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Le GTP-γS (GTP gamma S) se lie-t-il à toutes les protéines liant le GTP ?

Le GTP-γS (GTP gamma S) se lie-t-il à toutes les protéines liant le GTP ?



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Je viens de lire un article Rab10 GTPase régule la dynamique et la morphologie du RE - Nature Cell Biology 15, 169-178 (2013) doi: 10.1038/ncb2647. Dans cet article, pour identifier les protéines Rab dans le RE, ils ont d'abord isolé les vésicules du RE. Puis les laver pour éliminer les protéines cytosoliques. Après lavage, ces vésicules ont été solubilisées par un détergent. Ensuite, il a été chargé sur une colonne GTP-agarose (pour lier les protéines de liaison au GTP à la colonne). Dans la dernière étape, les protéines de liaison au GTP ont été éluées avec du GTP et analysées par SDS-PAGE.

Comme contrôle (avant le chargement sur la colonne), ils ont utilisé le GTP gamma S, car il empêche les protéines de liaison au GTP de se lier à la colonne. Quand j'ai regardé leur silhouette; sur la piste de contrôle, il y a plein de groupes ! Donc je suis confus :(Si cela empêche les protéines de liaison au GTP de se lier à la colonne, après élution de la colonne d'agarose GTP, pourquoi y a-t-il des bandes ? Et que peuvent être ces bandes ?)


C'est sur ce chiffre que porte la question. A droite se trouve l'expérience de contrôle avec GTP-γS, à gauche sans :

Les bandes qui sont visibles dans les deux expériences sont des liaisons non spécifiques. Si GTP-γS n'affecte pas leur présence, le mécanisme par lequel ils se lient à la colonne ne peut pas être spécifique à la fonctionnalité GTPase.

Les protéines recherchées par les auteurs sont celles qui sont présentes dans l'expérience sans GTP-γS, mais ne sont pas éluées dans l'expérience avec GTP-γS. Ceux-ci se lient via une fonctionnalité GTPase au GTP sur la colonne. Ils sont marqués par des pointes de flèches sur la figure.

L'idée générale derrière cette expérience de contrôle est de distinguer la liaison spécifique de la liaison non spécifique à la colonne. Être capable de faire cela signifie que les auteurs avaient moins de protéines dont ils avaient besoin pour approfondir leurs recherches, ce qui leur a épargné du travail.


La génétique chimique révèle un rôle RGS/G-Proteine ​​dans l'action d'un composé

Nous rapportons ici sur un écran génétique chimique conçu pour aborder le mécanisme d'action d'une petite molécule. De petites molécules actives dans des modèles d'incontinence urinaire ont été testées sur le nématode Caenorhabditis elegans, et les phénotypes résultants ont été utilisés comme lectures dans un criblage génétique pour identifier des cibles moléculaires possibles. Les mutations conférant une résistance au composé se sont avérées affecter les membres du complexe protéine RGS/protéine G. Des études dans des systèmes de mammifères ont confirmé que les petites molécules inhibent la signalisation des récepteurs muscariniques couplés aux protéines G (RCPG) impliquant G-αq (sous-unité alpha de la protéine G). Nos études suggèrent que les petites molécules agissent au niveau du complexe de signalisation RGS/G-αq et définissent de nouvelles mutations à la fois dans RGS et G-αq, y compris un allèle d'hypo-adaptation unique de G-αq. Ces résultats suggèrent que les thérapies ciblées sur les composants en aval de la signalisation GPCR peuvent être efficaces pour le traitement de maladies impliquant une activation inappropriée des récepteurs.


Résultats

Formation de vésicules COP à partir de cellules semi-intactes

Dans ce rapport, nous nous concentrons sur le rôle de l'hydrolyse du GTP dans la libération de vésicules recouvertes de COPII et de COPI en utilisant un test décrit précédemment pour générer des vésicules recouvertes de COPII 28 . Les avantages de cette procédure sont (i) que les endomembranes natives peuvent être utilisées pour reconstituer les vésicules COPI et COPII en fonction des protéines d'enveloppe définies étudiées et (ii) aucune étape de trituration mécanique n'est utilisée qui pourrait cisailler les bourgeons mécaniquement et ainsi libérer les vésicules. Pour la génération de vésicules COPII, des cellules HeLa semi-intactes ont été incubées avec un hamster recombinant purifié Sar1a wt, un hétérodimère humain Sec23A/24A, un hétérotétramère humain Sec13/31A et du GTP. Les vésicules COPII ont été séparées des cellules semi-intactes par centrifugation différentielle. Les culots ont été analysés par Western blot pour la présence des marqueurs membranaires vésiculaires Sec22b et ERGIC53 et, en tant que contrôle négatif, pour la présence d'un marqueur non-cargo résident du RE, la calnexine. Des vésicules recouvertes de COPI ont été générées de la même manière en incubant des cellules semi-intactes avec de l'Arf1 humain recombinant purifié, l'isoforme de coatomer de souris 1ζ1 (CMγ1ζ1) et GTP. Des vésicules COPI ont été collectées puis analysées par Western blot pour la présence des marqueurs membranaires vésiculaires p24 et ERGIC53, et, en tant que contrôle négatif, pour le marqueur de Golgi GM130, qui est censé être exclu des vésicules COPI 49 . En accord avec un rapport précédent, les protéines cytosoliques de mammifère Sar1, Sec23A/24A et Sec13/31A étaient nécessaires et suffisantes pour générer des vésicules recouvertes de COPII à partir de cellules semi-intactes 28, à en juger par la présence dépendante du GTP des marqueurs membranaires des vésicules. Sec22b et ERGIC53 (Figure 1A). De même, les vésicules COPI ont été formées d'une manière dépendante de la GTPase, du manteau et de la guanine nucléoside triphosphate (figure 1B) (pour des contrôles supplémentaires, voir la figure S1).

Formation de vésicules COP avec des analogues de GTP peu hydrolysables

Pour revoir une exigence d'hydrolyse du GTP dans le processus de scission des vésicules COPII et COPI, nous avons utilisé le test décrit ci-dessus et remplacé le GTP par les analogues du GTP peu hydrolysables GTPγS ou GMP-PNP. Dans ces tests, les vésicules COPII ont été générées efficacement en présence de l'un ou l'autre des dérivés de guanine nucléoside triphosphate, à en juger par la libération dépendante des nucléotides des marqueurs membranaires des vésicules Sec22b et ERGIC53 dans la fraction vésiculaire. La calnexine, marqueur membranaire du RE non cargo, n'a pas été libérée, comme prévu.

Contrairement à une publication précédente 36, 47, nous n'avons pu observer aucune différence significative dans la libération des marqueurs de membrane vésiculaire COPII, peu importe si le GTP ou ses analogues peu hydrolysables ont été utilisés à la place (Figure 2A, comparer la piste 2 avec les pistes 3 et 4 ). De même, la formation de vésicules COPI a été étudiée en présence de GTP, GTPγS ou GMP-PNP. L'analyse des marqueurs de membrane vésiculaire p24 et ERGIC53 a indiqué une formation et une libération efficaces de vésicules COPI, quels que soient les analogues de GTP utilisés (figure 2B, comparer la piste 2 avec les pistes 3 et 4). Ainsi, nos résultats montrent que les deux analogues du GTP GTPγS et GMP-PNP favorisent la formation et la libération des vésicules COPII et COPI.

Formation de vésicules COP avec des mutants constitutivement actifs des petites GTPases Sar1 et Arf1

Comme indiqué ci-dessus, des mutants constitutivement actifs des petites GTPases ont été initialement signalés comme favorisant la formation de vésicules COPII et COPI. Cependant, dans des études ultérieures, le mutant actif constitutif Sar1 H79G (incapable d'hydrolyser le GTP) a été signalé comme représentant un inhibiteur dominant négatif du bourgeonnement des vésicules COPII 36, 47. Par conséquent, nous avons analysé une exigence d'hydrolyse du GTP dans la formation de vésicules COP en utilisant des mutants constitutivement actifs des petites GTPases Sar1 et Arf1. En conséquence, les marqueurs de vésicules COPII et COPI sont libérés des cellules semi-intactes dans une mesure similaire, que le type sauvage ou les variantes constitutivement actives Sar1a H79G (figure 3A) ou Arf1 Q71L (figure 3B) aient été utilisées.

