origine des mutations « adaptatives » est cruciale pour évaluer la validité du dogme central, car celles-ci ont soulevé la possibilité que l'information puisse passer des protéines aux acides nucléiques. Voir aussi Réplication rétrovirale, Baltimore, David, et Temin, Howard Martin


'Monde de l'ARN'

La polyvalence de l'ARN dans sa fonction et sa forme a contribué à inspirer l'idée connue sous le nom de "RNA world" hypothesis.

Organisms rely on an astoundingly complicated system of DNA, RNA and protein to transmit hereditary information, and scientists have long wondered how this system could have arisen in early life-forms. RNA offers a logical answer, He said: This molecule can both store genetic information and catalyze reactions, suggesting that early, simple organisms could have relied solely on RNA.

"It's a hybrid," He said. "So it makes perfect sense as a start."

Additionally, He said, RNA's sugar base, ribose, always appears first in organisms, as it's easier to make. Deoxyribose then gets created from ribose. "So that implies in life, you have the ribose, the RNA first, and then the DNA comes later," He said.

From that simpler RNA start, more-complex life could arise, evolving the stabler DNA to serve as a long-term library and developing protein as a more efficient catalyst.


Functions of RNA Polymerase

Traditionally, the central dogma of molecular biology has looked at RNA as a messenger molecule, that exports the information coded into DNA out of the nucleus in order to drive the synthesis of proteins in the cytoplasm: DNA → RNA → Protein. The other well known RNAs are transfer RNA (tRNA) and ribosomal RNA (rRNA) which are also intimately connected with the protein synthetic machinery. However, over the past two decades, it has become increasingly clear that RNA serves a range of functions, of which protein coding is only one part. Some regulate gene expression, others act as enzymes, some are even crucial in the formation of gametes. These are called non-coding or ncRNA.

Since RNAP is involved in the production of molecules that have such a wide range of roles, one of its main functions is to regulate the number and kind of RNA transcripts formed in response to the cell’s requirements. A number of different proteins, transcription factors and signaling molecules interact with the enzyme, especially the carboxy-terminal end of one subunit, to regulate its activity. It is believed that this regulation was crucial for the development of eukaryotic plants and animals, where genetically identical cells show differential gene expression and specialization in multicellular organisms.

In addition, the optimal functioning of these RNA molecules depends on the fidelity of transcription – the sequence in the DNA template strand must be represented accurately in the RNA. Even a single base change in some regions can lead to a completely non-functional product. Therefore, while the enzyme needs to work quickly and complete the polymerization reaction in a short span of time, it needs robust mechanisms to ensure extremely low error rates. The nucleotide substrate is screened at multiple steps for complementarity to the template DNA strand. When the correct nucleotide is present, it creates an environment conducive to catalysis and the elongation of the RNA strand. Additionally, a proofreading step allows incorrect bases to be excised.

There is remarkable similarity in the RNA polymerases found in prokaryotes, eukaryotes, archea and even some viruses. This points to the possibility that they evolved from a common ancestor. Prokaryotic RNAP is made of four subunits, including a sigma-factor that dissociates from the enzyme complex after transcription initiation. While prokaryotes use the same RNAP to catalyze the polymerization of coding as well as non-coding RNA, eukaryotes have five distinct RNA polymerases.

Eukaryotic RNAP I is a workhorse, producing nearly fifty percent of the RNA transcribed in the cell. It exclusively polymerizes ribosomal RNA, which forms a large component of ribosomes, the molecular machines that synthesize proteins. RNA Polymerase II is extensively studied because it is involved in the transcription of mRNA precursors. It also catalyzes the formation of small nuclear RNAs and micro RNAs. RNAP III transcribes transfer RNA, some ribosomal RNA and a few other small RNAs and is important since many of its targets are necessary for normal functioning of the cell. RNA polymerases IV and V are found exclusively in plants, and together are crucial for the formation of small interfering RNA and heterochromatin in the nucleus.