En résumé, les marqueurs de vésicules COPII et COPI ont été efficacement libérés des cellules semi-intactes dans des conditions où l'hydrolyse du GTP était bloquée en utilisant soit des analogues de GTP peu hydrolysables, soit des mutants constitutivement actifs des petites GTPases Sar1 et Arf1.

Les vésicules COP sont libérées des membranes du donneur sans manipulation mécanique

La formation de vésicules COP indépendantes de l'hydrolyse du GTP était auparavant attribuée à une manipulation spéciale des échantillons. Un effet de trituration par pipetage répétitif de membranes amorcées suivant les protocoles originaux a été cité pour provoquer cette incohérence 36 . Dans les expériences décrites ici, aucune de ces étapes de trituration n'est incluse. Afin d'exclure la possibilité que la centrifugation puisse exercer des forces de cisaillement suffisamment fortes pour libérer les vésicules revêtues, nous avons effectué le test de reconstitution des vésicules comme suit. Après 30 min d'incubation à 30°C, les échantillons ont été conservés sur de la glace pendant 30 min supplémentaires pour permettre la sédimentation par gravité des cellules semi-intactes, donnant un culot pelucheux. Les surnageants des sédimentations sans centrifugation ont été soigneusement collectés et par la suite les vésicules ont été récoltées par centrifugation différentielle pour éliminer tous les restes de cellules non sédimentées. Les fractions de vésicules ont été analysées par Western blot pour la présence de marqueurs membranaires des vésicules comme décrit précédemment. Également dans ces conditions, une libération efficace de marqueurs membranaires vésiculaires pour les deux types de vésicules a été observée sans aucune exigence d'hydrolyse du GTP (figure 4). Des marqueurs de membrane vésiculaire ont été obtenus en des quantités similaires à celles obtenues sur les figures 1 à 3 (figure 4). Comme plus de 95 % des cellules semi-intactes ont été éliminées par sédimentation par gravité, la génération des vésicules par cisaillement des quelques cellules semi-intactes non sédimentées peut être exclue. Ainsi, l'incubation de cellules semi-intactes avec des protéines d'enveloppe et des guanine nucléoside triphosphates est suffisante pour libérer des marqueurs pour les vésicules COPII et COPI dans le surnageant sans nécessiter de manipulation mécanique supplémentaire.

Titrage des protéines d'enveloppe COPII et COPI

Pour tester si la concentration de protéines d'enveloppe utilisée dans le test de reconstitution aurait un effet sur la formation de vésicules et pourrait éventuellement masquer une exigence d'hydrolyse du GTP, nous avons titré les protéines d'enveloppe COPII et COPI à une concentration constante des petites GTPases Sar1a et Arf1. . Les fractions de vésicules ont été préparées et analysées comme décrit pour la figure 1-3. En conséquence, le rapport de vésicules obtenu avec le GTP ou l'analogue peu hydrolysable GTPγS n'est pas affecté par les concentrations des protéines d'enveloppe étudiées (Figure 5, et voir Renseignements à l'appui). Ainsi, les vésicules sont libérées indépendamment de l'hydrolyse du GTP et non en raison de l'ajout de composants de revêtement en excès à des niveaux non physiologiques.

Analyse des membranes libérées des cellules semi-intactes

Afin de caractériser davantage les fractions membranaires libérées des cellules semi-intactes, nous les avons analysées soit par Western blot pour la présence de la couche de vésicule respective, soit par microscopie électronique. À cette fin, des échantillons des analyses de cellules semi-intactes décrites ci-dessus ont été séparés des membranes du donneur par centrifugation à vitesse moyenne et déposés sur un coussin de saccharose à 37 % (p/v) pour séparer les vésicules enrobées des protéines d'enveloppe solubles en excès par ultracentrifugation. . Les pastilles ont été analysées par Western blot pour la présence de la couche COPII interne (Sec23) et externe (Sec13) et des marqueurs membranaires vésiculaires ERGIC53 et Sec22b (Figure 6A), et pour les sous-unités COPI δ-COP, β′-COP et le marqueurs de membrane vésiculaire ERGIC53 et p24 (figure 6B).

L'hydrolyse du GTP par Sar1 déclenche le désassemblage de la couche COPII 50 . De manière cohérente, les signaux dépendant des nucléotides pour le revêtement COPII et les marqueurs de membrane vésiculaire n'ont été obtenus que lorsque les analogues de GTP faiblement hydrolysables GTPγS ou GMP-PNP ont été utilisés. En revanche, des signaux pour les marqueurs de coatomer et de membrane vésiculaire ont été détectés dans la fraction de culot indépendamment du fait que GTP, GTPγS ou GMP-PNP aient été utilisés, indiquant que les vésicules COPI sont restées recouvertes dans les conditions appliquées.

Pour l'analyse ultrastructurale, les membranes libérées ont été enrobées de résine, sectionnées et examinées par microscopie électronique à transmission. Des structures vésiculaires enrobées d'une taille comprise entre 60 et 100 nm ont été observées pour les reconstitutions COPII ou COPI, quel que soit le dérivé de guanine nucléoside triphosphate utilisé (figure 6C).


Les invaginations de la membrane tubulaire recouvertes d'anneaux de dynamine sont induites par le GTP-γS dans les terminaisons nerveuses.

Les mécanismes par lesquels les membranes des vésicules synaptiques sont réinternalisées après exocytose restent un sujet de débat. Étant donné que plusieurs étapes de transport vésiculaire nécessitent l'hydrolyse du GTP, le GTP-gamma S peut aider à identifier les intermédiaires dans le recyclage des vésicules synaptiques. Dans les terminaisons nerveuses traitées au GTP-gamma S, nous avons observé des invaginations tubulaires du plasmalemme qui étaient souvent, mais pas toujours, coiffées d'un bourgeon recouvert de clathrine. Étonnamment, les parois de ces tubules étaient décorées par des anneaux transversaux denses aux électrons qui étaient morphologiquement similaires aux structures formées par la dynamine autour de gabarits tubulaires. La dynamine est une GTPase impliquée dans l'endocytose des vésicules synaptiques et nous montrons ici que les parois de ces tubules membraneux, mais pas leurs extrémités distales, étaient positives pour l'immunoréactivité de la dynamine. Ces résultats démontrent que la dynamine et la clathrine agissent à différents sites dans la formation des vésicules endocytiques. Ils soutiennent fortement un rôle de la dynamine dans la réaction de fission et suggèrent que la stabilisation de la conformation liée au GTP de la dynamine conduit à la formation de tubules par allongement progressif de la tige de la vésicule. Suite. »

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Contractions dépendantes et indépendantes du calcium dans les muscles lisses

Cette revue examine les voies de transduction du signal médiant la contraction induite par l'agoniste du muscle circulaire dans le corps de l'œsophage et dans le sphincter inférieur de l'œsophage (LES). Dans le SIO, les agonistes du muscle circulaire activent une voie contractile bien définie, impliquant l'activation induite par le calcium (Ca 2+ ) de la calmoduline et de la myosine kinase, provoquant la phosphorylation des chaînes légères de myosine (MLC) de 20 kDa et la contraction. Dans cette voie, la phosphorylation et la contraction peuvent être modulées par d'autres facteurs, entraînant, par exemple, l'inhibition de l'activité de la phosphatase, ce qui peut potentialiser la phosphorylation de la MLC. La voie contractile activée par l'agoniste du muscle circulaire du corps œsophagien n'est pas aussi bien définie, et elle est différente de la voie contractile du LES, car elle dépend de l'activation d'une protéine kinase C (PKC) indépendante du Ca 2+, PKC- . Dans cette voie, l'afflux et/ou la libération de Ca 2+ induits par l'agoniste activent les phospholipases pour produire des seconds messagers, tels que le diacylglycérol et l'acide arachidonique. Les seconds messagers, cependant, activent une PKC-ϵ et une voie contractile, qui est indépendante du Ca 2+. Cette voie contractile dépend de l'activation des MAP kinases ERK1 et ERK2 et de la p38 MAP kinase. Ces kinases sont, à leur tour, liées à la petite protéine de choc thermique HSP27, à la kinase liée à l'intégrine, et peut-être à d'autres kinases Ca 2+ indépendantes, telles que la zipper kinase capable de produire une phosphorylation et une contraction MLC.


Le GTP-γS (GTP gamma S) se lie-t-il à toutes les protéines liant le GTP ? - La biologie

Le rôle de la sensibilisation au Ca 2+ dans la contraction du muscle lisse urinaire de la vessie humaine (MBSB) a été étudié.

Matériaux et méthodes:

Mesures simultanées de la concentration intracellulaire de Ca 2+ ([Ca 2+ ]je) et la tension dans des bandes intactes chargées de fura-2 et des bandes couplées à des récepteurs perméabilisées avec de la -toxine ont été appliquées. Les expressions protéiques ont été confirmées par analyse Western blot.

Résultats:

Dans les bandes intactes chargées de fura-2, 1 M de carbachol (CCh) a induit une plus grande contraction et une plus faible [Ca 2+ ]je élévation supérieure à celle induite par une dépolarisation de 60 mM K +. Dans les bandes perméabilisées à la -toxine, 1 M de CCh a induit une contraction à [Ca 2+ ] constantje et produit un décalage vers la gauche dans le [Ca 2+ ]je-relation de tension. Les protéines RhoA, Rho-associated kinase (ROCK) I, ROCK II et CPI-17 ont été exprimées dans l'UBSM humaine. Dans des bandes intactes chargées de fura-2, l'application de 3 M de Y-27632, un inhibiteur de ROCK, ou de 3 M de bisindolylmaléimide I (GF109203X), un inhibiteur de protéine kinase C, pendant la phase soutenue de contraction induite par 1 M de relaxation induite par CCh sans modification [Ca 2+ ]je. Dans les bandes perméabilisées à la -toxine, l'application de 3 M de Y-27632 ou de 3 M de GF109203X pendant la contraction soutenue induite par 0,3 M de Ca 2+ plus 10 M de guanosine triphosphate et 1 M de CCh a induit une relaxation à [Ca 2+ ] constant.je.

Conclusion :

Ces résultats indiquent que chez l'homme UBSM CCh induit une contraction, non seulement en augmentant [Ca 2+ ]je, mais aussi en augmentant la sensibilité au Ca 2+ de l'appareil contractile de manière dépendante de ROCK et de la protéine kinase C. L'antagonisme des voies de sensibilisation au Ca 2+ peut représenter une cible alternative dans le traitement de l'hyperactivité vésicale.


Résultats

Expression CFTR au niveau des synapses putatives

Nous avons démontré que l'expression et la fonction de CFTR sont nécessaires pour le NOdrCl [7]. Nous avons commencé ici par tester si la protéine CFTR était localisée dans les mêmes régions de la cellule que SV2, une protéine marqueur des vésicules synaptiques. Dans les AC cultivées, le marquage des anticorps anti-CFTR chevauchait des populations de vésicules marquées avec SV2. Un co-marquage a été observé sur des sites de contact étendu avec le processus, ce qui peut indiquer des sites synaptiques. (Fig. 1). La valeur R de Pearson de 48 régions d'intérêt dans les processus cellulaires amacrines était de 0,38 ± 15 (p<0,0001) indiquant une corrélation positive pour l'expression de CFTR et SV2. Cette co-localisation suggère que CFTR pourrait être exprimé sur les SV. Ces résultats sont cohérents avec la possibilité que le NOdrCl via l'activité CFTR sur les SV puisse contribuer à l'élévation du Cl- cytosolique.

UNE, L'anticorps polyclonal anti-CFTR marque les corps et les processus cellulaires amacrines rétiniens. Les flèches indiquent une région où plusieurs processus AC sont en contact, éventuellement une région synaptique (flèches). B, Le marquage Anti-SV2 est présent dans toutes les cellules mais est particulièrement fort dans les régions de contact avec le processus (flèches). C, Les images fusionnées du marquage CFTR et SV2 montrent une forte co-localisation dans la région de contact du processus. Les barres d'échelle sont de 10 um.

L'activation des canaux Ca 2+ voltage-dépendants favorise l'endocytose

Pour tester le rôle des SV dans la libération de NOdrCl, nous avons cherché à stimuler le cycle des vésicules synaptiques via la dépolarisation dans des conditions de contrôle et en présence d'inhibiteurs de l'endocytose dynamine-dépendante. Nous avons émis l'hypothèse que l'inhibition de l'endocytose dans ces conditions épuiserait préférentiellement les pools de vésicules présynaptiques et nous permettrait de déterminer la contribution des SV à NOdrCl. L'exocytose des vésicules synaptiques et l'endocytose subséquente ont été obtenues en activant les canaux Ca 2+ voltage-dépendants. Les canaux Ca 2+ voltage-dépendants exprimés dans les AC cultivés qui médient la libération des neurotransmetteurs sont principalement de type L [43] et sont sensibles à l'inactivation dépendante du Ca 2+ [44]. Des enregistrements de plaques perforées ont été réalisés pour préserver l'environnement cytosolique de l'exocytose dépendante du Ca 2+. Nous avons constaté que lorsque les pas de tension de 100 millisecondes de -70 mV à +10 mV étaient séparés de 3 secondes, les effets de l'inactivation dépendante du Ca 2+ étaient minimisés (figure 2A). Pour vérifier que le cycle SV était stimulé efficacement, nous avons délivré les voltage-steps en présence de FM1-43, un tracker d'endocytose [45]. Des augmentations de la fluorescence FM1-43 dans les corps cellulaires et les processus ont été observées, indiquant que le cycle SV était effectivement activé et que les étapes de tension favorisaient l'endocytose dans toute la cellule (Fig. 2B-2D). (% de variation de fluorescence moyen dans les corps cellulaires : contrôle, 21,9 ± 4,3, stimulé, 41 ± 10,9 processus : contrôle, 11,4 ± 1,8, stimulé, 24,1 ± 4,2, figure 3E).

UNE, Enregistrement de patch perforé à partir d'un AC représentatif. La tension a été échelonnée de -70 mV à +10 mV pendant 100 ms et délivrée 15 fois avec un délai de 3 secondes entre les étapes. Les courants résultant des 15 échelons de tension sont affichés. (En bas) Les barres d'échelle sont de 100 pA et 50 ms. B, Un autre AC en cours d'enregistrement dans la configuration du patch perforé. C, Les cellules ont été exposées au colorant lipophile FM1-43 (4 M) pendant deux minutes puis imagées pour établir un contrôle de base. , Une image après la série d'étapes de tension. Le marquage peut être observé dans le corps cellulaire et dans les processus. Les barres d'échelle sont de 15 um. E, % de variation de fluorescence moyenne ± SD. (test t apparié : corps cellulaires n = 6, p < .05 processus n = 8, p < .05).