Basics of DNA Replication

Figure 4. The three suggested models of DNA replication. Grey indicates the original DNA strands, and blue indicates newly synthesized DNA.

The elucidation of the structure of the double helix provided a hint as to how DNA divides and makes copies of itself. This model suggests that the two strands of the double helix separate during replication, and each strand serves as a template from which the new complementary strand is copied. What was not clear was how the replication took place. There were three models suggested: conservative, semi-conservative, and dispersive (see Figure 4).

In conservative replication, the parental DNA remains together, and the newly formed daughter strands are together. The semi-conservative method suggests that each of the two parental DNA strands act as a template for new DNA to be synthesized after replication, each double-stranded DNA includes one parental or “old” strand and one “new” strand. In the dispersive model, both copies of DNA have double-stranded segments of parental DNA and newly synthesized DNA interspersed.

Meselson and Stahl were interested in understanding how DNA replicates. They grew E. coli for several generations in a medium containing a “heavy” isotope of nitrogen ( 15 N) that gets incorporated into nitrogenous bases, and eventually into the DNA (Figure 5).

Figure 5. Meselson and Stahl experimented with E. coli grown first in heavy nitrogen ( 15 N) then in 14 N. DNA grown in 15 N (red band) is heavier than DNA grown in 14 N (orange band), and sediments to a lower level in cesium chloride solution in an ultracentrifuge. When DNA grown in 15 N is switched to media containing 14 N, after one round of cell division the DNA sediments halfway between the 15 N and 14 N levels, indicating that it now contains fifty percent 14 N. In subsequent cell divisions, an increasing amount of DNA contains 14 N only. This data supports the semi-conservative replication model. (crédit : modification d'œuvre par Mariana Ruiz Villareal)

Les E. coli culture was then shifted into medium containing 14 N and allowed to grow for one generation. The cells were harvested and the DNA was isolated. The DNA was centrifuged at high speeds in an ultracentrifuge. Some cells were allowed to grow for one more life cycle in 14 N and spun again. During the density gradient centrifugation, the DNA is loaded into a gradient (typically a salt such as cesium chloride or sucrose) and spun at high speeds of 50,000 to 60,000 rpm. Under these circumstances, the DNA will form a band according to its density in the gradient. DNA grown in 15 N will band at a higher density position than that grown in 14 N. Meselson and Stahl noted that after one generation of growth in 14 N after they had been shifted from 15 N, the single band observed was intermediate in position in between DNA of cells grown exclusively in 15 N and 14 N. This suggested either a semi-conservative or dispersive mode of replication. The DNA harvested from cells grown for two generations in 14 N formed two bands: one DNA band was at the intermediate position between 15 N and 14 N, and the other corresponded to the band of 14 N DNA. These results could only be explained if DNA replicates in a semi-conservative manner. Therefore, the other two modes were ruled out.

During DNA replication, each of the two strands that make up the double helix serves as a template from which new strands are copied. The new strand will be complementary to the parental or “old” strand. When two daughter DNA copies are formed, they have the same sequence and are divided equally into the two daughter cells.


Connexions artistiques

Figure Errors in splicing are implicated in cancers and other human diseases. What kinds of mutations might lead to splicing errors? Think of different possible outcomes if splicing errors occur.

Figure Mutations in the spliceosome recognition sequence at each end of the intron, or in the proteins and RNAs that make up the spliceosome, may impair splicing. Mutations may also add new spliceosome recognition sites. Splicing errors could lead to introns being retained in spliced RNA, exons being excised, or changes in the location of the splice site.


Voir la vidéo: Protein Synthesis Updated (Juin 2022).


Commentaires:

  1. Grozragore

    Vous avez correctement dit :)

  2. George

    Fuuuuu ...

  3. Francois

    Je vous demande pardon, je ne peux pas vous aider, mais je suis sûr qu'ils vous aideront certainement. Ne désespérez pas.

  4. Digal

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  5. Ttoby

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