UN D, Pourcentage moyen de changement de fluorescence pour les corps cellulaires et les processus pour chacun des inhibiteurs de dynamine testés. Dynasore (mais pas les autres inhibiteurs) a augmenté la fluorescence de base de telle sorte qu'après les étapes de tension, la fluorescence de FM1-43 était inférieure aux valeurs de contrôle donnant lieu à un changement en pourcentage négatif de fluorescence. (Corps cellulaires : contrôle n = 6 dynasore n = 6, p < 0,0001 Dyngo 4a n = 10, p < 0,0001 Dynole 34–2 n = 10, p < 0,0001 MiTMAB n = 6, p < 0,0001. Processus : contrôle n = 6 dynasore n = 12, p < 0,0001, Dyngo 4a (30 M), n = 12, p < 0,0001 Dynole 34–2 (10 M) n = 10, p < 0,0001 MiTMAB (30 M) n = 12, p < 0,0001, non apparié t-essais).

Les inhibiteurs de la dynamine suppriment le marquage FM1-43 dépendant de l'activité

Pour explorer le rôle des SV dans le NOdrCl, les effets de dynasore [37, 46], Dyngo 4a [38], Dynole 34-2 [39] et MiTMAB [40, 47] ont été examinés. L'efficacité de chacun de ces réactifs pharmacologiques en tant qu'inhibiteurs endocytaires a été évaluée en testant les effets de chaque inhibiteur sur le marquage voltage-dépendant avec FM1-43. Les AC ont été enregistrés dans la configuration des patchs perforés. Des images de contrôle ont été capturées avant les étapes de tension, mais après 2 min d'exposition à la fois à FM1-43 et à un inhibiteur de dynamine. Les images ont été prises à nouveau après les paliers de tension à +10 mV (15 paliers, 100 ms) en présence de dynasore (80 M), Dyngo 4a (30 M), Dynole 34-2 (10 M) ou MiTMAB (30 M). Tous les inhibiteurs ont été efficaces pour supprimer l'accumulation de fluorescence FM1-43 après les étapes de tension (Fig. 3A–3D) Corps cellulaires Dynasore : contrôle 81,3 ± 1,2 %, stimulé -14,3 ± 2,7 % Processus Dynasore 79,3 ± 5,1 %, stimulé -8,9 ± 2,9 % Corps cellulaires Dyngo 4a : contrôle 57,2 ± 15,8 %, stimulés 1,02 ± 0,5 % Contrôle des processus Dyngo 4a 65,9 ± 13,9 %, stimulés 4,7 ± 7,3 % Corps cellulaires Dynole 34–2 : contrôle 75,1 ± 3,2 %, stimulés 56,5 ± 4,0 % Dynole 34–2 processus 69,8 ± 2,5 %, stimulés 39,6 ± 2,2 % Corps cellulaires MiTMAB : contrôle 78,9 ± 7,2 %, stimulés 15,1 ± 3,0 % Contrôle des processus MiTMAB 80,3 ± 8,9 %, stimulés 13,2 ± 2,6 %). Les images de fluorescence de contrôle des AC exposés au dynasore étaient, en moyenne, plus lumineuses avant les étapes de tension suggérant un niveau plus élevé d'endocytose constitutive dans dynasore et générant une perte nette de fluorescence après les étapes de tension (Fig 3A).

Les échelons de tension à eux seuls peuvent réduire le pool de vésicules synaptiques

D'après les expériences FM1-43, nous savons que les étapes de tension (15 étapes, -70 mV à +10 mV pendant 100 ms) étaient suffisantes pour stimuler l'exocytose et l'endocytose ultérieure. Pour déterminer si ce même protocole d'étape de tension était efficace pour épuiser les SV en l'absence d'inhibition de l'endocytose, nous avons examiné les réponses postsynaptiques des AC avant et après les étapes de tension seules. Les AC en culture font des synapses avec d'autres AC. Lorsqu'elles sont isolées, elles peuvent également former des autapses (Fig 4A). Pour examiner si des étapes de tension répétées peuvent épuiser les SV, nous avons testé les courants autaptiques avant et après le protocole d'étape de tension décrit dans la figure 2A. La livraison de ces étapes de tension entraîne une réduction des courants autaptiques par rapport au contrôle (Fig 4B et 4C). Pendant l'étape de tension jusqu'à +10 mV, les courants Ca 2+ dépendants de la tension vers l'intérieur et les courants synaptiques vers l'extérieur se contaminent, de sorte que les courants synaptiques ont été quantifiés de la fin de l'étape de tension à la fin de l'enregistrement (Fig 4D). (Transfert de charge moyen (pC). Contrôle 247,9 ± 46,5 pC Post étapes 203,3 ± 19,1 pC). Ces données indiquent que les échelons de tension à eux seuls peuvent épuiser partiellement les SV.

Les échelons de tension à eux seuls peuvent réduire le pool SV aux arrêts. UNE, Une représentation d'un AC avec une synapse autaptique. B, Les synapses autaptiques sont activées par un seul pas de tension de 100 ms de -70 mV à +10 mV dans la configuration de patch perforé. Les courants autaptiques sortants pendant l'étape de tension jusqu'à +10 mv sont contaminés par des courants Ca 2+ dépendants de la tension entrants. La contamination par le courant d'échange électrogénique Na/Ca entrant après l'étape de tension est supprimée en remplaçant le Na + extracellulaire par du Li + . Le temps total d'exposition au Li + est de 4 secondes (barre noire). Après 15 pas de tension, la phase asynchrone de transmission synaptique est réduite (C). Les barres d'échelle sont de 25 pA et 100 ms. RÉ. Le transfert de charge moyen est tracé. (n = 7, p = 0,04, apparié t-test).

Les échelons de tension ne sont pas suffisants bloquer NOdrCl

Étant donné que les étapes de tension peuvent apparemment stimuler suffisamment d'exocytose pour réduire le pool de SV, nous avons testé si les étapes de tension à elles seules étaient suffisantes pour bloquer NOdrCl. Pour évaluer les effets du protocole de pas de tension sur le NOdrCl, nous avons combiné un protocole de rampe de tension pour mesurer Etour-GABA avec le protocole d'étape de tension d'activation de canal Ca 2+ voltage-dépendant pour initier le cycle des vésicules synaptiques (Fig 5A). Le protocole d'étape de tension seul n'a pas affecté le NOdrCl. (Décalage moyen induit par le NO (mV). Contrôle 21,3 ± 6,1 mV Post étapes 24,7 ± 8,2 mV) (Fig. 5B-5D). Prises ensemble, ces données suggèrent que bien que les paliers de tension puissent réduire le pool SV, cela seul n'est pas suffisant pour bloquer le NOdrCl.

UNE, Schéma du protocole de rampe de tension. B et C, Les courants provoqués par les rampes de tension en présence de GABA sont tracés à partir d'un courant alternatif enregistré dans la configuration de patch perforé. Ne sont pas représentés les courants de rampe collectés en l'absence de GABA dans le but de soustraire les fuites ou les courants contrôlés par GABA en réponse aux rampes de tension collectées avant l'ajout de NO. Dans cette cellule, le NOdrCl est plus important après délivrance des échelons de tension. , En moyenne, cependant, il n'y avait pas de différence significative dans l'amplitude du décalage avant et après les étapes de tension (n = 11, p = 0,6, test t apparié).

Certains inhibiteurs de la dynamine bloquent le NOdrCl

Pour déterminer si l'inhibition de l'endocytose avec des inhibiteurs de la dynamine affecterait le NOdrCl, des courants de rampe dépendants du GABA ont été mesurés avant et après les étapes de tension dans des conditions de contrôle et en présence de l'un des quatre inhibiteurs. Dynasore et MitMAB ont été appliqués de manière aiguë (Fig 6A). Dans des conditions de contrôle, le NOdrCl a été observé (Fig 6C). Le NOdrCl a également été observé dans des expériences de contrôle lorsque du DMSO seul a été perfusé sur des cellules (non montré, 30,1 ± 19,2 mV). Cependant, le NOdrCl ne s'est pas produit lorsque les étapes de tension et les rampes de tension ultérieures ont été délivrées en présence de dynasore (80 M, Fig 6D, 6E et 6I). Les effets de dynasore étaient partiellement réversibles (figure 6E, décalages moyens induits par le NO dans Etour-GABA, dynasore : contrôle 32,9 ± 4,6 mV, dynasore post étapes 0 ± 0 mV). Lorsque les AC ont été exposés à MiTMAB (30 M) pendant les étapes de tension et les rampes de tension ultérieures, le NOdrCl a persisté (Fig 6F et 6I) MiTMAB : contrôle 30,3 ± 11,6 mV, MiTMAB après étapes 29,9 ± 7,1 mV).

UNE et B, Schémas des protocoles expérimentaux dynasore (80 M) et MiTMAB (30 M) (exposition aiguë) et Dyngo 4a (30 M) et Dynole 34-2 (10 M) (20 min de pré-incubation), respectivement. Ne sont pas représentés les courants de rampe collectés en l'absence de GABA dans le but de soustraire les fuites ou les courants contrôlés par GABA en réponse aux rampes de tension collectées avant l'ajout de NO. C. Courants de rampe enregistrés à partir d'un courant alternatif dans la configuration de patch perforé avant et après (trace rouge) exposition au NO. RÉ. Données de la même cellule que dans C après exposition au dynasore. E. Etour-GABA pour une cellule différente est tracée au fil du temps, et montre que le décalage dépendant du NO dans Erev-GABA peut être inversé. F. Les courants GABA-dépendants en réponse aux rampes de tension sont indiqués pour un courant alternatif représentatif exposé à MiTMAB révèlent que cet inhibiteur ne bloque pas le décalage NO-dépendant dans Etour-GABA. G. Les données tracées ont été enregistrées après le protocole de pas de tension et en présence de Dyngo 4a. Ces données montrent qu'aucun décalage ne s'est produit après AUCUNE application (trace rouge). H. EGABA est tracée au cours du temps de l'expérience pour la même cellule comme indiqué dans G.I. Quantifié signifie ± SD les déplacements induits par le NO de tous les inhibiteurs. (dynasore n = 12, p < 0,0001 Dyngo 4a n = 6, p < 0,0001 MiTMAB n = 5, p = 0,49 Dynole 34–2 n = 7, p = 0,89 non apparié t-tests).

Dyngo 4a et Dynole 34-2 nécessitent généralement une pré-incubation en raison de leurs effets inhibiteurs plus lents sur l'activité de la GTPase [38, 40]. Pour ces expériences, les AC ont été exposés au Dyngo 4a (30 M) ou au Dynole 34-2 (10 M), pendant 20 minutes avant l'enregistrement et les réactifs sont restés tout au long de l'enregistrement (Fig 6B). En présence de Dyngo-4a, mais avant les échelons de tension, l'injection de NO a provoqué un décalage transitoire du potentiel d'inversion du courant GABA-dépendant (Fig 6H). Après les étapes de tension, cependant, Dyngo 4a a bloqué le NOdrCl (Fig 6G, 6H et 6I, Dyngo 4a : contrôle 21,7 ± 4,0 mV, Dyngo 4a post étapes 3,0 ± 2,7 mV). Cette dépendance vis-à-vis des échelons de tension indique qu'une exocytose dépendante du Ca 2+ était nécessaire en même temps que l'inhibiteur. Dynole 34-2 était inefficace pour inhiber le changement de Etour-GABA (Fig 6I, contrôle Dynole 34-2 30,9 ± 19,1 mV Dynole 34-2 post étapes 30,0 ± 11,2 mV).

Les inhibiteurs de la dynamine affectent la signalisation Ca 2+ voltage-dépendante

Bien que dynasore, Dyngo 4a et Dynole 34-2 soient tous connus pour inhiber l'activité GTPase de la dynamine, seuls dynasore et Dyngo 4a ont inhibé le NOdrCl. Des effets hors cible ont été démontrés pour dynasore [48]. Il a été démontré que le dyngo 4a et le Dynole 34-2 sont plus puissants et moins cytotoxiques que le dynasore, cependant, les effets hors cible du Dyngo 4a et du Dynole 34-2 ne sont pas encore connus. Il existe cependant des preuves que MiTMAB peut inhiber les canaux Ca 2+ voltage-dépendants nécessaires à l'exocytose dans les cellules chromaffines surrénales de rat [47].

Pour traiter la possibilité que les inhibiteurs de la dynamine affectaient certains aspects de la signalisation Ca 2+, nous avons effectué des expériences d'imagerie sur des AC chargés avec l'indicateur Ca 2+ Oregon Green 488 BAPTA-1 (OGB) pour étudier les effets de tous les inhibiteurs de la dynamine sur Ca 2+ dépendant de la tension augmente. Dans ces expériences, une solution élevée de K + (50 mM) a été perfusée dans les boîtes de culture pendant 6 secondes pour dépolariser les cellules et activer les canaux Ca 2+ voltage-dépendants. Dyngo 4a, Dynole 34-2, dynasore et MiTMAB ont été appliqués en plus de la dépolarisation K + élevée, et tous ont réduit l'augmentation de la fluorescence de l'OGB (Fig. 7A-7D). (Moyenne F/F0. Contrôle pour dynasore : 1,80 ± 0,04, dynasore 1,73 ± 0,08 Contrôle pour Dyngo 4a 1,7 ± 0,03, Dyngo 4a 1,4 ± 0,1 Contrôle pour MiTMAB 1,75 ± 0,01, MiTMAB 1,59 ± 0,02 Contrôle pour Dynole 34–2 1,55 ± 0,04, Dynole 34–2 1,42 ± 0,03). Bien que Dyngo 4a et Dynole 34-2 aient été appliqués de manière aiguë dans ces cellules, nous avons pré-incubé des cellules séparées dans les inhibiteurs (comme dans la figure 6) et avons également constaté une réduction de la fluorescence de l'OGB par rapport aux cellules témoins non traitées (données non présentées , Moyenne F/F0 ± SD. Control for Dyngo: 1.3 ± 0.05 Dyngo 4a 1.2 ± 0.02 control for Dynole 34–2: 1.55 ± 0.03 Dynole 34–2 1.04 ± 0.02). In some cells, the effect of the inhibitors in high K + were tested before the control depolarization in order to detect any inhibitor-independent effects on the Ca +2 signal amplitude over time. No such effects were observed.

A-D, (Left) Ca 2+ imaging data from OGB 488-loaded (1 μM) ACs. A 50 mM K + -induced depolarization causes an increase in OGB fluorescence, which indicates an increase in [Ca 2+ ]. Acute exposure of dynasore, Dyngo 4a, Dynole 34–2 and MiTMAB all reduce the voltage-dependent Ca 2+ increases. Mean quantified F/F0 ± SD. Data collected from regions of interest (ROIs) in cell bodies. (Control and dynasore, n = 44 p < 0.05 Control and Dyngo n = 56 p < 0.0001 Control and MiTMAB n = 44, p< 0.0001 control and Dynole 34–2, n = 63, p < 0.0001, paired t-tests). E. Schematic of the voltage ramp protocol used to elicit voltage-gated Ca 2+ currents. Cells in the ruptured patch configuration were voltage-clamped at -70 mV for 500 ms. Then the voltage was stepped briefly down to -90 mV, ramped to +50 mV, and then back down to -70 mV. F, Representative voltage-clamp recordings from four representative ACs. Dynasore, Dynole 34–2, and MiTMAB reduce the peak amplitude of the Ca 2+ currents and the effects were at least partially reversible. g, Mean peak amplitudes are plotted for four populations of cells (dynasore n = 6, p<0.01 MiTMAB n = 5, p<0.01 Dynole 34–2 n = 5, p<0.01 Dyngo 4a n = 5, p = 0.5, paired t-tests).

In ACs, voltage-gated L-type Ca 2+ channel activity initiates neurotransmitter release [43, 49, 50]. To examine whether these dynamin inhibitors affect L-type Ca 2+ channel currents, we used voltage ramps to elicit voltage-gated Ca 2+ current (Fig 7E and 7F. Because the amplitude of voltage-gated Ca 2+ currents are variable in these cells, we only tested the acute effects of the inhibitors to allow for “within cell” comparisons. Dynasore, Dynole 34–2 and MiTMAB significantly reduced the peak amplitude of the Ca 2+ current (Mean peak amplitude (pA). Dynasore control -76.0 ± 16.2 pA, dynasore -11.2 ± 20.4 pA Dyngo 4a control -50.5 ± 30.8 pA, Dyngo 4a -60.0 ± 41.9 pA Dynole 34–2 control -130.3 ± 22.6 pA, Dynole 34–2–31.6 ± 6.3 pA MiTMAB control -118.1 ± 19.7 pA. MiTMAB -52.2 ± 2.3 pA) (Fig 7G). The inhibitors did not affect the voltage-dependence of the Ca 2+ current. These data demonstrate that the Ca 2+ channels expressed by ACs can be inhibited by some dynamin inhibitors. We observed that the effects on Ca 2+ currents were more dramatic than the effects on voltage-dependent Ca 2+ elevations, suggesting that Ca 2+ release from stores plays a substantial role in the Ca 2+ elevations.

Actin disrupters do not affect the NOdrCl

In addition to its role in endocytic fission, dynamin interacts with and regulates actin filaments, [51, 52] which has the potential to regulate numerous other cellular functions [53]. Interestingly, F-actin has been shown to directly interact with CFTR [54, 55] and to regulate its function [56]. Thus, a dynasore-mediated disruption in actin filament regulation might also affect the function of CFTR, a key player in NOdrCl. To determine whether disruption of actin regulation underlies the inhibition of NOdrCl by dynamin inhibitors, we employed two actin polymerization disruptors Cytochalasin D [57, 58] and Latrunculin B [59]. ACs were pre-incubated in either Cytochalasin (4μM) or Latrunculin B (4μM) for 45 minutes (Fig 8A) and the inhibitors were present during the recordings. NO-dependent shifts in Erev-GABA persisted in cells pre-treated with the inhibitors. When compared to control cells recorded on the same day, there were no significant difference in the shift amplitudes for ACs recorded in the presence of the inhibitors (Mean NO-induced shift (mV). cytochalasin control 21.5 ± 8.3 mV, cytochalasin D 27.5 ± 17.1 mV latrunculin B control 21.4 ± 4.2 mV, latrunculin B 20.2 ± 1.1 mV) (Fig 8B and 8C). These data suggest that dynasore and Dyngo 4a are not inhibiting the NOdrCl by altering dynamin’s interaction with actin.

Dynamin inhibitors do not block the NOdrCl via disruption of actin. UNE, Cartoon of experimental setup. In control cells, voltage ramps were delivered in the perforated patch configuration before and after injections of NO in normal external solution. Other ACs were pre-treated with either Cytochalasin D (4 μM) or Latrunculin B (4 μM) for at least 45 minutes. B et C, left. Leak-subtracted GABA-gated currents reveal a shift in Erev-GABA after NO (red trace) in ACs recorded in either cytochalasin D (B) or latrunculin B (C). Mean NO-induced shifts ± SD. (Cytochalasin D, n = 7, p = 0.41, Latrunculin B, n = 6, p = 0.43, unpaired t-tests).

GTP-γS does not affect the NOdrCl

If dynasore and Dyngo-4a block the NOdrCl by interfering with the GTPase function of dynamin, then we might be able to mimic the effect with a general inhibitor of GTPase function. GTP-γS is a non-hydrolysable analogue of GTP that can function as a GTPase inhibitor [60]. GTP-γS (4mM) replaced GTP in the ATP regeneration system of the internal solution. With GTP-γS in the pipet, ruptured-patch recordings were only viable for up to about 5 minutes. After gaining access to the cell with GTP-γS in the pipet, the voltage ramp protocol shown in Fig 6A was delivered and the NO-dependent shift in Erev-GABA was observed. This representative trace was collected about 4 minutes after gaining access to the cell. (Fig 9A and 9B) ((Mean NO-induced shifts ± SD. Control: 16 ± 4.0 mV. GTP-γS: 16.1 ± 5.3 mV, unpaired t-test).

UNE. In the ruptured patch configuration, GTP-γS (4 mM) replaced GTP in the ATP regeneration system to function as a general GTPase inhibitor. About 4 minutes after gaining access to the cell, voltage ramps were delivered before and after injections of NO and the NO-dependent shift in Erev-GABA was still observed. B. Mean NO-induced shifts ± SD (Unpaired t-test: control n = 7, GTP-γS n = 7, p = 0.98). C. In separate cells, voltage ramps were delivered before and after injections of NO 4 minutes after rupturing the patch. Then voltage steps were delivered to stimulate exo- and endocytosis, followed by another set of voltage ramps and NO. The NO-dependent shift in Erev-GABA remained. RÉ. Erev-GABA is plotted over the time course of the experiment for the cell shown in C. E. Mean NO-induced shifts ± SD. (n = 3, p = 0.4, paired t-test).

The effects of GTP-γS were also tested under conditions of active exocytosis and endocytosis. Voltage ramps in the presence of GABA were delivered before and after injections of NO, followed by the voltage step protocol previously described, and then the ability of NO to shift Erev-GABA was re-tested. At least on this time frame (about 5 minutes total time since gaining electrical access to the cell), GTP-γS did not block the NO-dependent shift in Erev-GABA. (Fig 9C–9E) (Mean NO-induced shift ± SD. Control: 10.2 ± 0.9 mV. Post Steps 11.7 ± 1.2 mV). Recordings were also made in the ruptured patch configuration using a GTP-free internal solution and the NOdrCl was not blocked (data not shown, 20.1 ± 2.5 mV). Due to the limited duration of the recordings in these experiments, the possibility remains that GTP-γS may have incompletely filled the neuronal processes. These data, however, do raise the possibility that dynasore and Dyngo-4a, both of which are thought to function via GTPase inhibition, are inhibiting endocytosis and the NOdrCl by some other mechanism.

Dynasore affects neurotransmitter release from ACs

Dynasore has been shown to increase the probability of evoked transmitter release at the frog NMJ and to increase spontaneous synaptic event frequency in the nucleus of the solitary tract (NTS) neurons [61, 62]. If dynasore similarly affects presynaptic function in ACs, then this might contribute to the inhibitory effect of dynasore on the NOdrCl. To determine whether AC synaptic exocytosis was altered by dynasore, we tested its effects on autaptic currents (Fig 10A–10C). Dynasore increased the asynchronous postsynaptic currents (Fig 10D). (Mean charge transfer ± SD. Control 245.1 ± 35.9 pC dynasore post steps 464.9 ± 107.2 pC) indicating that dynasore promotes synaptic exocytosis from ACs.

UNE, A depiction of an AC in with an autaptic synapse. B, Autaptic synapses are activated by a single 100 msec voltage step from -70 mV to +10 mV recorded in the perforated patch configuration. Autaptic currents during the voltage step are contaminated with the voltage-gated Ca 2+ currents. Contamination from the electrogenic inward Na/Ca exchange current after the voltage step is removed by replacing extracellular Na + with Li + . The total time of exposure to Li + is 4 seconds (black bar). C, After 15 voltage steps in the presence of dynasore, autaptic currents reveal enhanced neurotransmitter release. RÉ, Mean charge transfer ± SD. (n = 6, p = .0063, paired t-test).

Pitstop 2 inhibits the NOdrCl

The effects of dynasore and Dyngo 4a on the NOdrCl are consistent with a role for SVs as a releasable source of Cl - . However, the additional effects of these compounds that we describe here as well as the inability of GTPγS to mimic the effects of dynasore and Dyngo 4a make a conclusion difficult to draw. Therefore, we sought to inhibit endocytosis by an alternative mechanism. Pitstop 2 has been thought to inhibit the interactions between clathrin and adapter proteins that are required for clathrin coat assembly [63] although it has been demonstrated to inhibit clathrin-independent endocytosis as well [64]. To determine whether Pitstop 2 was effective in inhibiting endocytosis, we combined this reagent with the voltage and imaging protocol used in Figs 2 and 3. Pitstop 2 inhibited voltage-dependent FM1-43 fluorescence increases (Cell bodies control 61.5 ± 16.6%, Pitstop 2 1.1 ± 0.05% processes control 54.9 ± 15.0%, Pitstop 2 1.1 ± 0.03%,) (Fig 11A). The effectiveness of Pitstop 2 in inhibiting the NOdrCl was tested by repeating the experiment shown in Fig 5A but delivering the voltage steps in the presence of Pitstop 2 rather than the dynamin inhibitors (Fig 11B). Pitstop 2 inhibited the NOdrCl by about 50% (Mean NO-induced shift in EGABA ± SD. Control: 19.3 ± 2.0 mV Pitstop 2: 8.1 ± 1.3 mV) (Fig 11C–11E). The ability of another endocytosis inhibitor that functions by a completely different mechanism suggests that depletion of the SV pool reduces the sources of Cl - during NOdrCl.

UNE. Mean percent fluorescence change for cell bodies and processes in the presence of Pitstop 2 (20 μm). The clathrin inhibitor reduces voltage-dependent FM1-43 fluroescence increases, indicating that it is an effective SV inhibitor (cell bodies, n = 9, p<0.0001 processes, n = 18, p<0.0001, unpaired t-test). B. Schematic of voltage ramp experiment. ACs were recorded in the perforated patch configuration. C. et RÉ.Representative trace of EGABA measurements before and after voltage steps in the presence of Pitstop 2. E. Mean NO-induced shifts ± SD. Pitstop 2 reduces the NOdrCl. (n = 7, p<0.0001, paired t-tests).


Cells and reagents

OK PTC-derived cells were propagated and differentiated for 4 days into well-polarized monolayers as described 38 . The 4-day interval was essential to achieve optimal polarity and high megalin expression. OK cells were grown at 37°C under 5% CO2 in DMEM F-12 supplemented by 5 m m HEPES, 66 µg/mL penicillin, 10 µg/mL streptomycin and 10% (v/v) FCS (all from Gibco-Invitrogen). Cells were transfected at day 1 of plating with expression vectors for EGFP-C2-2XFYVE (Hrs) (Dr. A. Wandinger-Ness, University of New Mexico HSC, Albuquerque, NM, USA 66 ), EYFP-Rab5wt (Dr. C. Bucci, University of Salento, Lecce, Italia), GFP-Rab11wt (Dr. M. Zerial, Max-Planck Institute, Dresden, Germany 67 ) and dynamin2-GFP (Dr. S. Schmid, Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA). Cathepsin B, LY294002, LY303511, Dynasore, nocodazole and latrunculin B were from Calbiochem. Wortmannin, Lucifer Yellow and insulin were from Sigma. ZSTK474, anti-Akt and anti-phosphoAkt antibodies were from Professor Louis Hue. Dyngo4a was kindly provided by Dr. P. Robinson (Cell Signalling Unit, Children's Medical Research Institute, Westmead, Australia). Cathepsin B was radioiodinated with 125 I (Amersham) in precoated iodination tubes (Pierce) to 7000–14 000 Bq/mole, and generally used at >95% precipitability in trichloro-acetic acid. Sulfo-NHS-Biotin and streptavidin-agarose were from Pierce. Alexa488-albumin, TexasRed-albumin, Alexa568-dextran (10 kDa, anionic & fixable), Lysotracker Red DND-99, Lipofectamine2000 and OptiMEM I medium were from Invitrogen. Sheep anti-megalin antibodies were generous gifts of Drs. P. Verroust and R. Kozyraki (INSERM U538, Paris, France) 68 . Anti-LAMP-1 rat monoclonal antibody was from Hybridoma bank (Iowa, IA, USA).

Polarized cell culture, pharmacological treatment and transient transfection

For measurements of endocytic uptake, subcellular fractionation and surface biotinylation, cells were seeded at high density (∼50 000 cells/cm 2 ) on Petri dishes, cultured for 4 days at 37°C and fed every day with fresh medium (final, ∼800 µg cell protein/dish). For morphology, cells were seeded on Lab-Tek chambers (transient transfection and vital imaging) or on a porous membrane (immunofluorescence on fixed cells, 0.4-µm pore size Transwell, Costar) with identical density and culture conditions. For transient transfection, cells were cultivated in antibiotic-free medium for 24 h prior to transfection with plasmids using Lipofectamine2000 in serum-free OptiMEM I medium at 37°C for 6 h. EGFP-C2-2XFYVE was used at low concentration (0.4 µg/mL) for recruitment experiments or at high concentration (1.6 µg/mL) for morphometry. Transfection medium was then replaced by usual culture medium and cells were further cultured during 3 days prior to experiments. Cells were pretreated for 30 min with 200 n m wortmannin, 100 µ m LY294002 or LY303511, 10 µ m ZSTK474, 30 µ m Dynasore or Dyngo4a in DMSO (0.1% maximal final concentration or DMSO alone for vehicle control), then reincubated in the continued presence of the inhibitors or solvent with tracers of receptor-mediated endocytosis (2 n m 125 I-cathepsin B, 0.5 µ m fluorescent albumin, close to Kd) or fluid-phase endocytosis (20 µ m fluorescent dextran or 0.5 m m fluorescent albumin) at 37°C for 30 min. The few deviations from this usual protocol are indicated as appropriate.

Fluid-phase and receptor-mediated endocytosis assays

Polarized cells were preincubated with serum-free DMEM for 30 min to remove megalin ligands, pretreated with inhibitors or vehicle for 30 min and directly incubated with 1 mg/mL Lucifer Yellow at 37°C for 30 min (fluid-phase endocytosis), or allowed to bind 2 n m 125 I-cathepsinB at 4°C for 1 h then reincubated at 37°C for 30 min or during indicated times (receptor-mediated endocytosis) in the continued presence of inhibitors or vehicle. Cells were extensively washed and surface-digested with 1.5 mg/mL pronase (Sigma) for 1 h at 4°C. Pronase-resistant counts were taken as absolute measurements of internalized ligand and reported to total cell-associated counts without pronase as relative measurements of internalization efficiency [in/(in + on)] pronase-sensitive counts were taken as measurements of surface-bound ligand. Intracellular Lucifer Yellow and 125 I-cathepsinB contents were normalized to the cell protein content (∼13 mg/16 cm 2 dish).

Western blot

Cells were washed three times with PBS and solubilized in lysis buffer (1% Nonidet P-40, 150 m m NaCl, 50 m m Tris–HCl, 1 m m EGTA, 1 m m Na3VO4, 1 m m NaF, and Complete protease inhibitors, Roche). Proteins were resolved by 7% SDS–PAGE. Blots were labeled with anti-megalin sheep pAb (1:5000) or anti-cathepsin D (1:200, Santa-Cruz) then HRP-labeled goat anti-sheep pAb (1:100 000), EEA1 mouse pAb (1:500) then HRP-labeled goat anti-mouse pAb (1:100 000) or phospho-Akt/total Akt rabbit pAb (1:2000) then HRP-labeled goat anti-rabbit pAb (1:100 000) and revealed by chemiluminescence (ECL kit, Perkin Elmer) using Kodak X-omat blue films, scanned at high resolution (Agfa SNAPscan 600) and quantified using Scion software. Results were expressed as percentages of controls.

Surface biotinylation

OK cells were polarized on 60-cm 2 Petri dishes for 2 days then serum-starved for 4 days to maximize megalin expression 38 . After treatment or not with 100 µ m LY294002 for 30 min, cells were chased without LY294002 for increasing intervals, rapidly cooled down to 4°C by chilled PBS, then surface-biotinylated by incubation with 1.5 mg/mL sulfo-NHS-biotin in 10 m m triethanolamine, pH 8.0, on a horizontal shaker at 4°C for 2 h. Plates were washed thrice with PBS/0.1% BSA, then quenched with PBS enriched in 6 m m K + , 6 m m Ca 2+ and 6 m m Mg 2+ and supplemented by 100 m m glycine for 40 min at 4°C. Cells were lysed with RIPA buffer containing protease inhibitors on a horizontal shaker at 4°C for 1 h, and lysates were cleared by centrifugation at 13 000 × g at 4°C for 20 min. Fifty microliter of the cleared lysates were immediately diluted in Laemmli buffer and saved for total pool assay. Seven hundred microliter were mixed with the same volume of packed streptavidin-agarose beads incubated overnight with at 4°C under continuous rotation, after which beads were retrieved by pelleting at 13 000 × g at 4°C for 15 min and aliquots of the supernatant was diluted in Laemmli buffer for assay of nonbiotinylated fraction. Beads were extensively washed (twice with RIPA buffer and twice with PBS-K + /Ca 2+ /Mg 2+ ) and biotinylated proteins were eluted in Laemmli buffer with vortexing for 1 min at room temperature. After boiling, beads were removed by pelleting as above. Eluted proteins were resolved by electrophoresis in 5% polyacrylamide gels, analyzed by Western blotting for megalin and quantified as above (biotinylated fraction).

Fluorescence microscopy for OK cells

For initial immunofluorescence experiments, filter inserts were rinsed three times in PBS, fixed with 4% formaldehyde (Merck) for 30 min, permeabilized with 0.05% saponin for 15 min, and quenched for 30 min with Q-PBS (PBS with 0.01% saponin, 2% BSA, 0.1% lysine). Samples were incubated for 1 h with anti-megalin antibodies (1:1000) in Q-PBS, washed, and further incubated with Alexa568-secondary antibodies (1:400) in Q-PBS for 1 h in the dark. Inserts were washed, excised, mounted in Moviol with 2.5% DABCO and examined by confocal microscopy (Axiovert M135, Zeiss, coupled to MRC 1024, Bio-Rad) using a Plan-apochromatic 63x/1.4 oil immersion objective. Images were acquired with Bio-Rad LaserSharp 2000 v.4.3 software with global adjustment of contrast and brightness using Bio-Rad LaserPix v.4.0 and assembled using Corel Graphic Suite 12. For vital imaging, cells were polarized in Lab-Tek glass chambers (Nunc, Roskilde, Denmark) for 4 days as above, with daily medium renewal, briefly rinsed three times with serum-free medium and pretreated with the inhibitors for 30 min as above, loaded for 30 additional min with the endocytic tracers (0.5 µ m Alexa488-albumin/0.2 mg/mL Alexa568-dextran in medium without phenol red), then rapidly examined after a brief rinse or without rinse to fill the apical extracellular space with a LSM 510 META confocal microscope (Zeiss,) equipped with a thermostated chamber set at 37°C using a Plan-Apochromat 63×/1.4 oil objective. For morphometry, images were imported using AxioVision 4.8.1 (Zeiss) in the ZVI format. To avoid measuring the same profile twice, well-separated optical sections (3.6-µm apart) were selected from each stack in the green channel. Objects were selected by thresholding intensity (between 80 and 255) and size (above 10 pixels). The density was measured in the binary images using a predefined mask and the automatic measurement option to secure identical criteria for all images. Data sets were imported as Excel files for statistical analysis and graphic representation.

Conditional Vps34 KO Mice

Mice in which exon 21 was flanked by loxP sites (Vps34-floxed mice) will be described elsewhere (B. Bilanges and B. Vanhaesebroeck, unpublished results). Deletion of exon 21 creates a loss-of-function allele of VPS34 (vps34 KO). Pax8-Cre mice were obtained from M. Busslinger 69 . Vps34 was inactivated by crossing Pax8-CreVps34 flox/+ males with Vps34 flox/flox femelles. At postnatal (P) day 7 or P14, pups were genotyped by standard polymerase chain reaction and their kidneys were dissected for analysis. Mice were raised and treated according to the principles of laboratory animal care of the University Animal Welfare Committee.

Kidney histology and immunofluorescence

Mice kidneys were fixed by immersion in 4% neutral-buffered formaldehyde and processed for paraffin embedding. Seven micrometer-thick sections were stained with hematoxilin and eosin. Images were acquired using a Zeiss Mirax Midi microscope. Confocal immunofluorescence imaging was performed on 7 µm-thick sections as follows. Antigen retrieval was promoted in citrate buffer (Thermo Scientific), at 95°C for 20 min using a Lab Vision Pretreatment Module™ (Thermo Scientific). Tissue was permeabilized with PBS/0.3% Triton-X100 for 5 min, then for a further 1 h with 10% BSA/3% milk to block nonspecific sites. Sections were incubated overnight at 4°C in blocking buffer with sheep anti-megalin (1/1000) and rat anti-lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP-1 1/100). Sections were further incubated with Alexa-secondary antibodies (Invitrogen) for 1 h at room temperature in 10% BSA/0.3% Triton-X100, mounted with Dako Faramount Aqueous Mounting Medium and imaged on a spinning disk confocal microscope using a 100× oil objective (Cell Observer Spinning Disk Zeiss).

Kidney semi-thin plastic sections

Samples were fixed in 4% formaldehyde and 0.1% glutaraldehyde in 0.1 m cacodylate buffer then post-fixed in 1% osmium tetroxide (same buffer) and embedded in Spurr. For light microscopy, 1-µm semi-thin sections were colored with toluidine blue and examined on an inverted microscope (AxioVert 200 m, Zeiss). Ultrastructural studies will be reported elsewhere.

Statistical analyses

The significance of differences was tested using Student's t-test (***p < 0.001 **p < 0.01 *p < 0.05 NS, not significant). Values are presented as means ± SEM.


Exemple 2

Seven cell types were tested (FIG. 1) for the ability to support lipoparticle production. Lipoparticles were prepared as described in above. We also tested dog CF2TH cells (not shown). Since lipoparticle production is a function of the number of cells transfected as well as the health of those cells after transfection, we also tested multiple transfection modalities. Although nearly all cells could be efficiently transfected by at least one technique (FIG. 1B), few produced lipoparticles efficiently (FIG. 1A), likely reflecting a species-specific block in lipoparticle assembly. Murine 3T3 cells (native host for MLV) would likely produce more particles upon transfection optimization. Nevertheless, we identified two cell types, quail QT6 cells and feline CCC cells, that could support moderate amounts of particle production.


From endocytosis to membrane fusion: emerging roles of dynamin in virus entry

Dynamin, a large guanosine triphosphatase (GTPase), has been implicated in virus entry, but its mechanisms of action are controversial. The entry procedure of most enveloped viruses involves endocytosis and membrane fusion. Dynamin has been suggested to act both as a regulatory GTPase by controlling the early stages of clathrin-mediated endocytosis (CME), which is an important endocytic pathway utilized by many viruses, and as a mechanchemical enzyme that induces membrane fission and pinches endocytic vesicles off from the cellular plasma membrane in later stages in several endocytic pathways, including CME. In addition to its involvement in virus endocytosis, dynamin has also been proposed to participate in membrane fusion between the virus and endosomes following endocytosis. Crystal structures and cryo-electron micrography (cryo-EM) have elucidated the structure of dynamin, which led to development of a mechanochemical model of how dynamin-mediated membrane fission occurs. Based on this, we propose a hypothetical model that explains how dynamin facilitates virus membrane fusion and discuss its roles in virus entry.

Remerciements

This work is supported by the grants from the National Basic Research Program of China (973 Program) (Nos. 2010CB530102, 2011CB504703), and by the National Natural Science Foundation of China (NSFC, Grant No. 81021003).


Voir la vidéo: Syötkö riittävästi lihaskasvua ajatellen? (Août 2022).